RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי
1 בנובמבר 2014
סרטון זה מציג את השלבים הבסיסיים לביצוע ניתוח טרנסקריפטום שלם על דגימות חוט שדרה עוברי של אפרוח מנותח לאחר טרנספקציה עם אלקטרופורציה בביצית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את רמות הביטוי של כל הגנים והדגימות מחוטי השדרה העובריים של אפרוחים אלקטרופורטיים. זה מושג על ידי תחילה ביצה, נקבוביות הצד הימני של צינורות עצביים עובריים מוקדמים ודגירה מחדש של עוברים לשלב הרצוי. השלב השני של ההליך הוא לנתח חצאי צינור עצבי שהועברו בהצלחה בסביבה נטולת RNA ולהמשיך לליזה במהירות האפשרית.
השלב השלישי הוא לבודד RNA ולהכפיף את הדגימות להכנת ספרייה וריצוף תפוקה גבוהה. השלב האחרון הוא לעבד את ערכות הנתונים כדי להסיר תוצרי רצף. מיפוי גזעים לגנום והקצאת רמות ביטוי לכל גן.
בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי באמצעות השוואה של רמות ביטוי בתנאי בקרה וניסוי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדיסקציה של צינור עצבי. קשה ללמוד שלבים מכיוון שאנו דורשים היכרות עם מניפולציה של עוברים.
לצורך הדגמה זו, העוברים עברו טרנספורמציה כאשר ה-GFP מבטא מבנה בצינור העצבי. התכוננו לבלות שעתיים בעבודה על עד 10 עוברים כדי לאסוף מיקרוגרם אחד עד שניים של RNA כולל לעובר. בתנאים חופשיים של RNA, קצרו את העוברים באמצעות מספריים עדינים וכפית איסוף SVE מעבירה כל עובר לקור.
DEPC טופל. PBS השתמשה בפתרון לכל שלבי בידוד הצינור העצבי על ידי שימוש בפינצטה עדינה כדי להסיר את כל אזור האגף של העובר בין ניצני הגפיים. העבר את החלק הזה לתמיסה קרה טרייה כשצד הגב של הרקמה כלפי מעלה.
השתמש בשתי מחטי זכוכית עדינות כדי לנקב שלושה כתמים בכל צד צדדי גבי של העובר בין הצינור העצבי למזודרם הפריאלי. כעת הכניסו את שתי מחטי הזכוכית לנקב המרכזי והרחיקו אותן לאורך ציר ה-AP. עשה זאת דרך כל נקב לפי הצורך כדי לנתק בסופו של דבר את המזודרם המקביל, להסיר ולהשליך רקמה זו.
לאחר מכן, סובב את העובר הצידה והכנס את קצות שתי הפינצטות בין הצינור העצבי לחוט הצומת. החלק אותם זה מזה לאורך ציר AP כדי לחלק את המבנים. סיים להסיר חתיכות גדולות יותר של רקמת מדר מהצינור העצבי על ידי אבטחתו בעדינות עם פינצטה תוך כדי פינצטה של עודפי המזודרם.
לאחר מכן העבירו בעדינות את הצינור העצבי לתמיסה קרה וטרייה. בעזרת פיפטה מזכוכית עם משאבה ידנית, אספו את כל הצינורות העצביים הדרושים ושמרו אותם על קרח לפני שתמשיכו. כעת, חלקו כל אחד מהצינורות העצביים לשני חצאים.
הכנס פינצטה חדה ללומן וקרע את לוחית הגג. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי לחתוך את צלחת הרצפה ולחלק את הרקמה לשניים. בעזרת מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי, מיין את האלקטרופוט מחצאים לא אלקטרופוטיים.
העבירו את חצאי הצינור העצבי הממוין לצינור של 1.5 מיליליטר עם תמיסה טרייה. החלק את הצינורות האלה כדי להוריד את כל הרקמה לתחתית. לאחר מכן, סובב את הצינורות ב-100 GS למשך מספר שניות.
ואז בזהירות רבה תחת תאורה בהירה, שאפו את החבטה. אם נמשכת רקמה, הוציאו אותה לאט וחזרו על הסיבוב. לאחר ניקוי חצאי הצינור העצבי מהתמיסה, הוסף 70 מיקרוליטר לכל צינור עצבי, מחצית ממאגר הליזיס לצינור.
העיף את הצינור ודגר אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כל חמש דקות, מערבל את הצינור במרץ והמשך באיסוף ה-RNA לטיהור RNA לריצוף, יש לפחות שמונה חצאי צינור עצבי לכל דגימה. ניתן לאסוף אוספים אחרים של צינורות עצביים המאוחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לאוסף. התחל בהפשרתם על קרח למשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן השלם את ההפשרה בטמפרטורת החדר.
לאחר ההפשרה, מערבלים את כל הדגימות במרץ ונותנים להן לשבת במשך חמש דקות. לאחר מכן מערבב שוב את הדגימות וצנטריפוגה אותן ב-15,000 GS למשך דקה אחת. כדי להיפטר מחומר בלתי מסיס, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש והמשיכו במיצוי.
באמצעות ערכת בידוד RNA, השלם את התהליך על ידי התחמקות מה-RNA בריכוז הגדול ביותר האפשרי. פרוטוקול זה דורש חשבון אתר גלקסי כדי להבטיח את מכסת השטח הדרושה. ראשית, FTP מעלה את קבצי ה- FASTQ לאתר אלא אם כן ציוני האיכות כבר מקודדים ב- Shred plus 33.
ראשית, הכן את מערכי הנתונים שהועלו באמצעות כלי המספרה FASTQ תחת תפריט NGS QC ומניפולציה. אחרת, תחת תכונות, שנה את סוג הקובץ לשולח FASTQ. לאחר מכן, תחת תפריט NGS QC ומניפולציה, השתמש בכלי FAST QC כדי לנתח את האיכות הכללית של מערכי הנתונים.
בחר את גוזם האיכות FASTQ באותו תפריט כדי להשליך את שלושת הקצוות העיקריים באיכות נמוכה. יש לעבד ציון איכות של 20 ומעלה. כעת עבור לכלי הקליפ מתחת לאותו תפריט.
הגדר את הכלי הזה כדי למחוק קריאות עם פחות מ-45 זוגות בסיסים. הזן את רצף המתאם. השבת את האפשרות להשמיט קריאות עם בסיסים לא ידועים, ובחר את הפלט כך שיכלול רצפים חתוכים ולא חתוכים.
המשך עם כלי רצפי החיתוך. השתמש בו כדי לחתוך את הבסיסים הראשונים של הקריאה כדי להסיר את הטיית חמשת הרצפים הראשוניים שמזוהה על ידי FAST qc. השלב הבא הוא להוריד ולפרק את מכלול גנום העוף העדכני ביותר מאתר הגנום של Illumina I.
לאחר מכן העלה את כל קובץ הפורמט המהיר יותר של הגנום ואת קובץ פורמט ההערות של הגן GTF להיסטוריית הגלקסיה. כעת מפה את הקריאות עבור כל דגימה לגנום על ידי גישה לתפריט הניתוח N-G-S-R-N-A ובחירת הכלי Top hat two. בחר את קובץ ה-fasta שהועלה מ-Galaxy History כגנום הייחוס.
לאחר מכן, בחר בכלי קישורי החפתים תחת אותו תפריט כדי לבנות טרנסקריפטום חזוי. לכל דוגמה, בחרו בקובץ GTF שישמש כמדריך הערות עזר. בחר בצע תיקון הטיה באמצעות קובץ FASTA עבור נתוני הרצף והפעל את האפשרות השתמש בתיקון קריאה מרובה.
לאחר מכן מיזגו את כל התעתיקים להרכיב באמצעות כלי מיזוג השרוול. בעזרת כלי זה, בחר את קובץ GTF עבור ביאור ההפניה ואת קובץ FASTA עבור נתוני הרצף. כעת השווה את קבצי ה-BAM שנוצרו על ידי כובע עליון שניים עבור כל דגימה באמצעות כלי ה-TIFF של השרוול עדיין תחת תפריט ניתוח ה-RNA.
בשדה התמלילים, בחר את תעתיק המיזוג שנוצר על ידי מיזוג השרוול והפעל את האפשרויות. השתמש בתיקון קריאה מרובה ובצע תיקון הטיה באמצעות קובץ FASTA עבור נתוני הרצף. השלב הבא הוא מיון הטבלאות הדיפרנציאליות באמצעות עמודת ערך Q, בחר את כלי המיון מתפריט הסינון והמיון.
לרצפים עם הבדל משמעותי בין תנאי הניסוי יהיו ערכי ה-Q הנמוכים ביותר בעמודה 13. עכשיו תסתכל על גרף הסיקור. ראשית, המר את קבצי ה-BAM לקבצי גרף מיטה באמצעות כלי ההמרה מתחת לתפריט כלי המיטה מתחת לאפשרויות, השבת את הדיווח על אזורים ללא כיסוי ובחר להתייחס לערכים שחברו כמרווחים נפרדים.
כמו כן, הגדל את הכיסוי לפי גורם שמנרמל את כל הכיסויים בניסוי. לאחר מכן המר את קובץ גרף המיטה שהתקבל לפורמט הפאה הגדולה באמצעות הכלי בתפריט המרת פורמטים והעלה את קובץ הפאה הגדול כמסלול מותאם אישית לשרת UCSE. בדף דפדפן הגנום של USCS, השתמש ב-GAL ארבע הרכבות וחיפושי גנים לכיסוי חזותי של מערכי הנתונים באמצעות השיטות המתוארות צינורות עצביים המבטאים וקטורי PS ריקים נאספו עבור ה-RNA שלהם.
זה נעשה בשכפול וה-RNA שהתקבל היה באיכות גבוהה מאוד עם ערך RIN אופטימלי של 10 כצפוי. השוואה גלובלית של הטרנסקריפטומים של בקרות הווקטור הריקות המשוכפלות לא הראתה הבדל ברור ומקדם המתאם של פירסון היה נקודה 99. כמו כן, הייתה עלייה ברורה במספר הקריאות הממופות לרצף שני הגנים של השריטה בדגימה ניסיונית, המבטאות את שני תחומי אצבע האבץ.
לפיכך, השיטות היו רגישות מספיק כדי לזהות את ההעשרה החזויה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד את הצינור העצבי העוברי ולהבין היטב כיצד לעבד ולהשוות מערך נתונים של IC כדי למצוא גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי על ידי ביצוע שלבי ניתוח הסיליקון בסעיף 4 של הפרוטוקול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הפרוצדורה לניתוח טרנסקריפטום מלא של דגימות מנוזלות של חוט השדרה העוברי של אפרוחים לאחר אלקטרופורציה in ovo. מטרת השיטה היא להעריך את רמות הביטוי הגני בחוטי שדרה שעברו אלקטרופורציה.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביטוי גנים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- ניתוח של כל התמלסומה (whole transcriptome) מספק תובנות לגבי ביטוי גנים.
- אלקטרפורציה in ovo היא טכניקה המשמשת לטרנספקציה של רקמות עובריות.
- עוברי אפרודים משמשים כמודל לחקר התפתחות חוט השדרה.
- בידוד RNA הוא שלב קריטי לניתוח תמלסומי מדויק.
מטרת המחקר
- להערכת רמות הביטוי של כל הגנים בחבל השדרה העוברי של אפרוח.
- להערכת היעילות של אלקטרופורציה in ovo להחדרת גנים.
- לספק פרוטוקול עבור חוקרים המעוניינים בטרנסקריפטומיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורציה In ovo של עוברים של אפרוחים.
- דיסקציה של חצאי צינור עצבי בסביבה נקייה מ-RNA.
- בידוד RNA והכנת ספרייה.
- ריצוף בסבירה גבוהה (High-throughput sequencing) ועיבוד נתונים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של RNA מחוט ששירה שעבר אלקטרופורציה.
- השגת נתוני רצף באיכות גבוהה מהדגימות.
- מיפוי של רמות ביטוי של גנים שונים לגנום.
- זיהוי של ארטיפקטים של רצף והסרתם.
מסקנות
- הפרוטוקול מעריך ביעילות את ביטוי הגנים בעמוד השדרה של אפרוחים.
- אלקטרפורציה in ovo היא שיטה ויבילה לטרנספקציה של גנים.
- מחקר זה מספק בסיס למחקר טרנסקריפטומי עתידי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת תיקוף של מטרות (target validation) בשלב הגילוי המוקדם במדעי העצבים, על ידי קישור מניפולציה גנטית לקריאות תפקודיות ברחבי התעתק התומך (transcriptome). היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של השערות הנוגעות לגורמים עצביים באמצעות ניתוח כמותי של ביטוי דיפרנציאלי. הגישה מספקת ביטחון חזוי לצורך תיעדוף מטרות במסלולי התפתחות של חוט השדרה, בטרם השקעת מאמצים בזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת תגובות שעתוק ברחב הגנום לקונסטרוקטים שהוכנסו באמצעות אלקטרופורציה לחוט השדרה העוברי.
- ערך תפעולי: משתמש במודל של עובר אפרופה כדי לתקף תפקודית מטרות עצביות במערכת רלוונטית למחלה עם נאמנות שעתוק גבוהה.
- ערך ניבוי: מאפשר זיהוי של גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי כדי להבהיר את מעורבות המסלול ולהפחית סיכונים במכניזמי המטרה לפני פיתוח הבדיקה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתוני RNA-seq באיכות גבוהה המתאימים לביסוס טרנסקריפטומים של קו בסיס בתנאי בקרה ובתנאים ניסיוניים.
- ערך תפעולי: מפיק מדידות ביטוי גנים הניתנות לשחזור, התומכות בסטנדרטיזציה של הבדיקה עבור קמפיינים של סריקה בהמשך התהליך.
- ערך סקלאביליות: עושה שימוש בשרת Galaxy ציבורי לעיבוד ביו-אינפורמטי, ובכך מבטל את הצורך בתשתית מחשוב מקומית במחקרי תיקוף מטרות בקנה מידה קטן עד בינוני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר ממצאים משלבי הגילוי המוקדמים לרציפות פרה-קלינית על ידי זיהוי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הרלוונטיים למסלולי התפתחות של חוט השדרה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאשר ביטוי יתר של הקונסטרוקט (למשל, שריטה של שני דומייני אצבע אבצן) באמצעות העשרה טרנסקריפטומית, התומכת בתיקוף של מעורבות המטרה.
- ביטחון חיזוי: משתמש בדגימות בקרה שחזוריות עם מתאם פירסון של 0.99 כדי להבטיח רגישות גילוי לביטוי דיפרנציאלי אמיתי בתנאים ניסיוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת תוצאות פונקציונליות בקנה מידה של טרנסקריפטום, המסייעות בבחירה ובתיעדוף של מטרות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי השוואה של טרנסקריפטומים של חצאי חוט שדרה של ביקורת ושל קבוצת ניסוי לאחר אלקטרופורציה.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות בידוד RNA והכנת ספרייה סטנדרטיים בתנאים נטולי RNase, המניבים דגימות מוכנות לרצף.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של ביטוי גנים באמצעות RNA-seq, המאפשרות השוואה של רמות ביטוי וזיהוי של טרנסקריפטים עם ביטוי דיפרנציאלי משמעותי באמצעות ספי רכיבי Q-value.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תיקוף מטרות מוקדם לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי זיהוי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במסלולי התפתחות עצבית, עם אישור חזותי של ביטוי יתר של הקונסטרקט.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה ניתנת לשימוש חוזר לניתוח טרנסקריפטום עבור תיקוף מטרות עצביות, שניתן להחיל על מספר קונסטרקטים ושלבי התפתחות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות פרופיל ביטוי רחב-גנומי והפחתת עמימות מכניסטית במודלים של התפתחות עצבית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והסבירות לשחזור באמצעות ניתוח נטול RNase, בידוד RNA באיכות גבוהה (RIN 10), ועיבוד ביו-אינפורמטי באמצעות שרתים ציבוריים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי אפשרות לגילוי מוקדם של תגובות שעתוק, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למטרות במדעי העצב.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים כמותיים של ביטוי דיפרנציאלי, המנחים החלטות קידום בשלב זיהוי המולקולות המובילות (lead identification).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במניפולציה של עובריים, אלקטרופורציה in ovo וטיפול ברקמות ללא RNase לצורך ביצוע מוצלח של דיסקציה של צינור העצבים.
- תלוי בגישה לריצוף בסביקת תפוקה גבוהה ולפלטפורמות ביו-אינפורמטיות ציבוריות (Galaxy) לצורך עיבוד נתוני RNA-seq ואנליזה של ביטוי דיפרנציאלי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי שלב העובר (HH23), עקביות בדיסקציה והכנת ספריות, כדי להבטיח השוואות טרנסקריפטום הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לשלבים עובריים שונים, קונסטרוקטים או מערכות מודל מעבר לחוט השדרה של אפלוח.
- מגבלות מעשיות כוללות את הקושי הטכני של דיסקציית צינור העצבים ואת הדרישה לחזרות ביולוגיות כדי להשיג עוצמה סטטיסטית מספקת לזיהוי ביטוי דיפרנציאלי.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Harvesting Neural Tubes for RNA Collection
4:32
Pooling Tissue to Purify RNA for Illumina Sequencing
5:34
Comparing RNA-Seq Datasets on the Galaxy Public Server
9:52
Transcriptome Analysis Quality
9:52
Results: Transcriptome Analyis Quality
10:42
Conclusion
