Name: ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: חקור נדידת תאים במטריקס קולגן תלת ממדי באמצעות מיקרוסקופיית וידאו ומעקב ממוחשב. שיטה זו מאפשרת לחקור גורמים המסדירים נדידת תאי סרטן ותאים נורמליים לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן פריץ-בנדר, מינכן, גרמניה

.1 הכנת לשכות הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי פרפין / נפט (1: 1) לערבב וחום עד לקבלת התערובת נמס. שימוש במכחולים ולצייר 2-3 שכבות של ריבת פרפין / הנפט (1: 1) מערבב באמצע שקופית הזכוכית בהתאם לדמויות 1B-1D. הערה: אנו משתמשים בשקופיות זכוכית נפוצות (76 x 26 x 1.0-1.5 מ&quot;מ (W / D / H)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תערובת ג&#39;לי פרפין / נפט נמסה במהירות בשקופית הזכוכית, כדי למנוע התמצקות תוך כדי ציור. להבטיח את שכבת ג&#39;לי פרפין / נפט היא על 2-2.5 סנטימטר באורך ו0.3-0.5 סנטימטר ברוחב. עובי שכבת ג&#39;לי פרפין / הנפט צריך להיות על .1-0.15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip לפרפין הקרושה / תערובת וזלין ולאטום אותו עם שניים עד שלוש שכבות (1E דמויות, 1F) פרפין תערובת ג&#39;לי שעווה / נפט. השתמש 4-8 תאי הגירה לניסוי נדידת תאים נפוצים. תאי הגירת מקום in תנוחה זקופה במעמד. </li></ol> 2 הכנת Mix תא ההשעיה קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר (לדוגמא, עם 0.25% טריפסין / EDTA) ולספור תאים של עניין. Resuspend תאי תקשורת מלאה המכילה עוברי עגל בסרום (FCS), אנטיביוטיקה ומומלצת תוספים. הכן 4-8 1.5 מ&quot;ל צינורות תגובה ו20 השעיה תא μl המכילה 4-6 x 10 4 תאים (המספר הכולל של תאים תלוי בסוג התא להיות מנותח) ולמלא עד 50 μl עם תקשורת מלאה. הערה: תרכובות נוספות (לדוגמא, גורמי גדילה, כמוקינים, מעכבים, וכו &#39;) מתווספות להשעית התא. השתמש בפתרוני המלאי מתאימים כך שהנפח הסופי של השעיה תא אינו עולה על 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סכום כולל של 452 השעיה קולגן הסופית μl לארבעה ניסויי נדידת תאים. הוסף 50 μl 10x MEM (pH 5.1-5.5) ו27 μl של .7.5% פתרון סודיום ביקרבונט (pH 9.0-9.5) לצינור תגובה 1.5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. שים לב לתורו בצבע פתרון מצהוב כתומה לסגול העז (pH 9.0-9.5). הוסף השעיה קולגן 375 μl נוזל ל10x ממ / פתרון סודיום ביקרבונט ומערבבים היטב. PH של ההשעיה קולגן הסופית צריך להיות על 7.5 (מסומן בצבע סגול בהיר). הערה: בדוק את pH של תמיסת סודיום ביקרבונט 7.5%. אם pH הוא כ 7.5 מקום פתרון סודיום ביקרבונט עם מכסה פתוח בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) להיות רווי עם CO 2 ולהגדיל את רמת החומציות (כ 9.0-9.5). PH של תערובת תא ההשעיה קולגן הוא חיוני ליציבות של רשת קולגן. אם זה נמוך מדי סריג קולגן יקרוס במהלך ניסוי נדידת תאים. הערה: לקבלת פרוטוקול זה, להשתמש בקולגן הנוזלי (pH 1.9-2.2) מאחורי שור (2.9-3.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קולגן, 95% קולגן סוג I, 5% IV סוג קולגן). דוגמאות לפרוטוקולי הכנת סריג קולגן נוסף באמצעותסוג אני קולגן ממקורות אחרים, כגון חזירי או עכברוש, ניתנים ב32,33. אין לשנות את הכרכים של הפתרונות המשמשים כזה ישנה את ריכוז קולגן האולטימטיבי של 1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של הסריג. יש ריכוז קולגן גבוה יותר או נמוך יותר השפעה על הצפיפות של סיבי קולגן והמרחק ביניהם הממוצע במקביל לתאי התנהגות 34 נודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של ההשעיה קולגן הסופית להשעיה תא 50 μl 100 μl ולערבב thoroughly.The השעיה סופית קולגן (1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קולגן) היא מעט צמיגה. כדי להעביר את הסכום הנכון (100 μl), פיפטה פתרון קולגן הסופי פעם אחת למעלה ולמטה לפני העברתה להשעית התא. הערה: ברגע שתערובת תא ההשעיה קולגן בשילוב עם פתרון 10x ממ / סודיום ביקרבונט וערך pH השתנה ל7.5 סיבי קולגן מייד להתחיל לפלמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת תא הסופית ההשעיה קולגן מהצינורות תגובת דואר לתאי ההגירה. לטפוח בעדינות את תא ההגירה לחלק באופן שווה את תערובת תא ההשעיה קולגן בחלק התחתון של חדר ההגירה (איור 1H). מניחים את תאי ההגירה בתנוחה זקופה במעמד ודגירה על 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר פילמור של סיבי קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שסריג קולגן polymerized הוא מעט עכור, אבל עדיין להיות בצבע סגול בהיר. למלא את תאי הגירה עם מדיום מלא או בינוני מלא עם תוספים של עניין ולאטום את חדר ההגירה עם תערובת ג&#39;לי פרפין / נפט (איורים 1 ט, י 1). </li></ol> .3 הקלטה וניתוח של נדידת תאים סעיף זה מתאר את ההקלטה של ​​נדידת תאים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות וידאו וניתוח של נדידת תאים על ידי מעקב סלולארי מדריך ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ וחימום הבמה מיקרוסקופter. כוון את הטמפרטורה ל37 C °. השתמש אובייקטיבי 10X. הנח תא הגירה תחת מיקרוסקופ ולהתמקד 50 כ תאים או יותר בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירה רשומה תא במצב הזמן לשגות באמצעות תוכנת מעקב וידאו מרובה מצלמה. לשמור סרטי נדידת תאים בפורמט מתאים, למשל, &quot;* אבי&quot; או &quot;.mov *&quot;. קישור קבצי סרט נדידת תאים למאגר מידע המכיל מידע תומך, כגון סוג תא ותנאי ניסוי. הערה: אנו מקליטים לימפוציטים וHSPCs עד שעה 2 באמצעות גורם הזמן לשגות של 1:80, מה שאומר ש0.75 שניות בזמן לשגות שווה ל1 דקות בזמן אמת. תאי גידול הם תאים שנעו לאט ולכן נרשמו לפחות 16 שעות באמצעות גורם הזמן לשגות של 1: 1,800 (0.5 שניות בזמן לשגות שווה ל15 דקות בזמן אמת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח סרטי נדידת תאים באמצעות יישום מתאים מעקב תא תוכנה, כמו תוספי תוכנת ImageJ(סקירה כללית ניתן ב18). לניתוח בלתי מוטה זה הוא בעל חשיבות מכרעת כי תאים ייבחרו באופן אקראי ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים או לא. הערה: אנו משתמשים ביישום תוכנה מפיתוח עצמי כדי לעקוב באופן ידני את הנתיבים של לפחות 30 תאים לכל ניסוי על ידי ביצוע התאים נעו בצורה מדויקת עם סמן העכבר (שממוקם לגרעין). תוך מעקב, xy-הקואורדינטות של התאים עליהם המעקב באופן אוטומטי שנקבעו בהתאם למצב בזמן לשגות בשימוש. לימפוציטים מסוג xy-קואורדינטות / HSPCs נקבעות כל שניה 0.75 (שווה בזמן אמת 1 דקות), ואילו לתאי גידול xy-הקואורדינטות נקבעות כל שניה 0.5 (שווה לזמן אמת 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כולל של 60 xy-קואורדינטות לכל תא לניסוי נדידת תאים טיפוסי. זה שווה לשעה 1 בזמן אמת לימפוציטים / HSPCs ו15 שעה בזמן אמת לתאים סרטניים. &quot;,&quot; מצביע על כך שתא לא זז בין two נקודות זמן, ואילו &quot;ערך מספרי&quot; מציין את המרחק ב&quot; פיקסלים &quot;תא עבר בין 2 נקודות זמן (איור 2 א). הערה: מעקב תא ידני דורש ניסיון. במיוחד תאים מהירים נודדים קשים לעקוב וכל תערוכת סוג תא התנהגות נדידה שונה שעשויים להיות מופעלת על ידי גורמים בתוספת. במקרה של חלוקת תא תוך מעקב, באופן אקראי לבחור תא בת אחת להמשך מעקב. תאים שנודדים אל מחוץ לשדה הראייה או למות תוך מעקב אינו מוזנח, אך נחשבים לניתוח. </li></ol> ניתוח .4 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתוני מעקב תא באמצעות יישום מתאים תוכנה, למשל, תוכנת גיליונות אלקטרוניים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתוני מעקב תא על ידי העתקת תא מעקב נתונים גולמיים (איור 2 א), לתבנית של גיליון אלקטרוני בעיצוב עצמי. להכפיל סכום של &quot;הערכים המספריים&quot;, המייצג אתהמרחק הכולל של תאים שנדדו עם גורם תיקון להמיר &quot;פיקסל&quot; לתוך &quot;מיקרומטר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע שני פרמטרים נדידת תאים: פעילות locomotory (שהוא שווה ערך לשיעור הגירה) ושעה של תנועה אקטיבית (2C דמויות, 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את התאים שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר (רמת סף כדי לצמצם את מספרם של תאים חיוביים שגויים) כתאים שאינם זז. החלף את &quot;ערכים מספריים&quot; של תאים אלה עם &quot;,&quot;. הערה: הפרמטר (או שיעור הגירה) &quot;פעילות locomotory&quot; מייצגת את אחוז התאים של אוכלוסיית תאי מעקב שנעו בין שתי נקודות זמן (איור 2 ד). &quot;ערך מספרי&quot; מוגדר כתא מרגש, ואילו &quot;,&quot; מוגדר כתא שאינו זז. הפרמטר &quot;הזמן של תנועה פעילה&quot; (זמן פעיל) מייצג את אחוז הזמן הכולל תא הגר מחדשויסות למסגרת של תקופת התצפית (איור 2 ג) הזמן. &quot;ערך מספרי&quot; מצביע על כך שתא עבר, ואילו &quot;,&quot; מצביע על כך שתא לא זז. פרמטר זה נמצא בשימוש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שלא עברו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מובהקות סטטיסטיות ונתונים נדידת תאי תצוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מובהקות סטטיסטיות של פעילות locomotory הממוצעת של התאים (שיעור ההגירה) באמצעות מבחן Mann-Whitney U. שקול p-value &lt;0.05 משמעותיים כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את פעילות locomotory הממוצעת של תאים כxy-תרשים, תרשים BoxPlot, או כתרשים תרשים בר. להציג נתונים יחידים המבוסס על תאים, כגון זמן של תנועה או מהירות פעילה, כתרשים תרשים בר או כמו היסטוגרמה. הערה: אם יישום תוכנת גיליון אלקטרוני שנבחר אינו מכיל כלי תרשים או תרשים היסטוגרמה BoxPlot חיפוש מקוון יש לבצע למחפש tu המתאיםtorials. </li></ol></li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים סרטניים 4. ללא היכולת להתנתק מהגידול הראשוני ולנדוד דרך תאי גידול רקמות חיבור שמסביב לא תוכל זרע נגעים משניים, המהווים את הגורם העיקרי למותם של כמעט כל חולי הסרטן. בגלל הקשר הזה מחקרים רבים מתמקדים בנדידת תאי הסרטן. המטרה של מחקרים אלה היא זיהוי של מולקולות רומן יעד ומסלולי יעד ביעילות לחסום נדידת תאים סרטניים, ובכך לפגוע או להאט את ההיווצרות גרורה. דוגמא למאמץ כזה יכול להיות β-חוסמי, אשר הוכחו לעכב גרורתי התפשטות תאי סרטן השד במב...

<html> כמו איחוי תאים (לסקירה לראות 1,2) נדידת תאים היא תופעה ביולוגית אחרת, כי הוא מעורב בשפע של תהליכים פיסיולוגיים כוללים התפתחות עוברית, לריפוי פצעים ותגובה חיסונית (לסקירה ראה 3). עם זאת, היכולת להעביר גם תנאי מוקדם לתאים סרטניים לשלוח גרורות (לסקירה ראה 3,4). נדידת תאים היא מורכבת, עדיין לא הבין באופן מלא תהליך שמנוהל על ידי יחסי הגומלין של מספר מסלולי העברת אותות ביוזמת יגנד השונים (למשל, ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, הורמונים, רכיבי מטריצה ​​תאיים) קולטן (למשל, טירוזין קינאז רצפטור, קולטנים chemokine, integrins) אינטראקציות 5 סופו של דבר גורמים לארגון מחדש של שלד התא במקביל אקטין עם דה והרכבה מחדש של מתחמי הידבקות מוקד וintegrin בתיווך איתות 6. = &quot;Jove_content&quot; של&gt; כדי לנתח תא הגירה כמה במבחנה ובמבחני נדידת תאי vivo פותחו בעשורים האחרונים, ובכלל זה assay התא / transwell בוידן 7, assay / פצע שריטה ריפוי assay 8-10, תלת ממדים ( 3D) assay מטריצת הקולגן הגירת 11 כמו גם הדמיה / מיקרוסקופיה intravital (לסקירה ראה 12). לכל אחד ממבחני נדידת תאים אלה יתרונות וחסרונות, לדוגמא, עלויות הנוגעות וצורך של ציוד, טיפול או לאמינות של הנתונים שהתקבלו. שתי קאמרי / assay transwell בוידן וassay השריטה / assay ריפוי הפצע הם, בעלות נמוכה קלה ומבחנים מפותחים למדוד נדידת תאים במבחנה 7-10. בתא בוידן / transwell תאי assay הם זורעים על גבי נקבוביות להכניס מכילים (כ 8 מיקרומטר קוטר) - העליון התא שנקרא 7. אופציונאלי, להוסיף יכול להיות מצופה עם מ תאירכיבי Atrix, למשל, פיברונקטין, קולגן, וכו &#39;, כדי לחקות את הסביבה פיזיולוגית יותר. כמו כן, תאי האנדותל ניתן יהיו לגדל על גבי העלון, ובכך מחקה את מחסום תא האנדותל 13. תאים אלה שעברו את הנקבוביות במרווח זמן שהוגדר לתא התחתון מחסה תקשורת ותוספים, כגון גורמי גדילה וכמוקינים, משמשים כקריאה החוצה לכמת נדידת תאים (או extravasation). בassay השריטה / פצע תאי assay ריפוי הם זורעים בצלחות וגדלים לconfluency 10. בתלות של צלחות הגדרה הניסיוניות ניתן מראש מצופה עם רכיבי מטריצה ​​תאיים, כגון פיברונקטין. לאחר יצירת שריטה / פצע על ידי גירוד התאים בודדים monolayer תא מכל צד של השריטה / פצע יכול לנדוד לתוך הפער, ובכך ממלא / ריפוי זה 10. המרחק בין שני הצדדים של השריטה / פצעים נקבעבתלות של זמן ומשמש כקריאה החוצה לפעילות הנדידה של התאים 10. עם זאת, להבחין בין התפשטות תאים (שגם עלולה לגרום למילוי / ריפוי של השריטה / פצע) ונדידת תאים מומלץ לשלב את assay עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו ותא בודד מעקב 10. עם זאת, שניהם קאמרי בוידן / assay transwell וassay / פצע שריטה ריפוי assay, הוא די מושלמים הנוגע לסביבה סלולרית פיזיולוגית דמוית. בתא בוידן / תאי assay transwell צריכים להעביר דרך נקבובית פלסטיק, ואילו בשריטת assay / ריפוי פצע תאי assay הם זורעים על צלחת פלסטיק מצופה מראש דו ממדים. כמו כן, הוא מוכר היטב שהתנהגות הנדידה שונה במידה ניכרת בין סביבה דו ממדית ו3D 3. למשל, הידבקויות תלת ממדי מטריצה ​​של fibroblasts שונים מהידבקויות מוקד ופיברילציה מאופיינות בשנימצעי -dimensional בתוכנם של α5β1 וintegrins αvβ3, paxillin, רכיבי cytoskeletal אחרים, וזרחון טירוזין קינאז של הידבקות מוקד 14. כמו כן, תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D מוצגים גם התנהגות נדידה שינה 15. כך לנתח נדידת תאים בצורה מדויקת יותר assay הגירה מומלץ מאפשר למדוד את ההגירה של תאים בודדים בתוך סביבה פיזיולוגית או דמוית פיזיולוגית 3D. ההדמיה / מיקרוסקופיה Intravital היא הזהב סטנדרטי למדידת נדידת תאים בהקשר פיסיולוגי 3D. זה רק שאינו שייך לאינטראקציות מטריצת תאים תאיים, אלא גם ליחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים, כגון תאים סרטניים ותאי האנדותל במהלך extravasation 16 או סחר הלימפוציטים בתוך הבלוטה לימפה 17, אשר, למועד, הוא אפשרי בשל טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משופרות, כגון 2-פוטוןמיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר, השימוש בצבעים חיוניים ניאון וזני עכבר מהונדסים מבטא נגזרי חלבוני ניאון 12,16,17. בנוסף, הדמיה / מיקרוסקופיה intravital יכולה להיות משולבת עם תא ידני ואוטומטי מעקב 18. עם זאת, בשל הצורך של מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal 2 פוטונים, כמו גם בעלי החיים (ומודלים של בעלי חיים מהונדסים מתאימים) הדמיה / מיקרוסקופיה intravital היא טכניקה ולא עלות אינטנסיבית. כדי להתגבר על המגבלות של החדר / assay transwell בוידן וassay ריפוי assay / פצע שריטה ולנתח את ההגירה של סוגי תאים שונים בתוך סביבת 3D assay הגירת מטריצת קולגן 3D פותח 11,19. ובכך, תאים נודדים מוטבעים בתוך רשת קולגן סיבי 3D, אשר מזכיר יותר לin vivo מצב. בצמדים, בשל נדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדד מאפשר determiאומה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים ולויקוציטים 11,20, גזע hematopoietic / תאי אב 21-24, ותאי גידול 5,25-29. בנוסף לתאים בודדים גם תא אשכולות או spheroids יכול להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לקולגן סריג 30,31. פרוטוקול זה מציג סקירה על טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של בסביבת 3D - שיטה במבחנה מניב בתוצאות שאינן קרובים למצב in vivo.

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL מיקרוסקופ הפוך</td><td>Leica, Wetzlar, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחמם שלב מיקרוסקופ</td><td>Distelkamp Electronic, קייזרסלאוטרן, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 מצלמת וידאו</td><td>JVC, באד וילבל, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שרת וידאו ציר 241Q</td><td>תקשורת ציר GmbH, Ismaning, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחשב Mac G5 אפל</td><td>מקינטוש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&szlig; heim, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מעקב וידאו מרובת מצלמות (מרגל אבטחה)</td><td>Bensoftware, לונדון, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., אדינבורו, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, דרמשטדט, גרמניה</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי נפט</td><td>בית מרקחת</td><td></td><td></td>מקומי</tr><tr><td>Purecol (קולגן נוזלי)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, הולנד</td><td></td><td>מכיל 2.9 - 3.3 מ"ג/מ"ל קולגן בקר (95% קולגן מסוג I, 5% קולגן מסוג IV)</td></tr> <tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5%</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, דרמשטדט, גרמניה</td><td>662035</td><td>להתמוסס תחילה ב-CHCl3; להרכיב מחדש ב-DMSO ממש לפני השימוש</td></tr></tbody></table>

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים מסוגים שונים וממלא תפקיד מכריע במספר תהליכים פיסיולוגיים, הכוללים התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, ואת תגובה חיסונית. עם זאת, נדידת תאים היא גם מנגנון מפתח בסרטן מאפשר לתאי הסרטן אלה להתנתק מהגידול הראשוני להתחיל גרורתי מתפשט. בתוך השנים האחרונות מבחני נדידת תאים שונים פותחו כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של. בגלל התנהגות locomotory של תאים שונים במידה ניכרת בין שני ממדים (2D) וזה הסביבה תלת ממדי (3D) ניתן להניח כי הניתוח של ההגירה של תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D יניב בנדידת תאים משמעותית יותר נתונים. היתרון של assay ההגירה תאר 3D מטריקס קולגן הוא שתאים מוטבעים בתוך רשת 3D פיזיולוגית של סיבי קולגן המייצגים את המרכיב העיקרי של מטריקס. בשלנדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדדת מאפשרת הקביעה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים / לויקוציטים, תאי גזע, ותאים סרטניים. כמו כן, גם צבירי תאים או spheroids יכולים להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לסריג קולגן. אנו מסיקים כי assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא שיטה תכליתית כדי לנתח את ההגירה של תאים בתוך סביבת 3D פיזיולוגית דמוית.

Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן המשמש בשילוב עם הזמן לשגות וידאו מיקרוסקופיה ומעקב תא בעזרת מחשב מאפשר לקביעת פרמטרים שונים נדידת תאים כוללים גם פרמטר המבוסס על האוכלוסייה (למשל, אומר שפעילות locomotory) ופרמטרים המבוסס על תא בודדים (לדוגמא, זמן של פעיל תנועה, מהירות, מרחק היגר). דוגמא לסטים שהושגו מעקב תא נתונים, עיבוד נתונים והצגת הנתונים מובאות באיור 2. תא מעקב קובץ נתונים דומה שולחן (איור 2 א). כל עמודה מייצגת תא מעקב אחד, לפיה ל...

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את התנהגות הנדידה של תאים בסביבה התלת מימדית. ראשית, הטמיעו את התאים המעניינים בסריג קולגן תלת מימדי. לאחר מכן הקלט את תנועת התאים על ידי מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse לאחר מכן, תאר את פרמטרי ההגירה על ידי מעקב אחר תאים בעזרת מחשב ונתח את נתוני המעקב אחר התאים באמצעות יישום תוכנת גיליון אלקטרוני.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור אילו גורמים ומסלולי העברת אותות מווסתים את הנדידה של תאים סרטניים או תאים נורמליים כמו לויקוציטים, לימפוציטים ותאי גזע בהקשר של סרטן. כך שידע על נדידת תאים, גורמים מווסתים ומסלולי העברת אותות קשורים עשוי להועיל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לפגיעה בנדידת תאי הגידול והתפשטות גרורתית. עבור תאי הנדידה מברישים במהירות שתי שכבות של שעוות פרפין מומסת, תערובת ג'לי נפט לאמצע שקופית זכוכית, מוסיפים כיסוי, מחליקים ואוטמים בשתי שכבות של שעוות הפרפין, תערובת ג'לי נפט.לאחר מכן הניחו את תאי הנדידה במצב זקוף במתלה לצינורות תגובה של 1.5 מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטר מתרחיף התאים לתרחיף הקולגן. שלב 50 מיקרוליטר של 10 XMEM ו -27 מיקרוליטר של 7.5% תמיסת נתרן ביקרבונט מערבבים היטב.לאחר מכן הוסיפו 375 מיקרוליטר של תרחיף קולגן נוזלי וערבבו היטב לקבלת צבע סגול בהיר המעיד על pH של 7.5. כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר מתרחיף הקולגן הסופי ל-50 מיקרוליטר של תרחיף התאים וערבבו היטב תוך ציון התחלת סיבי הקולגן. פילמור. ב-pH 7.5, העבירו את התערובת לתאי הנדידה.הקש בעדינות על תא הנדידה כדי לפזר באופן שווה את תערובת תאי תרחיף הקולגן בתחתית תא שרשרת הנדידה. הניחו את תאי הנדידה במצב זקוף במתלה ודגרו למשך 30 דקות. כאשר סריג הקולגן הפולימרי עכור מעט, אך עדיין בצבע סגול בהיר, מלאו את תאי הנדידה במדיום המתאים ואטמו את תא הנדידה בשעוות פרפין.תערובת ג'לי נפט. כוונן את מחמם שלב המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות הגדלה של פי 10 בתא הנדידה. התמקד בכ- 50 תאים או יותר בשדה הראייה.הקלט את נדידת התאים במצב זמן-lapse באמצעות יישום תוכנת מעקב וידאו מרובת מצלמות. שמור את סרטי העברת התאים בפורמט קובץ מתאים. קשר את קבצי סרט העברת התאים למסד נתונים המכיל מידע תומך כגון סוג תא ותנאי ניסוי.לאחר מכן, נתח את סרטי נדידת התאים באמצעות יישום תוכנה מתאים למעקב אחר תאים לניתוח חסר פניות. בחר באופן אקראי את התאים לניתוח ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים בסך הכל, קבע כ-60 קואורדינטות XY לתא בניסוי נדידת תאים טיפוסי. במקרה של חלוקת תאים, בחר באופן אקראי תא בת אחד לעקוב אחריו במעקב.נתח נתוני מעקב אחר תאים באמצעות יישום תוכנה מתאים כגון תוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המרחק הכולל שהתא עבר. הכפל את סכום ערכי הפיקסלים המספריים במקדם תיקון להמרה למיקרונים. הגדר את התאים שנדדו פחות מסף 25 מיקרון כתאים שאינם נעים, והחלף את הערכים המספריים בפסיק.לאחר מכן, חשב את הפעילות התנועתית כאחוז מהתאים של אוכלוסיית התאים במעקב שנעו בין שתי נקודות זמן. כמו כן, חשב את זמן התנועה הפעילה כאחוז מהזמן הכולל שתא נדד ביחס למסגרת הזמן של תקופת התצפית. לאחר מכן חשב את המובהקות הסטטיסטית באמצעות מבחן man Whitney U והצג את נתוני נדידת התאים.קובץ נתונים טיפוסי למעקב אחר תאים דומה לטבלה שבה כל עמודה מייצגת תא אחד במעקב. השורות מכילות את המידע המיקומי על תנועת התאים. עם הזמן, ניתן לאפיין את התנהגות התנועה של התאים על ידי הפעילות התנועתית הממוצעת של אוכלוסיית התאים המנותחת וגם על ידי זמן התנועה הפעילה.דוגמה זו מציגה את פעילויות הנדידה של 120 תאים מארבעה ניסויים עצמאיים. כל יהלום מציין שתא נע בין שתי נקודות זמן לפחות. הקווים האפורים מבדילים בין התאים הנעים והלא נעים.ניתן להציג את הפרמטר של פעילות הקטר כדיאגרמת XY או כתרשים תיבה. כדי לדמיין את הדינמיקה של אוכלוסיית התאים המנותחת, היסטוגרמה מציגה ביעילות את זמן הפעילות של אותם תאים. ניתוח זה של התנהגות הנדידה של קווי תאי סרטן השד MDA HER2 ו-M-D-A-N-E-O מצביע על כך ששני קווי התאים הפגינו פעילות תנועתית ספונטנית דומה.זמן הפעילות של הפרמטר חשף מספר מעט גבוה יותר של תאי M-D-A-H-E-R הנעים באופן ספונטני בהשוואה לתאי סרטן השד M-D-A-N-O. גירוי עם 100 ננוגרם למיליליטר של EGF הביא לעלייה משמעותית בפעילות הנדידה של MDA HER2 כפי שנמדד על ידי מספר התאים הנעים וזמן התנועה הפעילה. מעניין שתאי M-D-A-N-E-O נדדו בתגובה לגירוי EGF והציגו דפוס פעיל בזמן שינוי טיפול עם מעכב פוספוליפאז c גמא אחד uc 3 1 22 הפחית הן את הנדידה הספונטנית והן את ה-EGF הן של M-D-E-E-R 2 והן של MDAN.תאי EEO. ניתוח פרמטר הזמן הפעיל גילה כי טיפול בתאי EEO של MDAN עם שני מיקרומולר של U 7 3 1 2 2 הביא לירידה ניכרת בפעילות התנועה, המיוחסת בעיקר לכמות מוגברת של תאים שאינם נעים. לאחר שליטה, ניתן לרשום את ההגירה של לימפוציטים ולויקוציטים לקולגן תלת מימדי, ניתן לרשום אותיות ו-ment תוך כשעתיים, שם תאי הגידול נרשמים בן לילה.

analysis-of-cell-migration-within-a-three-dimensional-collagen-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה מתוארת להכנת מטריצה ​​3-ממדית המורכבת מסוג קולגן אני ופיברובלסטים אנושיים ראשוניים. ג'ל organotypic זה משמש כמצע שימושי להעריך נדידת תאים פולשניים כי זה מחק את התכונות בסיסיות של הרקמה סטרומה והוא נוח לצורות רבות של מיקרוסקופיה.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה ​​מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

חקור נדידת תאים במטריקס קולגן תלת ממדי באמצעות מיקרוסקופיית וידאו ומעקב ממוחשב. שיטה זו מאפשרת לחקור גורמים המסדירים נדידת תאי סרטן ותאים נורמליים לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

גלה סרטונים נוספים