ההדמיה confocal זמן הפקיעה הוא אמצעי יעיל להערכת Cytocompatibility מרוכבי שיניים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי תלת מימדי להדמיית זמן-lapse כדי להעריך באופן איכותי וכמותי את התאימות הביולוגית במבחנה של חומרים מרוכבים דנטליים. זה מושג על ידי לקיחת דגימות כדוריות של קומפוזיט דנטלי לא נרפא בשלב השני. פיברובלסטים חניכיים אנושיים מתורבתים בנוכחות או בהיעדר תמציות מרוכבות אלה, ולאחר מכן התאים מסומנים בצביעה חיה מתה.

לאחר מכן נוצרות תמונות מפה של תרביות התאים ותמונות שכבת-על נוצרות עבור אזורי העניין. בסופו של דבר, ניתן לנטר את ההבדלים בזמן אמת בהתנהגות התאים המתרחשים בנוכחות או בהיעדר החומרים המרוכבים שנבדקו בהתאם לשינויים באותות הפלואורסצנטיים הירוקים או האדומים שנצפו בתמונות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הם בכך שהיא מאפשרת ניטור בזמן אמת של תאים חיים מבלי לגרום לשינויים במבנה התא.

אין צורך בשלבי קיבוע או ייבוש לאחר צביעת תאים או לפני תצפית בזמן. להכנת התמצית המרוכבת התחל בשימוש במחזיק מותאם אישית ברדיוס של שני מילימטר ליצירת דגימות כדוריות של החומר המרוכב הדנטלי הלא נרפא. העבירו את הדגימות לבארות בודדות של צלחת שש בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבית, הקפידו להשאיר כמה בארות עם מדיה בלבד לתרביות תאי בקרה, ולאחר מכן סדרו מנורת לד בעוצמה של 1070 מיליוואט סנטימטר רבוע בטווח של 0.5 מילימטרים מהדגימות.

ריפא את הדגימות במשך 40 שניות כדי לדמות את המגע הזמני בין השיניים לחומר המרוכב הדנטלי הלא מטופל, ולאחר מכן דגר את הדגימות המרוכבות למשך 24 שעות באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. החלף את המדיום כל שלושה ימים ותאי מעבר כל חמישה ימים. לאחר מכן, לאחר שהתרבית הגיעה לשטף, קצרו את התאים וסובבו אותם למשך חמש דקות בטמפרטורה של 90 פעמים G ובטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את הגלולה במדיום התרבית, ולאחר מכן לאחר ספירת התאים, זרעו את תרחיף התאים בצפיפות תאים של 2.5 פעמים 10 עד התאים הרביעיים למיליליטר במערכת החלקה תאית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, החלף את המדיה בשתי בארות של מגלשת התא במיליליטר אחד של התמציות המרוכבות שנבדקו, והנח את המגלשה בחזרה לתוך האינקובטור כדי לדמות את התאים על ידי קונפוקל. הדמיה בהילוך מהיר.

ראשית סמן את תאי התרבית והבקרה המרוכבים עם כתם ציטוטוקסיות מת חי לתאים אוקריוטיים בהתאם להוראות היצרן. 15 דקות לאחר הצביעה, הנח את שקופית החדר בחושך בתא המשולב הקונפוקלי בתנאי תרבית תאים וחמם את הלייזרים של 473 ננומטר ו-559 ננומטר. לאחר מכן, השתמש בגלאי עם ספקטרום שפותח לאחרונה כדי להגדיר אוטומטית את תנאי ההדמיה עבור לייזר 473 ננומטר.

השתמש בפונקציות המסגור והזום כדי לבחור את אזור העניין, ולאחר מכן בחר את מצב התצפית. בחר עד חמישה סוגים של מצבי תצפית, כולל זאק זמן-lapse וריבוי אזורים לפי הצורך, ולאחר מכן צלם במהירות חמש תמונות מפה עם לייזר של 473 ננומטר תחת המטרה של פי 10 הן עבור דגימת הבדיקה והן עבור תאי הבקרה כאשר התמונות הרצויות נרכשו. עבור ללייזר 559 ננומטר וצלם תמונות של התא בפלואורסצנט השני כפי שהודגם זה עתה.

לחלופין, שכב על תמונות הפלואורסצנט וניגודיות האור באמצעות הנקודה שנבחרה במסך החי X 60 כדי לצפות במאגר התמונות החיות. תמונות המפה בפורמט תמונת אולימפוס לניתוח אותות ותמונות ההקרנה המקסימליות הן 24 סיביות לפיקסל. לאחר מכן, קובצי TIFF משתמשים בכלי הניתוח השונים כדי למדוד את פרופיל העוצמה של האות ואת יחס העוצמה בין שני ערוצי הפלואורסצנט.

לבסוף, נתח את ההבדלים באיתות התאים הפלואורסצנטיים בין שתי הקבוצות באמצעות התוכנה המתאימה. בתמונות מפה אלה של תאי כתמים חיים של TED במדיה בלבד או שנחשפו לתמצית מרוכבת, לא נצפו הבדלים בכדאיות התאים 15 דקות לתוך פרק הזמן שחלף. כאן, תמונות הקרנה מקסימליות של תאי הבקרה מראות את הגורל המוגדל של התאים בתוך 15 הדקות הראשונות וחמש שעות לאחר מכן בסוף תקופת הזמן כפי שנצפה, לא הייתה שונות משמעותית בקרינה בתוך תאי הבקרה לאורך תקופת הדגירה.

התאים שנחשפו להתכווצות נמוכה במיוחד של ELS הניחו מורפולוגיה דומה של ציר לתאי הביקורת, אך הראו ירידה קלה באות הפלואורסצנטי הירוק ועלייה קלה מאוד בפלואורסצנטיות האדומה בסוף תקופת הזמן. פרופיל העוצמה של התאים המוכתמים מתואר בגרפים אלה שבהם נמדדו עוצמות פליטת הקרינה של אנדותל הסידן הומודימר על תאים חשופים מורכבים במרווחי שעה למשך עד חמש שעות. לא נצפו הבדלים משמעותיים באיתות בין שתי התרבויות.

יחסי הכדאיות עבור תאים מרוכבים של הבקרה והחשופים מוצגים בטבלה. בנוכחות החומר המרוכב שנבדק, נמצא כי אחוז התאים החיים יורד מעט מ-100 ל-93.9% לאחר שעה אחת של מגע לאחר חמש שעות. נצפו הבדלים משמעותיים בכדאיות התא בין ה-ELS המרוכב שנבדק, הצטמקות נמוכה במיוחד ותרביות תאי הביקורת השליליות למרות אי הציטוטוקסיות של המרוכב.

הנתונים הנוכחיים מדגישים את השימוש בהדמיית זמן-lapse קונפוקלית כשיטה מדויקת ורגישה להערכת התנהגות הגן פיברובלסטים במגע עם חומרים מרוכבים דנטליים לאחר התפתחותו. שיטה זו היא דרך פרטית לחוקרים בתחום הטוקסיקולוגיה לחקור את הציטוטוקסיות והערכת הסיכונים של חומרים דנטליים, תרופות, חומרים כימיים ומכשירים רפואיים אחרים.