RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי
November 1st, 2014
סרטון זה מציג את השלבים הבסיסיים לביצוע ניתוח טרנסקריפטום שלם על דגימות חוט שדרה עוברי של אפרוח מנותח לאחר טרנספקציה עם אלקטרופורציה בביצית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את רמות הביטוי של כל הגנים והדגימות מחוטי השדרה העובריים של אפרוחים אלקטרופורטיים. זה מושג על ידי תחילה ביצה, נקבוביות הצד הימני של צינורות עצביים עובריים מוקדמים ודגירה מחדש של עוברים לשלב הרצוי. השלב השני של ההליך הוא לנתח חצאי צינור עצבי שהועברו בהצלחה בסביבה נטולת RNA ולהמשיך לליזה במהירות האפשרית.
השלב השלישי הוא לבודד RNA ולהכפיף את הדגימות להכנת ספרייה וריצוף תפוקה גבוהה. השלב האחרון הוא לעבד את ערכות הנתונים כדי להסיר תוצרי רצף. מיפוי גזעים לגנום והקצאת רמות ביטוי לכל גן.
בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי באמצעות השוואה של רמות ביטוי בתנאי בקרה וניסוי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדיסקציה של צינור עצבי. קשה ללמוד שלבים מכיוון שאנו דורשים היכרות עם מניפולציה של עוברים.
לצורך הדגמה זו, העוברים עברו טרנספורמציה כאשר ה-GFP מבטא מבנה בצינור העצבי. התכוננו לבלות שעתיים בעבודה על עד 10 עוברים כדי לאסוף מיקרוגרם אחד עד שניים של RNA כולל לעובר. בתנאים חופשיים של RNA, קצרו את העוברים באמצעות מספריים עדינים וכפית איסוף SVE מעבירה כל עובר לקור.
DEPC טופל. PBS השתמשה בפתרון לכל שלבי בידוד הצינור העצבי על ידי שימוש בפינצטה עדינה כדי להסיר את כל אזור האגף של העובר בין ניצני הגפיים. העבר את החלק הזה לתמיסה קרה טרייה כשצד הגב של הרקמה כלפי מעלה.
השתמש בשתי מחטי זכוכית עדינות כדי לנקב שלושה כתמים בכל צד צדדי גבי של העובר בין הצינור העצבי למזודרם הפריאלי. כעת הכניסו את שתי מחטי הזכוכית לנקב המרכזי והרחיקו אותן לאורך ציר ה-AP. עשה זאת דרך כל נקב לפי הצורך כדי לנתק בסופו של דבר את המזודרם המקביל, להסיר ולהשליך רקמה זו.
לאחר מכן, סובב את העובר הצידה והכנס את קצות שתי הפינצטות בין הצינור העצבי לחוט הצומת. החלק אותם זה מזה לאורך ציר AP כדי לחלק את המבנים. סיים להסיר חתיכות גדולות יותר של רקמת מדר מהצינור העצבי על ידי אבטחתו בעדינות עם פינצטה תוך כדי פינצטה של עודפי המזודרם.
לאחר מכן העבירו בעדינות את הצינור העצבי לתמיסה קרה וטרייה. בעזרת פיפטה מזכוכית עם משאבה ידנית, אספו את כל הצינורות העצביים הדרושים ושמרו אותם על קרח לפני שתמשיכו. כעת, חלקו כל אחד מהצינורות העצביים לשני חצאים.
הכנס פינצטה חדה ללומן וקרע את לוחית הגג. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי לחתוך את צלחת הרצפה ולחלק את הרקמה לשניים. בעזרת מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי, מיין את האלקטרופוט מחצאים לא אלקטרופוטיים.
העבירו את חצאי הצינור העצבי הממוין לצינור של 1.5 מיליליטר עם תמיסה טרייה. החלק את הצינורות האלה כדי להוריד את כל הרקמה לתחתית. לאחר מכן, סובב את הצינורות ב-100 GS למשך מספר שניות.
ואז בזהירות רבה תחת תאורה בהירה, שאפו את החבטה. אם נמשכת רקמה, הוציאו אותה לאט וחזרו על הסיבוב. לאחר ניקוי חצאי הצינור העצבי מהתמיסה, הוסף 70 מיקרוליטר לכל צינור עצבי, מחצית ממאגר הליזיס לצינור.
העיף את הצינור ודגר אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כל חמש דקות, מערבל את הצינור במרץ והמשך באיסוף ה-RNA לטיהור RNA לריצוף, יש לפחות שמונה חצאי צינור עצבי לכל דגימה. ניתן לאסוף אוספים אחרים של צינורות עצביים המאוחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לאוסף. התחל בהפשרתם על קרח למשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן השלם את ההפשרה בטמפרטורת החדר.
לאחר ההפשרה, מערבלים את כל הדגימות במרץ ונותנים להן לשבת במשך חמש דקות. לאחר מכן מערבב שוב את הדגימות וצנטריפוגה אותן ב-15,000 GS למשך דקה אחת. כדי להיפטר מחומר בלתי מסיס, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש והמשיכו במיצוי.
באמצעות ערכת בידוד RNA, השלם את התהליך על ידי התחמקות מה-RNA בריכוז הגדול ביותר האפשרי. פרוטוקול זה דורש חשבון אתר גלקסי כדי להבטיח את מכסת השטח הדרושה. ראשית, FTP מעלה את קבצי ה- FASTQ לאתר אלא אם כן ציוני האיכות כבר מקודדים ב- Shred plus 33.
ראשית, הכן את מערכי הנתונים שהועלו באמצעות כלי המספרה FASTQ תחת תפריט NGS QC ומניפולציה. אחרת, תחת תכונות, שנה את סוג הקובץ לשולח FASTQ. לאחר מכן, תחת תפריט NGS QC ומניפולציה, השתמש בכלי FAST QC כדי לנתח את האיכות הכללית של מערכי הנתונים.
בחר את גוזם האיכות FASTQ באותו תפריט כדי להשליך את שלושת הקצוות העיקריים באיכות נמוכה. יש לעבד ציון איכות של 20 ומעלה. כעת עבור לכלי הקליפ מתחת לאותו תפריט.
הגדר את הכלי הזה כדי למחוק קריאות עם פחות מ-45 זוגות בסיסים. הזן את רצף המתאם. השבת את האפשרות להשמיט קריאות עם בסיסים לא ידועים, ובחר את הפלט כך שיכלול רצפים חתוכים ולא חתוכים.
המשך עם כלי רצפי החיתוך. השתמש בו כדי לחתוך את הבסיסים הראשונים של הקריאה כדי להסיר את הטיית חמשת הרצפים הראשוניים שמזוהה על ידי FAST qc. השלב הבא הוא להוריד ולפרק את מכלול גנום העוף העדכני ביותר מאתר הגנום של Illumina I.
לאחר מכן העלה את כל קובץ הפורמט המהיר יותר של הגנום ואת קובץ פורמט ההערות של הגן GTF להיסטוריית הגלקסיה. כעת מפה את הקריאות עבור כל דגימה לגנום על ידי גישה לתפריט הניתוח N-G-S-R-N-A ובחירת הכלי Top hat two. בחר את קובץ ה-fasta שהועלה מ-Galaxy History כגנום הייחוס.
לאחר מכן, בחר בכלי קישורי החפתים תחת אותו תפריט כדי לבנות טרנסקריפטום חזוי. לכל דוגמה, בחרו בקובץ GTF שישמש כמדריך הערות עזר. בחר בצע תיקון הטיה באמצעות קובץ FASTA עבור נתוני הרצף והפעל את האפשרות השתמש בתיקון קריאה מרובה.
לאחר מכן מיזגו את כל התעתיקים להרכיב באמצעות כלי מיזוג השרוול. בעזרת כלי זה, בחר את קובץ GTF עבור ביאור ההפניה ואת קובץ FASTA עבור נתוני הרצף. כעת השווה את קבצי ה-BAM שנוצרו על ידי כובע עליון שניים עבור כל דגימה באמצעות כלי ה-TIFF של השרוול עדיין תחת תפריט ניתוח ה-RNA.
בשדה התמלילים, בחר את תעתיק המיזוג שנוצר על ידי מיזוג השרוול והפעל את האפשרויות. השתמש בתיקון קריאה מרובה ובצע תיקון הטיה באמצעות קובץ FASTA עבור נתוני הרצף. השלב הבא הוא מיון הטבלאות הדיפרנציאליות באמצעות עמודת ערך Q, בחר את כלי המיון מתפריט הסינון והמיון.
לרצפים עם הבדל משמעותי בין תנאי הניסוי יהיו ערכי ה-Q הנמוכים ביותר בעמודה 13. עכשיו תסתכל על גרף הסיקור. ראשית, המר את קבצי ה-BAM לקבצי גרף מיטה באמצעות כלי ההמרה מתחת לתפריט כלי המיטה מתחת לאפשרויות, השבת את הדיווח על אזורים ללא כיסוי ובחר להתייחס לערכים שחברו כמרווחים נפרדים.
כמו כן, הגדל את הכיסוי לפי גורם שמנרמל את כל הכיסויים בניסוי. לאחר מכן המר את קובץ גרף המיטה שהתקבל לפורמט הפאה הגדולה באמצעות הכלי בתפריט המרת פורמטים והעלה את קובץ הפאה הגדול כמסלול מותאם אישית לשרת UCSE. בדף דפדפן הגנום של USCS, השתמש ב-GAL ארבע הרכבות וחיפושי גנים לכיסוי חזותי של מערכי הנתונים באמצעות השיטות המתוארות צינורות עצביים המבטאים וקטורי PS ריקים נאספו עבור ה-RNA שלהם.
זה נעשה בשכפול וה-RNA שהתקבל היה באיכות גבוהה מאוד עם ערך RIN אופטימלי של 10 כצפוי. השוואה גלובלית של הטרנסקריפטומים של בקרות הווקטור הריקות המשוכפלות לא הראתה הבדל ברור ומקדם המתאם של פירסון היה נקודה 99. כמו כן, הייתה עלייה ברורה במספר הקריאות הממופות לרצף שני הגנים של השריטה בדגימה ניסיונית, המבטאות את שני תחומי אצבע האבץ.
לפיכך, השיטות היו רגישות מספיק כדי לזהות את ההעשרה החזויה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד את הצינור העצבי העוברי ולהבין היטב כיצד לעבד ולהשוות מערך נתונים של IC כדי למצוא גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי על ידי ביצוע שלבי ניתוח הסיליקון בסעיף 4 של הפרוטוקול.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הסרטון הזה מדגים את הנוהל לניתוח טרנסקריפטומל שלם של דגימות חוט שדרה עוברית שנחתכו של אפרוחים לאחר אלקטרופורציה בביצה. השיטה נועדה להעריך את רמות ביטוי הגנים בחוטי השדרה האלקטרופוריים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביטוי גנים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- ניתוח טרנסקריפטומל שלם מספק תובנות לביטוי גנים.
- אלקטרופורציה בביצה היא טכניקה המשמשת להדבקת רקמות עובריות.
- עוברי אפרוחים משמשים כמודל לחקר התפתחות חוט השדרה.
- בידוד RNA הוא קריטי לניתוח טרנסקריפטומי מדויק.
מטרת המחקר
- להעריך את רמות הביטוי של כל הגנים בחוטי השדרה העובריים של האפרוחים.
- להעריך את האפקטיביות של אלקטרופורציה בביצה למסירת גנים.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המעוניינים בתחום הטרנסקריפטומיקה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- אלקטרופורציה בביצה של עוברי אפרוחים.
- ניתוק של מחציות הצינור העצבי בסביבה נטולת RNA.
- בידוד RNA והכנת ספריה.
- רצף גבוה-תפוקתי ועיבוד נתונים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של RNA מחוטי שדרה אלקטרופוריים.
- נתוני רצף באיכות גבוהה שהושגו מהדגימות.
- רמות ביטוי של גנים שונים שמופו לגנום.
- זיהוי ועיבוד של תוצרי רצף מלאכותיים והסרתם.
מסקנות
- הפרוטוקול מעריך ביעילות את ביטוי הגנים בחוטי השדרה של אפרוחים.
- אלקטרופורציה בביצה היא שיטה מעשית להדבקת גנים.
- מחקר זה מספק בסיס למחקר טרנסקריפטומי עתידי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in early neuroscience discovery by linking genetic manipulation to transcriptome-wide functional readouts. It supports mechanistic de-risking of neural factor hypotheses through quantitative differential expression analysis. The approach provides predictive confidence for prioritizing targets in spinal cord development pathways before committing to lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring genome-wide transcriptional responses to electroporated constructs in embryonic spinal cord.
- Operational Value: Uses chick embryo model to functionally validate neural targets in a disease-relevant system with high transcriptional fidelity.
- Predictive Value: Enables detection of differentially expressed genes to clarify pathway involvement and de-risk target mechanisms prior to assay development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality RNA-seq data suitable for establishing baseline transcriptomes in control and experimental conditions.
- Operational Value: Produces reproducible gene expression measurements that support assay standardization for downstream screening campaigns.
- Scalability Value: Leverages public Galaxy server for bioinformatic processing, eliminating need for local computational infrastructure in small-to-medium scale target validation studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects early discovery findings to preclinical continuity by identifying differentially expressed genes relevant to spinal cord development pathways.
- Mechanistic De-risking: Confirms construct overexpression (e.g., scratch two zinc finger domains) through transcriptomic enrichment, supporting target engagement validation.
- Predictive Confidence: Uses replicate control samples with Pearson correlation of 0.99 to ensure detection sensitivity for true differential expression in experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing transcriptome-scale functional readouts that inform target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by comparing transcriptomes of control and experimental spinal cord halves following electroporation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized RNA isolation and library preparation under RNase-free conditions, yielding sequencing-ready samples.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression measurements via RNA-seq, allowing comparison of expression levels and identification of significantly differentially expressed transcripts using Q-value thresholds.
- Translational Research: Connects early target validation to preclinical relevance by identifying differentially expressed genes in neural development pathways with visual verification of construct overexpression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptome analysis workflow for neural target validation that can be applied across multiple constructs and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through genome-wide expression profiling and reduction of mechanistic ambiguity in neural development models.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via RNase-free dissection, high-quality RNA isolation (RIN 10), and public server-based bioinformatic processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of transcriptional responses, reducing late-stage biological risk in neuroscience target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering quantitative differential expression data that informs advancement decisions in lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo manipulation, in ovo electroporation, and RNase-free tissue handling for successful neural tube dissection.
- Depends on access to high-throughput sequencing and public bioinformatic platforms (Galaxy) for RNA-seq data processing and differential expression analysis.
- Necessitates standardization across teams for embryo staging (HH23), dissection consistency, and library preparation to ensure reproducible transcriptome comparisons.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different embryonic stages, constructs, or model systems beyond chick spinal cord.
- Practical limitations include the technical difficulty of neural tube dissection and the requirement for biological replicates to achieve sufficient statistical power for differential expression detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Harvesting Neural Tubes for RNA Collection
4:32
Pooling Tissue to Purify RNA for Illumina Sequencing
5:34
Comparing RNA-Seq Datasets on the Galaxy Public Server
9:52
Transcriptome Analysis Quality
9:52
Results: Transcriptome Analyis Quality
10:42
Conclusion
