ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את התנהגות הנדידה של תאים בסביבה התלת מימדית. ראשית, הטמיעו את התאים המעניינים בסריג קולגן תלת מימדי. לאחר מכן הקלט את תנועת התאים על ידי מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse לאחר מכן, תאר את פרמטרי ההגירה על ידי מעקב אחר תאים בעזרת מחשב ונתח את נתוני המעקב אחר התאים באמצעות יישום תוכנת גיליון אלקטרוני.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור אילו גורמים ומסלולי העברת אותות מווסתים את הנדידה של תאים סרטניים או תאים נורמליים כמו לויקוציטים, לימפוציטים ותאי גזע בהקשר של סרטן. כך שידע על נדידת תאים, גורמים מווסתים ומסלולי העברת אותות קשורים עשוי להועיל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לפגיעה בנדידת תאי הגידול והתפשטות גרורתית. עבור תאי הנדידה מברישים במהירות שתי שכבות של שעוות פרפין מומסת, תערובת ג'לי נפט לאמצע שקופית זכוכית, מוסיפים כיסוי, מחליקים ואוטמים בשתי שכבות של שעוות הפרפין, תערובת ג'לי נפט.

לאחר מכן הניחו את תאי הנדידה במצב זקוף במתלה לצינורות תגובה של 1.5 מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטר מתרחיף התאים לתרחיף הקולגן. שלב 50 מיקרוליטר של 10 XMEM ו -27 מיקרוליטר של 7.5% תמיסת נתרן ביקרבונט מערבבים היטב.

לאחר מכן הוסיפו 375 מיקרוליטר של תרחיף קולגן נוזלי וערבבו היטב לקבלת צבע סגול בהיר המעיד על pH של 7.5. כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר מתרחיף הקולגן הסופי ל-50 מיקרוליטר של תרחיף התאים וערבבו היטב תוך ציון התחלת סיבי הקולגן. פילמור. ב-pH 7.5, העבירו את התערובת לתאי הנדידה.

הקש בעדינות על תא הנדידה כדי לפזר באופן שווה את תערובת תאי תרחיף הקולגן בתחתית תא שרשרת הנדידה. הניחו את תאי הנדידה במצב זקוף במתלה ודגרו למשך 30 דקות. כאשר סריג הקולגן הפולימרי עכור מעט, אך עדיין בצבע סגול בהיר, מלאו את תאי הנדידה במדיום המתאים ואטמו את תא הנדידה בשעוות פרפין.

תערובת ג'לי נפט. כוונן את מחמם שלב המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות הגדלה של פי 10 בתא הנדידה. התמקד בכ- 50 תאים או יותר בשדה הראייה.

הקלט את נדידת התאים במצב זמן-lapse באמצעות יישום תוכנת מעקב וידאו מרובת מצלמות. שמור את סרטי העברת התאים בפורמט קובץ מתאים. קשר את קבצי סרט העברת התאים למסד נתונים המכיל מידע תומך כגון סוג תא ותנאי ניסוי.

לאחר מכן, נתח את סרטי נדידת התאים באמצעות יישום תוכנה מתאים למעקב אחר תאים לניתוח חסר פניות. בחר באופן אקראי את התאים לניתוח ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים בסך הכל, קבע כ-60 קואורדינטות XY לתא בניסוי נדידת תאים טיפוסי. במקרה של חלוקת תאים, בחר באופן אקראי תא בת אחד לעקוב אחריו במעקב.

נתח נתוני מעקב אחר תאים באמצעות יישום תוכנה מתאים כגון תוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המרחק הכולל שהתא עבר. הכפל את סכום ערכי הפיקסלים המספריים במקדם תיקון להמרה למיקרונים. הגדר את התאים שנדדו פחות מסף 25 מיקרון כתאים שאינם נעים, והחלף את הערכים המספריים בפסיק.

לאחר מכן, חשב את הפעילות התנועתית כאחוז מהתאים של אוכלוסיית התאים במעקב שנעו בין שתי נקודות זמן. כמו כן, חשב את זמן התנועה הפעילה כאחוז מהזמן הכולל שתא נדד ביחס למסגרת הזמן של תקופת התצפית. לאחר מכן חשב את המובהקות הסטטיסטית באמצעות מבחן man Whitney U והצג את נתוני נדידת התאים.

קובץ נתונים טיפוסי למעקב אחר תאים דומה לטבלה שבה כל עמודה מייצגת תא אחד במעקב. השורות מכילות את המידע המיקומי על תנועת התאים. עם הזמן, ניתן לאפיין את התנהגות התנועה של התאים על ידי הפעילות התנועתית הממוצעת של אוכלוסיית התאים המנותחת וגם על ידי זמן התנועה הפעילה.

דוגמה זו מציגה את פעילויות הנדידה של 120 תאים מארבעה ניסויים עצמאיים. כל יהלום מציין שתא נע בין שתי נקודות זמן לפחות. הקווים האפורים מבדילים בין התאים הנעים והלא נעים.

ניתן להציג את הפרמטר של פעילות הקטר כדיאגרמת XY או כתרשים תיבה. כדי לדמיין את הדינמיקה של אוכלוסיית התאים המנותחת, היסטוגרמה מציגה ביעילות את זמן הפעילות של אותם תאים. ניתוח זה של התנהגות הנדידה של קווי תאי סרטן השד MDA HER2 ו-M-D-A-N-E-O מצביע על כך ששני קווי התאים הפגינו פעילות תנועתית ספונטנית דומה.

זמן הפעילות של הפרמטר חשף מספר מעט גבוה יותר של תאי M-D-A-H-E-R הנעים באופן ספונטני בהשוואה לתאי סרטן השד M-D-A-N-O. גירוי עם 100 ננוגרם למיליליטר של EGF הביא לעלייה משמעותית בפעילות הנדידה של MDA HER2 כפי שנמדד על ידי מספר התאים הנעים וזמן התנועה הפעילה. מעניין שתאי M-D-A-N-E-O נדדו בתגובה לגירוי EGF והציגו דפוס פעיל בזמן שינוי טיפול עם מעכב פוספוליפאז c גמא אחד uc 3 1 22 הפחית הן את הנדידה הספונטנית והן את ה-EGF הן של M-D-E-E-R 2 והן של MDAN.

תאי EEO. ניתוח פרמטר הזמן הפעיל גילה כי טיפול בתאי EEO של MDAN עם שני מיקרומולר של U 7 3 1 2 2 הביא לירידה ניכרת בפעילות התנועה, המיוחסת בעיקר לכמות מוגברת של תאים שאינם נעים. לאחר שליטה, ניתן לרשום את ההגירה של לימפוציטים ולויקוציטים לקולגן תלת מימדי, ניתן לרשום אותיות ו-ment תוך כשעתיים, שם תאי הגידול נרשמים בן לילה.