Name: רביה של וירוס-01 coagulata Homalodisca דרך Homalodisca vitripennis תרבות תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: למדו כיצד לשכפל את נגיף HoCV-1 בתרביות תאים של Homalodisca vitripennis ולהפיק RNA לכימות באמצעות qRT-PCR. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקה ויראלית ואינטראקציות מארח-נגיף בצורה יעילה וכלכלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לתוכנית המחקר והחינוך של מחלת טקסס פירס ול-USDA-APHIS על תמיכתם במימון פרויקט זה. ברצוננו גם להודות להמה קותארי מהמרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בטיילר על סיועה במיקרוסקופיה קונפוקלית.

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> חששות עולים בנוגע לזרם של מינים חקלאיים פולשני שיובילו לגידול בביקוש למתודולוגיות חדשות להגנה מפני מזיקים ופתוגנים המתעוררים. מוקד מניעת מחלות וניהול כרוך בניהול של וקטורי הפתוגן והיה היעד העיקרי של מחקר זה. כלכלה לשחק תפקיד חיוני בהחלטה לייצר סוג זה של biopesticide לנהל וקטורי הפתוגן בחקלאות, מכיוון שהיישום המעשי צריך להיות כמויות גדולות על פני שטחים גדולים אך במחיר נמוך 12. הפרקטיקה של ניצול תרבית תאים למחקר ופיתוח הפכה נפוצה יותר ויותר ובתור שכזה, השפעותיו של מ...

הצלף מזוגגת המכונף (Homalodisca vitripennis Germar 1821) זוהה כווקטור העיקרי של fastidiosa (fastidiosa X.) Xylella, הסוכן סיבתי של מחלת פירס של גפן (PD) בצפון אמריקה 1. ניהול אוכלוסיית חרקים הפך במהירות למוקד של מחקר כדי להילחם בבעיה הרסנית הזאת לתעשיית גידול הגפנים בקליפורניה וברחבי ארצות הברית הדרום. חיובי תחושה, וירוס RNA חד גדילים השייכת למשפחה Dicistroviridae, Homalodisca-01 וירוס (HoCV-01) זוהה coagulata בה הפראית אוכלוסיות vitripennis והוצג להגדלת תמותה באוכלוסיות אלה 2-4, תוך הפחתת ההתנגדות של החרקים לחומרי הדברה. פיתוח שיטות ליעילות אחורי נגוע ח vitripennis לבגרות במעבדת הגדרה היה קשה משום ש <eמ &#39;&gt; H. יש לי vitripennis הצרכים בשלב מסוים שונים תזונתיים הדורשים מגוון רחב של צמחי מארח 5-8. מתקנים ספציפיים נדרשים לה &#39;חי אחורי vitripennis בארצות הברית; לכן, תרבית תאים היא חסכונית יותר וחלופה, כמו גם חיונית יותר ויותר לHoCV-01 זיהוי ושכפול 2,9. בעוד שיטות בסיסיות להקמת תרביות תאים של ה vitripennis מתוארים, שיטות אלה עדיין לא נוצלו לייצור מסחרי של סוכני הדברה ביולוגיים, כגון וירוסים 2. המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא לייצר ריכוז גבוה של HoCV-01 מתאים לניצול כסוכן הדברה ביולוגי. שכפול נגיפי דורש תא חי, וזאת הסיבה שהצלחת טיפוח וייעול ה &#39; תרבויות vitripennis היא חיוניות להתקדמות של הפקת רמות רווחיות של וירוס.

<table><tbody><tr><td>צלוחיות תרבית תאי קורנינג</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>שטח פנים 25 ס"מ2, צוואר משומר, כובע (אטם תקע)</td></tr> <tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>מיקרוסקופ הפוך ומצלמה</td></tr><tr><td>תמיסת Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים, 2.5 גרם טריפסין חזיר ו-0.2 גרם EDTA ושור; 4Na לליטר Hanks&prime; תמיסת מלח מאוזנת עם פנול אדום</td></tr><tr><td>גריינר CELLSTAR צלחות תרבית מרובות בארות</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M8937</td><td>48 בארות (TC מטופל במכסה)</td></tr> <tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>נתרן דיאתילדיתיוקרבמט טריהידראט</td></tr><tr><td>מערכת מסנן ואקום על בקבוק קורנינג</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CLS431206</td><td>קרום אצטט תאית, גודל נקבוביות 0.45 &mu; M, שטח הממברנה 54.5 ס"מ2, קיבולת סינון 500 מ"ל</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>פוליאתילן גליקול אתר hexadecyl</td></tr><tr><td>תמיסת חיץ פוספט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>התקבל כ-100 מ"מ מדולל ל-10 מ"מ עם מים סטריליים</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>עבור אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E7637</td><td>BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, אבקה</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ערכת QuantiTect qRT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P6148</td><td>דרגת ריאגנט, PBS גבישי</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5368</td><td>פוספט אלבומין סרום</td></tr><tr><td>בקר Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin מצומד אדום</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin הוא בדיקה F-actin בעלת זיקה גבוהה המצומדת לצבע הפלואורסצנטי האדום-כתום, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal System</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s חרקים בינוניים (בתוספת תשלום, 1x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8142</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>L-היסטידין מונוהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H8125</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>בינוני 199 (10x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M4530</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>בינוני 1066 (1x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0422</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>האנק' מלחים מאוזנים (1x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>51322C</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (100x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G3126</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>MEM, תערובת חומצות אמינו (50x)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>56419C</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>1 M תמיסת MgCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M8266</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>עט סטרפטוקוקוס (עם/ גלוטמין)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G6784</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>ניסטטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N6261</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9434</td><td>H2G+ עלים רכיב בינוני</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F2442</td><td>H2G+ רכיב בינוני עלים</td></tr></tbody></table>

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

הצלף מזוגגת מכונף (Homalodisca vitripennis) הוא חרקים vagile וpolyphagous מאוד למצוא בכל רחבי מערב ארצות הברית. חרקים אלה הם הווקטורים העיקריים של (fastidiosa X.) fastidiosa Xylella, חיידק מוגבל עצה שהוא הסוכן סיבתי למחלתו של פירס (PD) של גפן. מחלתו של פירס היא מבחינה כלכלית מזיקה; וכך, ה &#39; vitripennis הפך יעד לאסטרטגיות ניהול הפתוגן. Dicistrovirus זוהה כוירוס-01 coagulata Homalodisca (HoCV-01) נמצא קשור לסיכון מוגבר לתמותה בח אוכלוסיות vitripennis. בגלל נדרש תא מארח עבור שכפול HoCV-01, תרבית תאים מספקת סביבה אחידה לשכפול ממוקד שהוא מבחינה לוגיסטית וכלכלי רב ערך לייצור biopesticide. במחקר זה, מערכת להפצה בקנה מידה גדולה של ה &#39; תאי vitripennis באמצעות תרבית רקמה פותחו, עמ &#39;roviding מנגנון שכפול נגיפי. HoCV-01 היה שחולץ מן החרקים בכל גוף ומשמש ללחסן ה התרבותית תאי vitripennis ברמות שונות. מדיום התרבות הוסר כל שעה 24 ל168 שעה, RNA חילוץ וניתח עם qRT-PCR. תאים הוכתמו trypan הכחול ונספרו לכמת שרידות תא באמצעות מיקרוסקופ אור. חלקיקי נגיף שלמים הוצאו עד 96 שעות לאחר הדבקה, שהייתה נקודת הזמן שנקבעה להיות לפני קריסה מוחלטת תרבית תאים התרחשה. תאים גם היו נתונים לצביעת ניאון ונצפו באמצעות מיקרוסקופ confocal לחקור פעילות נגיפית בשלמות התקשרות וגרעיני F-אקטין. המסקנה של מחקר זה היא כי ה &#39; תאי vitripennis מסוגלים להיות מתורבת ומשמש לייצור המוני של HoCV-01 ברמה מתאימה שיאפשר ייצור של biopesticide.

מצורף תא והצמיחה נתפסו בתוך 48 שעות של מעבר בשני צלוחיות התרבות הקטנות וגדולות, מתרבויות עיקריות ומעברים המשיכו. גידול פיברובלסטים ופיתוח נצפו גם בתוך מסגרת זמן זו. כאשר צלוחיות זורעים עתה הופרעו לפני 48 שעה, חלה ירידה ניכרת בקובץ מצורף תא, שמוביל לתרבויות איטיות הולך וגדל ולפעמים אין קובץ מצורף או צמיחה בכל. תאים היו כ 80 מחוברות% בתוך שבוע לפטירה אחד ויצרו monolayer ב10-14 ימים (איור 1). תרבויות עיקריות שעובדו בייזום של מחקר זה, ששרדו 30+ מעברי תא ללא כל הידרדרו...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפיץ תאי vitripennis Homalodisca וHoCV-1 במבחנה. בינוני הוסר מHoCV-1 תרבויות חיוביות וRNA שחולץ כל שעה 24 ל168 שעה. שרידות תא הייתה לכמת ידי מכתים trypan הכחול. חלקיקי נגיף שלמים חולצו לאחר פגיעה. RNA שחולץ היה לכמת ידי qRT-PCR.

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע אם ניתן לשכפל את הווירוס Homalodisca coagulata virus one או HOCV-one באמצעות תרביות תאים של Homalodisca vitripennis, ולאחר מכן להוציאו לצורך שימושים המשכיים. זאת מושג על ידי גידול מוצלח של H. vitripennis לצורך החדרת HOCV-one מטוהר לשכפול. כשלב שני, המצע והתאים המכילים את הווירוס מוסרים מהתרבית, ולאחר מכן עוברים לתהליכי מיצוי של הווירוס ושל RNA.בשלב הבא, RNA שהופק מהתרביות המודבקות נסמך לבדיקת PCR כדי לקבוע אם RNA נגיפי נוכח בתאים. התוצאות מראות שניתן לשכפל את HOCV one in vivo, בהתבסס על ספירת תאים חיים לפני ואחרי ההדבקה ועל ניתוח qRT-PCR.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גידול חרקים חיים מזוהמים, הוא שהיא כלכלית יותר וניתנת לניהול קל עם מינימום מתקנים וציוד. השימוש בשיטה זו עשוי לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הבקרה הביולוגית. לדוגמה, האם ניתן להשתמש בנגיף חרקים, או בנגיף הספציפי למין חרק מסוים, כדי להדביר מזיקים בקנה מידה רחב?אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ניהולו של חרק ספציפי זה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון ניהול נמלי אש אדומות פולשניות באמצעות נגיף מאותה משפחה של HOCV one. לפני תחילת הטיפול, השקיעו ותחזקו תרביות בבקבוקוני תרבית רקמה של 25 סמ"ר תוך שימוש במצע H2G plus leaf hopper, מצע דבורי דבש WH-two משופר. הומוגניזרו גופים שלמים של H. vitripennis חיוביים לנגיף בבופר פוספט עם 0.02% DETCA באמצעות וורטקס במרווחי זמן של כעשר שניות, עד שלא ייווצרו גושים גדולים של רקמה. חלצו את הנגיף באמצעות צנטריפוגה מהירה ב-22,000 g למשך 16 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר השליפת של הנוזל העליון, אספו את המשקע והמסו אותו בחמישה מיליליטר של באפר פוספאט 10 millimolar המכיל 0.4% sodium deoxycholic acid ו-4% polyethylene glycol hexa-desal ether. כדי לערבב את המשקע היטב, הסירו אותו מדופן המבחנה ומעכו אותו במידת הצורך. לאחר סבוב בצנטריפוגה ב-300 g למשך 15 דקות, הסירו את הנוזל העליון, ולאחר מכן העבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.45 micrometer ואספו את התסנין למבחנת איסוף גדולה.העבירו את התסנן לממברנת דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (molecular weight cutoff) של 3.5 kilodaltons, תוך שימוש בכמויות קטנות של באפר פוספט 10 millimolar ללא DETCA במידת הצורך. הניחו את ממברנת הדיאליזה בתוך כלי כימי (beaker) גדול מלא במים מזוקקים פעמיים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. החליפו את המים בכל שעה, למשך חמש עד שש שעות, עד להיווצרות משקב לבן בתוך הממברנה. בנקודה זו, זרעו תאים בתוך פלטות תרבית בעלות 48 בארות.כאשר צמיחת התאים תגיע ל-80% התמסכות (confluent), זרקו לכל שורה של תאים את הוירוס בדילולים סדרתיים. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של מים מזוקקים פעמיים לכל באר כביקורת נפח. כדי לקבוע ריכוז תאים התחלתי בסיסי להשוואה עם ספירות התאים בניסוי, הפרדו את התאים בבאר הראשונה של כל שורה לפני הזריקה הראשונית של הוירוס לכל אחת מהבארים בתרביות. לאחר מכן, ספרו את התאים.בשלב הבא, הוצאו את כל המצע מהעמודה שצולמה בכל נקודת זמן של 24 שעות ואחסנו אותו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצורך הפקת RNA וכמותיות נגיפית. לאחר הפקת הנגיף מתאי התרבית בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם לכן, הפקו RNA מדגימות המצע שנאספו במהלך כל ניסוי נגיפי של שבוע אחד, תוך שימוש בהפקה של guanidinium thiocyanate phenol chloroform המיועדת לדגימות נוזליות, לפי פרוטוקול היצרן. עבור RT PCR, קבעו סטנדרטים נגיפיים על ידי הרצת PCR מסורתי תוך שימוש בזוג הפריימרים HOCV RT PCR primer-one עם בידוד נגיפי מגוף שלם של H. vitripennisלאחר מכן, בצעו סדרת מהלולי עשירתו (tenfold serial dilution) של הדגימה המטוהרת בטווח שבין 57 nanograms per microliter ל-57 attograms per microliter. קבעו את גבולות הגילוי של סדרת המהלולים באמצעות qRT-PCR, תוך שימוש בערכה ל-qRT PCR המאפשרת כימות מהימן של תמלילים בריכוז נמוך.לאחר הפקת RNA מהדגימות הניסיוניות כפי שתואר בעבר, יש לבצע כימות באמצעות ספקטרופוטומטריה. לאחר מכן, בצעו qRT-PCR עבור כל הדגימות בכפל (duplicates) כתגובות של 25 µL באמצעות ערכת one step qRT-PCR בעלת יכולת לגילוי מספר עותקים נמוך, באופן הבא: הכינו את תערובת המאסטר (master mix) כך שכל תערובת תגובה תכיל 12.5 µL של one x master mix, ‏1.0 µL של 0.3 µM forward primer, ‏1.0 µL של 0.3 µM reverse primer, ‏0.25 µL של reverse transcriptase וכמויות משתנות של תבנית (template) בהתבסס על ערכי הסטנדרטיזציה. לאחר מכן, השלימו את נפח התגובה הכולל ל-25 µL עם מים נקיים מ-RNases. כלל חמישה ריכוזי סטנדרט בכל הרצת PCR עם 5×10⁻¹, 10, 5×10⁻⁸, 5×10⁻⁶, 5×10⁻⁴ ו-5×10⁻² עותקים. הגדירו את סף הגילוי (threshold) עבור כל הרצה לרמה הנמוכה ממש מפלואורסצנציה של 10⁻².⁵ כדי להפחית רעשים במהלך האיסוף המוקדם בתחילת כל הרצה.לאחר שגידלו תאי Homalodisca vitripennis בלוחית 12 בארות המכילה כיסויי זכוכית, יש להחדיר את הווירוס המופק לעמודה אחת בכל 24 שעות במשך ארבעה ימים, עד להשגת שכבה אחת (monolayer). בסיום, קבע את התאים באמצעות 4% paraformaldehyde קר בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף לתאים 500 µL של 1X PBS ושטוף אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מכשיר ערבוב (rocker) במהירות נמוכה. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים, הוסף 500 µL של 0.1% TritonX-100 כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization) למשך 10 דקות.לאחר שטיפת התאים ב-1X PBS, הוסיפו 500 microliters של תמיסת bovine serum albumin בריכוז של 5% כדי לחסום את התאים בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, הסירו את התמיסה מהתאים. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 250 microliters של תמיסת stock מדוללת של Phalloidin המשורשר ל-rhodamine-red לצביעת f-actin. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי למנוע דהייה של הצבע והדגירו את התאים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך לילה. לאחר ההדגרה, הסירו את תמיסת ה-rhodamine והחליפו אותה ב-250 microliters של DAPI מדולל ב-1X PBS המכיל 5% BSA לצביעת גרעיני התאים. לאחר הדגרת התאים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, שטפו אותם שלוש פעמים ב-1X PBS כפי שמתואר לעיל.לבסוף, הסרו בעדינות את לבישי הכיסוי מהבארות והצמידו אותם למשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מדיום קיבוע המכיל רכיב Antifade.היצמדות תאים והתפתחות פיברובלסטים נצפו בתוך 48 שעות מהמעבר בבקבוקי תרבית קטנים וגדולים. כאשר בקבוקים שזרעו לאחרונה הופרו, נצפתה ירידה בהיצמדות התאים, שהובילה לתרביות בעלות קצב גדילה איטי יותר ולעתים להיעדר היצמדות או גדילה.התאים הגיעו לכ-80% התלכדות (confluency) בתוך שבוע אחד ויצרו שכבה אחת (monolayer) בתוך 10 עד 14 ימים. תרביות שהודבקו הראו סימנים לדעיכה בשלמות צורת התא, וחורים גדולים לכאורה נצפו על פני התאים 48 שעות לאחר ההדבקה. התאים התכווצו והסתלקו ממשטח התרבית כ-72 עד 96 שעות לאחר הדבקה ב-HOCV-one ללא דילול. מספר התאים החיים הממוצעK plotted כדי לתאר הבדלים בשפע התאים החיים בין עומסים ויראליים שונים לאורך זמן. קבוצות הטיפול במינון ויראלי גבוה יותר הראו ירידה בולטת הרבה יותר בבריאות התרבית, עם צניחה משמעותית במספר התאים החיים בין 48 ל-72 שעות. לעומת זאת, הקבוצות עם המינון הוויראלי הנמוך דעכו לאט עד שנצפתה ירידה סביב 144 שעות. הסבירות להישרדות של תאים שהוחדרו במינונים ויראליים גבוהים יותר הייתה נמוכה יותר כפי שנבדק באמצעות עקומות קפלן-מאייר (Kaplan Meyer), ממצא התואם את ניתוחי מספר התאים החיים הממוצע. למרות שאינו מובהק, המידע מרמז כי תאים שנחשפו לנגיף הם בעלי סבירות גבוהה ב-88% להפגין שיעורי הישרדות נמוכים יותר לאורך זמן. הדעיכה במספר הגרעינים הנוכחים, כמו גם המראה המעוות של f-actin בתאים שנחשפו ל-HOCV-one, מעידים על השפעה משמעותית על התרבית.תאי בריאות שנחשפו לעומס ויראלי גבוה יותר, עד פי 10, הראו מצוקה רבה יותר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשלים כל שלב בפרוטוקול בלוח זמנים מדויק, שכן חלק מהשלבים רגישים לזמן ולטמפרטורה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון ELISA כדי לענות על שאלות מפתח, למשל, כמה נגיף נמצא בתרבית תאים לאחר שמוחדרות לתהליך כמויות משתנות של נגיף? לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בשורת תאי חרקים כדי לשכפל נגיף RNA, להוציא את הנגיף ולאחר מכן לכמת אותו באמצעות qRT-PCR.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים זיהום ויראלי ויוו דרוזופילה melanogaster באמצעות שיטת ננו-הזרקת טכניקות בסיסיות כדי לנתח וירוס-פונדקאי אינטראקציה.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

מתוארים כאן היא שיטה יעילה כיצד לייצר מניות סיכוייו גבוהה ויראלי של וירוס הפטיטיס E (האוהב) כדי להדביק ביעילות תאים hepatoma. עם השיטה המוצגת, הן לא מעטפת, כמו גם חלקיקים ויראלי מעטוף ניתן לקצור ומשמש לצורך הצגת קווי תאים שונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

למדו כיצד לשכפל את נגיף HoCV-1 בתרביות תאים של Homalodisca vitripennis ולהפיק RNA לכימות באמצעות qRT-PCR. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקה ויראלית ואינטראקציות מארח-נגיף בצורה יעילה וכלכלית.

רביה של

גלה סרטונים נוספים