Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר באופן אמין THP אנושי מקרופאגים אחד עם כדאיות תאים גבוהה וללא הפעלת תאים. זה מושג על ידי הבחנה מוקדמת של THP אחד מונוציטים למשך 48 שעות. השלב השני של ההליך הוא ניתוק המקרופאגים המוקדמים של TP one.

השלב השלישי הוא להעביר את התאים עם IRNA או DNA פלסמיד, באמצעות טכנולוגיית גורם הגרעין של לונזה. השלבים האחרונים הם לזרוע מחדש ולהבדיל עוד יותר את התאים. בסופו של דבר, ניתן להראות הפלה או ביטוי יתר מוצלחים של גנים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת, כתם מערבי לאחור וכן הלאה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לגישות טרנספקציה אחרות כגון ליפופקציה, הוא שאנו יכולים להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יחד עם כדאיות תאים גבוהה, ואיננו משנים את תפקוד והתנהגות המיקרופאג'ים. למרבה הצער, טכניקה זו אינה מתאימה ליישומי הספק גבוה מכיוון שלא ניתן לבצע טרנספקט אינטנסיבי יותר בכל פעם עבור פרוטוקול זה. תרבית תאי THP אחד ב-RPMI 1640 עם 10% FCS ועם 1% סטרפטוקוקוס L גלוטמין 24 שעות לפני הטרנספקציה פיצלו את התאים וספקו להם מדיה טרייה.

למחרת. יש להבדיל מראש את התאים על ידי זריעת 10 עד 15 מיליון תאים בבקבוק רקמה בגודל 75 סנטימטר רבוע עם התוספות הבאות למדיום ה-RPMI המתווסף, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% נתרן פירובאט, 10 ננוגרם למיליליטר, PMA ו-50 מיקרו-מולרי בטא מרקפטואתנול לאחר 48 שעות, שואבים את המדיה ומחליפים אותה בשישה מיליליטר אקוטן. אחד התחמם ל-37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.

דגרו אותם למשך 30 דקות במהלך הדגירה. הכן מדיום טרנספקציה מספיק ומדיום טיפוח לטיפול בחיבה פוסט-נוקלאו של התאים. לאחר 30 דקות, בדוק שהתאים מנותקים והסתכל סביב.

אם חלק מהתאים עדיין מחוברים, שאבו בעדינות את הבקבוק עם מיקרו פיפטה או השתמשו בתסיסה פשוטה כדי לנתק אותם. אל תשתמש במגרד. העבירו את התרחיף לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם למשך חמש דקות ב-300 גרם ובטמפרטורת החדר, הסירו את הסופרנטנט על ידי שאיפה והשעו מחדש את כדור התא.

במיליליטר אחד של RPMI, בינוני לפני התחממות עד 37 מעלות צלזיוס, סופרים את התאים ויוצרים צינורות אשפה מיקרו המכילים שניים עד שניים וחצי מיליון תאים להעברה מיידית. ביצוע מהיר של פרוטוקול זה הוא חיוני. כדי למנוע אובדן תמותה של תאים, הקפד להכין את כל החומרים מראש צנטריפוגה ראשונה, כל הטרנספקציה מבצעת למשך 10 דקות ב-250 GS ובטמפרטורת החדר בזמן שהם מסתובבים מטה, טען את כל הווטרינרים של אפקטור הגרעין בחצי מיקרוגרם של DNA פלסמיד או מיקרוגרם אחד של SI RNA השתמש בדילול מרוכז מאוד כך שהם תופסים נפח מינימלי של הווטרינר.

כעת שאפו את הסופרנטנט רק מאחד מהתאים. השעו את התאים ל-100 מיקרוליטר בתמיסת גורם גרעין. אל תתנו לתאים להישאר חשופים לתמיסה יותר מ -15 דקות.

העבירו את התאים לווטרינר Q וערבבו אותם עם הקשה עדינה. לאחר מכן העבר את התאים באמצעות תוכנית Y 0 0 1 על מודל שני גורם גרעין B. בעזרת פיפטה חד פעמית, העבירו את התאים החשמליים לבקבוקון תגובה והוסיפו מיד חצי מיליליטר של מדיום טרנספקציה שהוזהר מראש לתאים.

כעת המשיכו לחזור על התהליך עם כל כמות תאים בזה אחר זה עד שכולם עוברים. לאחר השלמת חיבת הגרעין, העבירו כל טרנספקציה של תאים לבאר של צלחת שש בארות עם 2.5 מיליליטר של אמצעי טרנספקציה חמים. מערבבים היטב כל אחד היטב עם מיקרו פיפטה.

לאחר שנתנו לכל הצלחות העמוסות לדגור במשך ארבע שעות, בדקו את מצב התאים במיקרוסקופ. לאחר ארבע שעות, יש להדביק את רוב התאים לצלחת במידת הצורך. לכל היותר.

שעה נוספת של דגירה תספק מספיק סאהה שעובד באר אחת בכל פעם. שאפו את מדיום הטרנספקציה מהתאים הדבוקים והחליפו אותו בנפח שווה של מדיום גידול חם. היזהר להימנע מניתוק התאים במהלך שלב זה.

כעת, דגרו על התאים כל עוד יש צורך. במידת הצורך, החלף את המדיה כל 48 שעות תכנן ליישם טיפולים כך שהם יסתיימו כאשר ה-DNA או ה-RNA הטרנספטנטי נמצא בשיא השפעתו. בעת טיפול בתאים עם אפקטורים, השתמש במדיום נטול סרום ללא PMA וללא בטא מרקפטואתנול.

היזהר לא לתת לתאים לדגור יותר מ-24 שעות ללא סרום. הפרוטוקול שימש לטרנספטקט, הוערך THP אחד מקרופאגים עם מורפולוגיה תאית של IRNA. על פי מדידה ציטומטרית זרימה.

שיעור האפופטוזיס והנמק בתאים היה נמוך הן בתרביות טרנספטציה והן בתרביות ביקורת. עם זאת, ספירה זהירה גילתה שגם האפופטוזיס וגם הנמק היו מעט גבוהים יותר עבור הדגימות שהועברו. ייתכן שהסיבה לכך היא שמקרופאגים THP 1 שעברו טרנספטציה היו קשים יותר לניתוק מלוחות מאשר תאים שעברו טרנספטציה של UNT.

בסך הכל, שיעורי הטרנספקציה היו מעל 90% כפי שנותח על ידי ציטומטריית זרימה. שימוש ב-S-I-R-N-A פלואורסצנטי יעילות טרנספקציה אושרה גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הפונקציונליות של הטרנספקציה הוכחה על ידי חיסול גנטי של ביטוי IL 10 RB.

שימוש ב-RNA מפריע קצר לאחר השליטה, ניתן לבצע את הטרנספקט תוך שעה עד שעה וחצי אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלמדיום התרבות יש השפעה ניכרת על הביצועים. זה מתואר בפרוטוקול הטקסט.