הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר ההובלה האקסונלית לאחור של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח או BDNF על ידי הדמיה חיה. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של תאים מיקרופלואידיים על פתקי כיסוי מצופים פוליליזין. בשלב השני, חולדה מנותקת E 18 נוירונים בהיפוקמפוס מנותחים ומצופים בתא גוף התא של החדר המיקרופלואידי.

לאחר מכן, הנוירונים מתורבתים כדי לאפשר הרחבה של האקסונים על פני חריצי המיקרו לתוך התא האקסונלי של החדר. בשלב האחרון, נקודה קוונטית המסומנת BDNF מתווספת לתא האקסון. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך את תנועת BDNF בתוך האקסונים של נוירון ההיפוקמפוס.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תיוג דובדבן B-D-F-E-G-I-P, או BDFM הוא שתיוג BDF עם נקודה קוונטית מאפשר הדמיית אור של דימרים BDF בודדים בתוך האקסונים המדגימים את ההליך יהיה, יהיה. צייר נקודת עמוד משלושת השמאליים שלי, התחל בשטיפה ידנית של תאי המיקרופלואידיקה ב-1% aox, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 30 דקות במי מילי Q. לאחר מכן לאחר שטיפת ידיים של התאים באתנול 70%, הניחו אותם לייבוש על פרם במכסה זרימה למינרית, עקרו את שני צידי התאים באור UV למשך 20 דקות, ולאחר מכן אחסן את התאים המוקרנים בכלי סטרילי בגודל 15 סנטימטר אטום בפרם בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, יש להשרות 24 על 40 מילימטר. כיסוי זכוכית מספר אחת מחליק בחומצה הידרוכלורית של 10% למשך הלילה על מסובב ואחריו שלוש שטיפות של 30 דקות במים לאחר הכביסה האחרונה. יש לעקר כל תלוש כיסוי עם טבילה באתנול 100%, ולאחר מכן להבעיר מעל מבער בונסן ולאחסן אותם יבשים בצלחת פטרי סטרילית בטמפרטורת החדר.

כדי לצפות את החלקות הכיסוי, הניחו אותם בתבנית תרבית של 15 ס"מ ואז שכבו כל אחד עם 0.7 מיליליטר של 0.01% פולי ליזין. לאחר דגירה של שעה במכסה המנוע של תרבית הרקמות, יש לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים שוב במים סטריליים ואז לייבש אותם בוואקום ולהניח אותם בכלי תרבית של שישה סנטימטרים. לאחר מכן הנח את אחד התאים המעוקרים כשצד החריץ המיקרו פונה כלפי מטה על החלקת כיסוי מצופה פולי L ליזין.

הקפד לא לגעת בחריצי המיקרו והשתמש בקצה מיקרו פיפטה כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה על החדר ולאטום היטב את התא המיקרופלואידי. כעת הניחו שני חולדות E 17 עד E 18 Hippo Campi לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של מאגר דיסקציה ושטפו את הרקמות שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של מאגר דיסקציה בכל פעם. לאחר מכן הסר כמה שיותר מהכביסה והוסף 900 מיקרוליטר של חיץ חיתוך טרי כדי לעכל את הרקמה.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של 2.5% טריפסין לרקמות והניחו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של עיכול, הוסיפו 100 מיקרוליטר של DNA אחד והשתמשו בפיפטה מזכוכית PE מלוטשת אש כדי לדרג בעדינות את הרקמות למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים מיד לאחר הערבוב. הרוו את הניסיון בשני מיליליטר של מדיום ציפוי והניחו לפסולת להתיישב בתחתית הצינור למשך חמש דקות במכסה המנוע של תרבית הרקמות.

לאחר מכן, העבירו בזהירות שני מיליליטר של סופרנטנט לצינור חרוטי סטרילי נקי של 15 מיליליטר וסובבו את התאים לחיים. השעו את הגלולה ב -50 מיקרוליטר של אמצעי ציפוי, ולאחר מכן לאחר הספירה, טענו 15 עד 20 מיקרוליטר של מתלה התא לתא אחד של החדר המיקרופלואידי. דגרו את החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד להחלקת הכיסוי, ולאחר מכן הוסיפו עוד אמצעי ציפוי כדי למלא את שני התאים של החדר.

לאחר יום אחד של דגירה, החלף את אמצעי הציפוי באמצעי תחזוקה הן בגוף התא והן בתאי האקסון. ביום השלישי, אקסונים מתאי העצב בהיפוקמפוס מתחילים לחצות את החריצים הזעירים ולהגיע לתא האקסונים בין היום החמישי לשביעי. במהלך תקופה זו, החלף מחצית מאמצעי התרבות באמצעי תחזוקה טריים כל 24 עד 48 שעות לפני הדמיה חיה של הובלה אקסונלית BDNF המסומנת קוונטית.

שטפו היטב את שני התאים של החדר המיקרופלואידי, עם מדיה נוירו-בזאלית ללא סרום ללא BDNF כל 30 דקות למשך שעתיים במהלך דלדול ה-BDNF, דגרו 50 ננו מולארי דימר BDNF מונו ביוטיניל עם קוונטום 50 ננו מולארי. בצע 6 5 5 מצומדים חשפניים במדיה נוירו-בזאלית על קרח למשך 60 דקות. לאחר מכן החלף את המדיה בתא האקסון ב-300 מיקרוליטר של נקודה קוונטית המסומנת BDNF למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי למזער את הפיזור של נקודה קוונטית המסומנת BDNF לתא גוף התא.

חשוב מאוד לשמור תמיד על רמה גבוהה יותר של מדיה בתא גוף התא מאשר בתא האקסון בסוף הדגירה, החימום והמיקרוסקופ ההפוך, המצויד במטרת שמן פי 100 ותא סביבתי לטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בזמן שהציוד מתחמם. שטפו את הנקודה הקוונטית הבלתי קשורה המסומנת BDNF מהתא המיקרופלואידי, ולאחר מכן השתמשו בקבוצה של קוביות עירור ופליטה אדומות של טקסס כדי לדמיין את אות הנקודה הקוונטית 6 5 5. לבסוף, השתמש במצלמת CCD כדי לצלם תמונות זמן-lapse בתוך האקסונים האמצעיים במהירות של פריים אחד לשנייה למשך שתי דקות בסך הכל.

השתמש במיקרו חריצים ללא אקסונים שאין להם QD כבקרה לחדירה ונתח את הובלת ה-BDNF באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה בהדמיית זמן-lapse של הובלת אותות BDNF המסומנים בנקודות קוונטיות אותות נקודות קוונטיות נצפים ברוב חריצי המיקרו עם אקסונים, בעוד שלא נראה אות קוונטי בחריצי המיקרו ללא אקסונים המצביע על דיפוזיה מועטה עד ללא דיפוזיה של אות הנקודה הקוונטית מתא האקסונים לתא גוף התא כאן. מקטע באורך 80 מיקרומטר של אקסון נוירון בהיפוקמפוס נרשם באופן פלואורסצנטי במשך 100 שניות. סה"כ שישה.

אותות BDNF קוונטיים צוינו בבירור במהלך ההדמיה כאשר שלושה נצפו נעים באופן חד כיווני לעבר גוף התא. אות אחד נצפה נע בצורה חלקה לגוף התא החוצה את כל השדה תוך כ-70 שניות. אחר נצפה נע בכיוון נסיגה במשך 20 השניות הראשונות, עבר לתנועה אנטרוגרדית למשך 10 עד 20 שניות, ואז שינה כיוון שוב לכיוון גוף התא במשך 20 השניות האחרונות.

האירוע השלישי צוין גם הוא לנוע בכיוון נסיגה, אך לאחר מכן לעצור למשך כ-20 שניות במהלך אמצע התנועה. בגרף פעמון מייצג ראשון זה של הובלת נקודה קוונטית המסומנת BDNF, הנקודה הקוונטית המסומנת BDNF נעה במהירות ובצורה חלקה לעבר גוף התא וחצתה את שדה ה-80 מיקרומטר תוך כ-60 שניות. עם הפסקות קצרות מאוד בכרונוגרף השני הזה, ה-BDNF הקוונטי נע כ-50 מיקרומטר ב-120 שניות בכיוון נסיגה עם לפחות שלושה מקטעים של הפסקות ארוכות יותר.

לבסוף, תרשימי הפיזור מודדים את מהירות התנועה, המהירות הממוצעת וזמן ההשהיה של כל נקודה קוונטית בודדת המסומנת BDNF. מהירויות התנועה של הנקודה הקוונטית המסומנת BDNF היו מהירות יחסית, ונעו בין 0.47 ל-1.97 מיקרומטר לשנייה עם ממוצע של 1.06 פלוס מינוס 0.05 מיקרומטר לשנייה. בגלל שהשהות ה-BDNF במהלך ההובלה, המהירות הממוצעת הייתה נמוכה בהרבה ממהירות התנועה עם ממוצע של 0.48 פלוס מינוס 0.03 מיקרומטר לשנייה עם משך הפסקות ממוצע של 15.88 פלוס מינוס 1.30 שניות לאחר הפיתוח.

הטכניקה הזו מאפשרת לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור נוירוטרופינים וסחר בקולטנים בתאי עצב בריאים וחולים.