Name: מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד מיקרוסקופיית SPIM תלת-ממדית לתרביות תאים ספרואידיות באמצעות מודול תאורת מודול לזיהוי תרופות וסוכנים פלואורסצנטיים במערכת מיקרו-נימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי הארץ באדן וירטמברג, כמו גם על ידי האיחוד האירופי, יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung. המחברים מודים ריינר יטיג (ILM Ulm) לאספקת קו U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 התא וקלאודיה Hintze לקבלת סיוע טכני מיומן.

גידולי אליפטית 1 נייד ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי 1: spheroids הסלולרי הודגרו עם תרופה כימותרפיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose 1.5% במדיום תרבות על ידי הוספת 0.45 גרם של agarose ל30 בינוניים מ"ל תרבות (מספיק ל6 צלחות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת מהצעד 1.1.1 לפחות 80 ° C תוך ערבוב אותו מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 50 μl של התערובת המחוממת מהצעד 1.1.2 לבאר כל צלחת 96 היטב ולתת לו לגבש בתוך 1-2 שעות. אחסן את הצלחות סגורות ומכוסה במקרר ב5 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע על 150 MCF-7 תאי סרטן השד בכל טוב של הצלחת מוכנה 96 היטב בינוניים השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) עם מדיום F-12 התרבות של בשר חזיר בתוספת סרום 10% עוברי עגל (FCS) ו1% פניצילין / סטרפטומיצין . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול spheroids ל5-7 ימים עד קוטר של כ 200-300 מיקרומטר בחממה ב 5% CO 2 ו3776; C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids התא עם hydrochloride דוקסורוביצין האנטיביוטיקה anthracycline ל6 שעות בריכוז הנע בין 2 מיקרומטר ו8 מיקרומטר (במדיום תרבות) בחממה ב5% CO 2 ו37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את spheroids התא עם מדיום תרבות או מאוזן תמיסת מלח של ארל (EBSS) לפני במיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי 2: תהליך החמצון בspheroids להביע חיישן חיזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע על 400 תאי U251-MG-L106 גליובלסטומה באופן קבוע transfected עם גלוטתיון חיישן חיזור ניאון ירוק רגיש Grx1-roGFP2 בבארות מצופה agarose ג'ל (ההליך מתואר בצעדים 1.1.1-1.1.3) של צלחת 96 היטב בDMEM מדיום התרבות בתוספת FCS 10%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וhygromycin B (150 מיקרוגרם / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול spheroids ל5-7 ימים עד קוטר של כ 200-300 מיקרומטר בחממה ב 5% CO 2 ו37 C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 &amp; #181; l של פתרון מי חמצן (pa purum, ≥ 30%) ל990 מים מזוקקים דו μl ליצור פתרון מניות מ"מ 100 לשימוש בתוך שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון המניות מהצעד 1.2.3 ל50 מיקרומטר בEBSS ממש לפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids התא באמצעות מערכת microfluidic בזמן מדידה עם מי חמצן 50 מיקרומטר בEBSS לחמצון של חיישן חיזור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי 3: ייזום וסימון של נמק הסלולר בתוך spheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע תאים -400 (למשל, תאי גליובלסטומה U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) בבארות מצופים agarose ג'ל (הליך מתואר בצעדים 1.1.1-1.1.3) של צלחת 96 היטב במדיום תרבות DMEM בתוספת FCS 10%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וhygromycin B (150 מ"ג / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול spheroids ל5-7 ימים עד קוטר של כ 200-300 מיקרומטר בחממה ב 5% CO 2 ו37 C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאspheroids עם rotenone המיטוכונדריה הובלת אלקטרונים המעכב ל3 שעות בריכוז של 1 מיקרומטר במדיום התרבות כדי לגרום לנימק סלולארי. בנוסף, שיתוף דגירה עם צבע רעיל ירוק ל3 שעות בריכוז של 1 μl במדיום תרבות מ"ל 1 לתייג תאי נימקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את spheroids התא עם מדיום תרבות או EBSS לפני במיקרוסקופ. </li></ol></li></ol> .2 התאמת גיליון אור הערה: להשגת התוצאות הטובות ביותר שיש לו להבטיח שמותן הקורה של גיליון האור היא במישור המוקד של העדשה האובייקטיבית. העמדה של המותניים הקרן ניתן ליישר רק על ידי התבוננות גיליון האור במצב אנכי ביחס לנימים (ראה צעדים 2.5-2.8). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ הפוכה והר מודול עירור SPIM, כפי שמתואר במס. 16, לbaseplate של טבלת המיצוב (ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייד את מיקרוסקופ עם 1עדשת 0x / 0.3 או 20X / 0.5 מיקרוסקופ אובייקטיבי ומסנן ארוך לעבור מתאים (ננומטר למשל, λ ≥ 515) בדרך זיהוי של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מצלמה שילוב לנמל זיהוי של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקרן collimated מקבילה של לייזר או דיודת לייזר עם אורך גל עירור של מועדף 470 ננומטר ולהחיל אותו על מודול SPIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העדשה הגלילית על ידי 90 מעלות, המעבירה את גיליון האור למצב אנכי להתאמה צירית של המותניים הקורה של גיליון האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נימים המכילות נוזל עם צבע פלואורסצנטי בבעל המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את בעל מדגם עם הנימים לשולחן המיצוב של מיקרוסקופ וליישר את עמדתו של הנימים כך שהוא מרוכז ומותני הקורה של גיליון האור הוא בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המותניים קרן על ידי וריאציה של התנוחה הצירית של העדשה הגלילית עצמו. להחזיר את העדשה לאחר מודעהjustment. </li></ol> יישום אליפטית .3 נייד וסנכרון Feed מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את spheroids התא בנפרד או בקבוצות בתוך נימי זכוכית בורוסיליקט המלבני 16 עם סעיף פנימי צולב של 600 מיקרומטר x 600 מיקרומטר ועובי דופן של 120 מיקרומטר. שתי טכניקות ליישום של אליפטית תא הוכיחו להיות מוצלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הנימים הריקות זקופות עם אגודל ואצבע אמצעית ולאטום את הפתח העליון עם האצבע שלך. להביא את הפתיחה נמוכה יותר קרובה לאליפטית התא בנוזל סביבו (EBSS או מדיום תרבות). שחרר את האצבע מהפתח העליון. נוזל עם אליפטית התא בו יהיה ספוג באופן מיידי על ידי כוחות נימים. להתאים את המיקום של אליפטית בתוך הנימים מולא בגרביטציה בתנוחה זקופה בהתאמה של הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להחיל את אליפטית התא לנימים באמצעות פיפטה. קח tha טיפולt הפתיחה של הקצה פיפטה היא, מצד אחד, גדולה מספיק לגודל אליפטית ו, לעומת זאת, פחות או שווה בגודלו לקוטר הפנימי של הנימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הנימים עם אליפטית בזה בבעל מדגם מיוחד למיקרוסקופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את בעל מדגם עם הנימים לשולחן המיצוב של מיקרוסקופ וליישר את העמדה של אליפטית התא כך שהוא מרוכז וממוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ההתאמה בין גיליון האור ומישור המוקד של העדשה האובייקטיבית מיקרוסקופ בנתיב הגילוי על ידי התאמת המיקום של מראה ההשתקפות והעדשה הגלילית (ראה בורג התאמה באיור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונן את בורג מיקרומטר (ראה איור 1) בהתאם למדדי השבירה והצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית כדי לפצות את השפעת fishtank. הערה: מדדים שונים שבירה של המדגם והתקשורתי סביב tהוא להוביל עדשה אובייקטיבית לפער שבין השינוי של העדשה האובייקטיבית והמשמרת של מישור המוקד. מאחר שמדובר באור מועבר על ידי הצריח האובייקטיבי, חוסר ההתאמה בין המשמרת של גיליון האור (המקביל למשמרת של העדשה האובייקטיבית) והשינוי של מישור המוקד הוא מתוגמל על ידי זרוע מנוף (ראה איור 1). בורג מיקרומטר משמש להתאים את המרחק בין העליון והתחתונה הסיכה כדי להתאים את המשמרת של גיליון האור בהתאם לצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית ומדדי השבירה. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500"> 1 (א) תמונה של מודול תאורת מטוס הבודד רכוב על baseplate של טבלת המיצוב של מיקרוסקופ הפוכה, (ב) הגדרת דמותו של תאורת המטוס הבודדמודול וסנכרון הזנת מיקרוסקופ כדי לפצות הרמת חוסר ההתאמה (השפעת fishtank) בין מישור מוקד ומטוס תאורה. o Δz מציינת את המעבר של העדשה האובייקטיבית וΔz f המשמרת של מישור המוקד וגיליון האור. שיבוץ תערוכות חתכים של נימי אליפטית המכילה. משמאל: נימים מלבניות עם קוטר פנימי של 600 מיקרומטר (קיר 120 מיקרומטר). מימין: הגדרה המשמשת לסיבוב. נימים פנימיות עגולות (קוטר פנימי 400 מיקרומטר, בקוטר חיצוני 550 מיקרומטר) הוא הסתובב בתוך הנימים מלבניות החיצוניות. החלל שבין שתי הנימים מלא בנוזל טבילה. .4 מדידה בדינמית נוזלית סביבה הערה: הפרוטוקול הקודם משמש לדגירת סטטי לפני מדידה שבו אליפטית התא כבר בעבר מודגרות ולאחר מכן נערכה במקום בנימים על ידי כוח הכביד פשוט. אין צורך בfixati נוסףב. עם זאת, למדידות בזורמות תקשורת שבו דגירה דינמית, ולכן, סביבה דינמית רצוי למדוד קינטיקה ספיגה, אחד יכול להשיג תת פרוטוקול זה. צעדים 4.5-4.9 הם קריטיים כדי למנוע בועות אוויר שהגיעו למדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הנימים עם FCS למשך 30 דקות כדי לתמוך בהדבקה מאוחר יותר סלולרית של אליפטית תא למשטח הזכוכית הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ציפוי FCS שנותר בנימים המדולדלים להתייבש במשך שעה לפחות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג אליפטית התא לנימים המצופים FCS כמתואר בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הנימים בחממה ב5% CO 2 וC ° 37 ל2-4 שעות נוספות כדי לגרום להידבקות סלולרית של אליפטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת חלק afflux של מערכת microfluidic (ראה איור 2). השתמש במשאבת peristaltic למלא afflux של הצינור (הקוטר הפנימי: 0.89 מ"מ) עם מדיום תרבות המכיל ניאון צבע, סמים או סוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Connect חלק afflux של מערכת microfluidic למלכודת בועה (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון מהדק את הנימים ללא בועה לצינורות afflux ולאחר מכן מהדק הצד של הנימים האחרות לצינורות הניקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגינת טמפרטורת הנוזל של אמבט המים לערך הרצוי (למשל, 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את משאבת peristaltic למהירות המשאבה הרצויה (למשל, קצב זרימה: 9 μl / דקה; מהירות משאבה בנימים: 25 מ"מ / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הנוזל נשאב גם בנמען (התקנת לולאה פתוחה), להאכיל אותו בחזרה למקור שלה (הגדרת לולאה סגורה) או להאכיל אותו ישירות לתוך צינורות של משאבת peristaltic (התקנה הדוקה לולאה סגורה). </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500"> איור 2 התקנת Microfluidic (לולאה פתוחה והדוק לולאה סגורה); שיבוץ: תאורה של SPHeroid בתוך מיקרו נימים באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון מבוססת הקרינה מצמידים מיקרוסקופ הפוכה. .5 רכישת נתונים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כוח הלייזר וזמן האינטגרציה לרכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמור על עצמך כי הפרמטרים שהוגדרו בשלב 5.1 לא יעלו על ערכי מינון אור על 50-100 J / 2 סנטימטר לתאים מקומיים או 10-20 J / 2 סנטימטר לתאים הודגרו עם צבע פלואורסצנטי או transfected עם פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי ל להימנע phototoxicity (לפרטים ראו Ref. 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התוספת עבור z-המחסנית לΔz = 5-10 מיקרומטר שעדיף לניתוח נתונים 3 ממדים כעובי גיליון האור הוא כ 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מדידות של תמונות בודדות או z-ערימות על ידי וריאציה של מטוס המוקד בתוך אליפטית התא. </li></ol>

<ol><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1990).</li>
<li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>König, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li>
<li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening%3A+the+multi-cellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li>
<li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027(2010).</li>
<li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li>
<li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518(2012).</li>
<li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li>
<li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li>
<li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li>
<li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).</li>
<li>Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , 7,787,179 B2 (2010).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li>
<li>Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

כתב היד הנוכחית מתארת ​​גיליון אור או מכשיר מיקרוסקופיה תאורת מטוס בודדת (SPIM) אשר מותאם במיוחד עבור מערכות תא 3 ממדים, למשל, spheroids רב תאי גידול (MCTS). שלושה יישומים למופת כוללים (1) ספיגה של תרופת cytostatic והמרה החלקית שלה למוצר פגום (תרומה ליעילות כימותרפיות שעדיין נשאר כדי להיות מוערכים), (2) מדידות של מדינת חיזור על ידי שימוש בחיישן גלוטתיון מקודד גנטי על תוספת של סוכן חמצון, ו (3) ייזום ותיוג של נמק תא על עיכוב של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. <p class="jove...

בנוסף לשיטות מבוססות היטב (מיקרוסקופיה confocal או במיקרוסקופ סריקת לייזר רב פוטון 1-4, מובנה התאורה 5,6) גיליון אור או מיקרוסקופ מטוס בודד תאורה (SPIM) הוכיח להיות שיטת ערך של 3D ההדמיה 7,8, 9. מעניין במיוחד הוא היישום שלה לתרבויות 3 ממדי תא, למשל, spheroids גידול רב תאי (MCTS), אשר נמצא בשימוש יותר ויותר למחקר לגילוי תרופות 10,11. יתר על כן, SPIM הוא שיטה מועדפת, כאשר גם בחשיפה ארוכת טווח או מדידות חוזרות ונשנות מינוני אור נמוכים נדרשים לשמור על כדאיות של המדגם, שכן למדידה של כל מטוס המדגם רק המטוס הזה נחשף לאור. זאת בניגוד לשיטות מיקרוסקופיה אחרות, שבו לגילוי של כל מטוס מוקד המדגם כולו מואר, כך שעם הקלטה של מטוסים רבים סכומי מינון אור ועלול לגרום נזק למדגם 12. </p&gt; מיקרוסקופיה גיליון אור או SPIM מבוססת על תאורה של המדגם בכיוון מאונך לנתיב התצפית או על ידי שימוש בעדשה גלילית או על ידי סריקת קרן הלייזר המרגש (לסקירה ראה נ&quot;צ. 8). זה בדרך כלל דורש תאים מיוחדים מדגם 13,14 או מטריצות, למשל, agarose 7,15, מיושם במיקרוסקופים גבוהה בעלות מיוחדת. כחלופה למערכות אלה מכשיר תאורה פשוט comparably לSPIM פותח והותאם למיקרוסקופ הקונבנציונלי הפוך 16 (ראה איור 1). הוא מורכב מקרן לייזר התרחבה לקוטר של 8 מ&quot;מ וממוקד על ידי עדשה גלילית (אורך מוקד: 50 מ&quot;מ, צמצם מספרי: 0.08) לגיליון אור של 6-10 עובי מיקרומטר על עומק השדה של כ 100 מיקרומטר . דוגמאות נמצאות בנימים מלבניות של 600-900 מיקרומטר קוטר פנימי להציב מול len האובייקטיבי מיקרוסקופים לגילוי הקרינה. התכונות העיקריות אלה הושלמו כיום ומותאמים על ידי השימוש בגישות מיקרו נימים מתקדמות להחזקה ולמסתובב דגימות, ההתאמה סינכרוני של גיליון האור המאיר (בכיוון צירי) ועדשה האובייקטיבית המשמשות לגילוי הקרינה (נתיב אופטי זהה אורכים של עקירה דורשים תיקון של ההזנה המכנית), וההסתגלות של מערכת microfluidic ליישום של צבעי ניאון, סוכנים או תרופות תרופות, וכך לצמצם את הכמויות והוצאות הנדרשות.

<table><tbody><tr><td>צלחת מיקרוטיטר</td><td>כתום</td><td>מדעי 4430100</td><td>לגידול כדורי תאים</td></tr><tr><td>אגרוז&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>עבור ספרואיד תאים הגדל</td></tr><tr><td>קו תאים MCF-7 קו</td><td>תאים CLS קווי תאים שירות GmbH</td><td></td><td>קו תאים</td></tr><tr><td>300273 U251-MG-L106 קו</td><td></td><td></td><td>תאים קו תאים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>מדיום תרבית</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>מדיום</td></tr> <tr>תרבית<td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>תוסף תרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&nbsp; &nbsp;</td><td>P02-015</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>סיגמא-אולדריץ' בע"מ</td><td>תוסף תרבית תאים</td> <td>E3024</td></tr><tr><td>דוקסורוביצין</td><td>סיגמא-אולדריץ' בע"מ</td><td>D1515</td><td>צבע פלואורסצנטי (זהירות: רעילות חריפה)</td></tr><tr><td>צבע ציטוטוקסיות ירוק</td><td>Promega</td><td>GmbH G8742</td><td>CellTox - צבע ציטוטוקסיות פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא-אולדריץ' בע"מ.</td>מעכב תאים <td>R8875</td><td>(זהירות: רעילות חריפה)</td></tr>מי <tr><td>חמצן (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>מגיב לחמצון (זהירות: רעילות חריפה)</td></tr> <tr><td>נימים</td><td>VitroCom&nbsp;</td><td>8260-050</td><td>הכנת מדגם</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision Data Acquisition Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>גרסה 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>דיודת לייזר</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>בשימוש עם דרייבר PDL800-B</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>מכויל מחדש כדי להפחית את מהירות המשאבה המינימלית ב-1/10&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>IDEX Health & מדע GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

מודול לגיליון אור או מיקרוסקופ תאורת מטוס בודד (SPIM) מתואר אשר מותאם בקלות למיקרוסקופ שדה הרחב הפוך ומותאם במיוחד לתרביות תאים 3 ממדים, למשל, spheroids רב תאי גידול (MCTS). צורות עירור SPIM מודול ומסיט את האור כך שהמדגם הוא מואר על ידי אור גיליון בניצב לדרך זיהוי של המיקרוסקופ. המערכת מאופיינת בשימוש בנימים מלבניות להחזקה (ובגרסה מתקדמת גם על ידי גישת מיקרו נימים לסיבוב) הדגימות, על ידי התאמה סינכרונית של גיליון האור המאיר ועדשה האובייקטיבית המשמשת לגילוי הקרינה, כמו גם על ידי התאמה של מערכת microfluidic ליישום של צבעי ניאון, סוכנים או תרופות תרופות בכמויות קטנות. פרוטוקול לעבודה עם מערכת זו הוא נתון, וכמה פרטים טכניים שדווחו. נציג תוצאות כוללות (1) מדידות של עדלקחת תרופת cytostatic (דוקסורוביצין) והמרתו החלקית למוצר השפלה, (2) מדידות חיזור על ידי שימוש בחיישן גלוטתיון מקודד גנטי על תוספת של סוכן חמצון, ו (3) ייזום ותיוג של נמק תא על עיכוב של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. הבדלים ויתרונות של מודול SPIM הנוכחי בהשוואה למערכות קיימות נדונים.

ניסוי 1: spheroids הסלולרי הודגרו עם תרופה כימותרפיות סריקת z-ערימת אליפטית מודגרות בעבר MCF-7 תאים (8 מיקרומטר דוקסורוביצין, 6 שעות) מתוארת באיור 3. זה נותן מידע מפורט על הספיגה הסלולרית והפצה של דוקסורוביצין 17 ומוצר השפלה שלה 18,19. בתוך שכבת התא החיצונית של דוקסורוביצין הניאון האדום אליפטית הוא מקומי בעיקר בגרעין, ואילו באזורי אליפטית הפנימיים הקרינה ירו...

מודול למיקרוסקופיה תאורת מטוס בודד (SPIM) מתואר אשר מותאם בקלות למיקרוסקופ שדה הרחב הפוך ומותאם במיוחד לתרביות תאים 3 ממדים. המדגם ממוקם בתוך נימים מלבניות, ובאמצעות צבעי ניאון מערכת microfluidic, יכולים להיות מיושמים סוכנים או תרופות תרופות בכמויות קטנות.

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מיקרוסקופ תאורה במישור יחיד באמצעות מודול עירור גיליון אור למיקרוסקופים הפוכים ולהחיל אותו על ספרואידים תלת מימדיים של תאים. זה מושג על ידי שימוש תחילה בפיפטה כדי להעביר כדור תא מהבאר של צלחת מיקרוטיטר לבאר שנייה כדי לדגור לאחר הכביסה. לאחר מכן מוכנס הספרואיד S לנימים מלבניים.השלב השני הוא הרכבת מודול תאורת גיליון האור על לוחית הבסיס של שולחן מיקום המיקרוסקופ ההפוך. לאחר מכן, הנימים המכילים את הסטרואידים מונחים במחזיק דגימה מיוחד למיקרוסקופיה. השלב האחרון הוא להגדיר את ההתאמה בין גיליון האור למישור המוקד של עדשת האובייקט של המיקרוסקופ בנתיב הזיהוי.בסופו של דבר, ניתן לבצע מדידות פלואורסצנטיות תלת מימדיות על ידי וריאציה של מישור המוקד בתוך ספרואיד התא כדי לקבל מידע על תמונות בודדות או Zacks לגבי ספיגת תרופות או מבנה הספרואיד S. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מיקרוסקופים קיימים של יריעות אור הוא שהיא חסכונית ורב-תכליתית ביותר מכיוון שהיא מורכבת ממודול שניתן להתאים למיקרוסקופ קיים ומספקת מידה רבה של חופש למחקר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחקר של תרופות וחומרים המשמשים לטיפול ואבחון, בפרט, מכיוון שהתאמת המערכת המיקרופלואידית מאפשרת חקירה של תהליכים מהירים בתנאי זרימה.כעת שיטת עירור זו בשילוב עם כל טכניקת זיהוי יכולה לספק תובנה לגבי סטרואידים של תאים חיים במינונים של אור נמוך. ניתן ליישם אותו גם על מערכות חיות אחרות כגון דגי ציפרו, עוברי ארטילה, כמו גם דגימות רקמת CLE אופטיות. כדי להתחיל, הוסף 50 מיקרוליטר של 1.5 אירוס מחומם במדיום תרבית לכל באר של צלחת 96 באר ותן לה להתמצק במשך שעה עד שעתיים.לאחר מכן זרעו כ-150 MCF שבעה תאי סרטן שד בכל באר של 96 בארות ברוטו למשך חמישה עד שבעה ימים, עד לקוטר של כ-200 עד 300 מיקרומטר באינקובטור ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו על סטרואידים בתא עם האנטיביוטיקה אנתרציקלין דוקסורוביצין הידרוכלוריד למשך שש שעות בריכוז שנע בין שני מיקרומולר לשמונה מיקרומולר בתרבית. בינוני לאחר הדגירה, שטפו את התאים OID עם תרבית, מדיום או תמיסת מלח איזון ארל לפני המיקרוסקופיה.השתמש במיקרוסקופ הפוך והרכיב את מיקרוסקופ התאורה במישור יחיד או מודול עירור SPM על לוחית הבסיס של שולחן המיקום. ציידו את המיקרוסקופ בעדשת אובייקט מיקרוסקופ מגדילה פי 10 או פי 20 ומסנן מעבר ארוך מתאים בנתיב הזיהוי של המיקרוסקופ. לאחר מכן התקן מצלמה משולבת ליציאת הזיהוי של המיקרוסקופ.השתמש בקרן אסופה מקבילה של לייזר או דיודת לייזר עם אורך גל עירור של 470 ננומטר מועדף והחל אותה על מודול הספין. לאחר מכן, סובב את העדשה הגלילית ב-90 מעלות, מה שמעביר את יריעת האור למצב אנכי להתאמה צירית של מותני הקרן של יריעת האור. הניחו נימים המכילים נוזל עם צבע פלורסנט במחזיק הדגימה.חבר את מחזיק הדגימה עם הנימים לשולחן המיקום של המיקרוסקופ. יישר את מיקום הנימים כך שהוא ממורכז ומותני הקרן של יריעת האור יהיו בפוקוס. התאם את מותני הקורה על ידי וריאציה של המיקום הצירי של העדשה הגלילית עצמה.סובב את העדשה לאחור לאחר ההתאמה. הנח את סטרואיד התא בנפרד או בקבוצות בתוך נימי זכוכית סיליקט מלבניים עם חתך פנימי של 600 על 600 מיקרומטר ועובי דופן של 120 מיקרומטר. כדי להשיג זאת, קח את הנימים הריק זקוף עם האגודל והאצבע האמצעית ואטום את הפתח העליון עם האצבע.קרב את הפתח התחתון לספרואיד התא בנוזל הסובב אותו, שחרר את האצבע המורה מנוזל הפתח העליון עם הסטרואידים בפנים. הוא ייספג מיד על ידי כוחות נימיים. התאם את המיקום של כדור ה-S בתוך הנימים הממולאים על ידי כוח הכבידה.לחלופין, מרחו את הסטרואידים על הנימים באמצעות פיפטינג. הקפד שפתח קצה הפיפטה יהיה מצד אחד גדול מספיק לגודל הספרואיד S ומצד שני, קטן או שווה בגודלו לקוטר הפנימי של הנימים. לאחר מכן, הניחו את הנימים המכילים את הספרואיד S במחזיק דגימה מיוחד ממיקרוסקופיה.חבר את מחזיק הדגימה עם הנימים לשולחן המיקום של המיקרוסקופ ויישר את מיקום סטרואיד התא כך שהוא מרוכז וממוקד. הגדר את ההתאמה בין גיליון האור למישור המוקד של עדשת האובייקט של המיקרוסקופ בנתיב הזיהוי על ידי התאמת מיקום מראת ההשתקפות והעדשה הגלילית. מלאו את הנימים בסרום עגל עוברי או FCS למשך 30 דקות כדי לתמוך בהידבקות תאית מאוחרת יותר של סטרואידים תאיים למשטח הזכוכית הפנימי.תן לציפוי ה-FCS הנותר בנימי המדולדל להתייבש לפחות 12 שעות לאחר הכנסת סטרואיד התא לנימים המצופים FCS. כמו קודם, השאירו את הנימים באינקובטור למשך שעתיים עד ארבע שעות נוספות כדי לגרום להידבקות תאית של הסטרואידים. לאחר מכן, הגדר את חלק ה-flx של המערכת המיקרופלואידית כולל מלכודת בועות.השתמש במשאבה פריסטלטית כדי למלא את ה-flx של הצינור במדיום תרבית המכיל את תרופה או חומר הצבע הפלואורסצנטי. ראשית מהדקים את הנימים נטולי הבועות לצינור הפליטה ולאחר מכן מהדקים את הצד השני של הנימים לצינור הניקוז. כוונן את טמפרטורת הנוזל של אמבט המים לערך הרצוי.לאחר מכן כוונן את המשאבה הפריסטלטית למהירות המשאבה הרצויה. אסוף את הנוזל הנשאב לתוך נמען עם הגדרת לולאה פתוחה לרכישת נתונים וניתוח. הגדר את עוצמת הלייזר ואת זמן האינטגרציה לרכישת התמונה.הגדר את התוספת עבור מחסנית ZS לערך בין חמישה ל -10 מיקרומטר, דבר עדיף לניתוח נתונים תלת מימדי. מכיוון שעובי יריעת האור הוא כ-10 מיקרומטר, המשך לבצע מדידות של תמונות בודדות או Zacks על ידי וריאציה של מישור המוקד בתוך סטרואיד התא. מוצגת סריקת זאק של סטרואיד mc שבעה תאים שהודגר בעבר עם שמונה דוקסורוביצין מיקרו-מולרי במשך שש שעות.התמונות נותנות מידע מפורט על הספיגה וההפצה התאית של דוקסורוביצין ופירוקו. תוצר בתוך שכבת התא החיצונית של דוקסורוביצין פלואורסצנטי אדום סטרואיד ממוקם בעיקר בגרעין, בעוד שבאזורי הכדור הפנימיים, פלואורסצנט ירוק המוגש על ידי תוצר פירוק הופך לדומיננטי בקרום התא. ספיגת התרופה הכימותרפית דוקסורוביצין בתא סרטן שד אנושי מקומי mc 7 S מתוארת עבור שכבת תא בודדת שנבחרה על ידי spm.עם יישום של שני מדיום מיקרו-מולרי ותרבית בתוך מערכת הזרימה, הקרינה האדומה והירוקה של דוקסורוביצין ותוצר הפירוק שלו גדלה ברציפות עם יישום שני דוקסורוביצין מיקרו-מולרי במדיום תרבית בתוך מערכת הזרימה, הקרינה האדומה והירוקה של דוקסורוביצין ותוצר הפירוק שלו גדלה ברציפות. לאחר השליטה, לוקח רק כמה דקות מהרכבת מודול חיסול יריעות האור ועד להקלטת תמונות פלואורסצנטיות של דגימות תלת מימד. בעת מדידה ומצב הזרימה, חשוב ביותר לוודא שהדגימה נדבקת למשטח הפנימי של הנימים ולהימנע מבועות אוויר המגיעות לדגימה שעלולות לנתק אותה מהנימים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה של מיקרוסקופ תאורת גיליון אור עם המודול הרב-תכליתי המותאם למיקרוסקופים שונים.

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

במצבים ביולוגיים וקליניים רבים הוא יתרון ללמוד תהליכים תאיים כמו שהם להתפתח microenvironment הולדתם. כאן אנו מתארים את הרכבה ושימוש מיקרוסקופ סיב אופטי בעלות נמוכה אשר יכול לספק הדמיה בזמן אמת בתרבות התא, מחקרים בבעלי חיים, ומחקרים קליניים המטופל.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

פלטפורמה עצמים ללא עדשה מיקרוסקופ על שבב ניאון הוא הוכיח כי אובייקטים בתמונה ניאון מעל אולטרה רחב בתחום לצפות-של של למשל יכול,&gt; 0.6-8 CM2 עם רזולוציה 4μm &lt;באמצעות דגימה דחיסה מבוסס אלגוריתם פענוח. כאלה לערוץ קומפקטי רחב בתחום ניאון על שבב הדמיה יכול להיות בעל ערך עבור cytometry תפוקה גבוהה, נדיר תאים מחקר microarray ניתוח.

פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

הבנייה המלאה של מנהג, בזמן אמת, מערכת סריקה confocal הדמיה מתואר. מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם בקלות עבור מיקרוסקופיה וידאו שיעור microendoscopy, מאפשר מערך של הגיאומטריות הדמיה ויישומים אינם נגישים באמצעות תקן מערכות confocal מסחרי, בכל חלק של עלות.

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של &lt;1 מיקרומטר × &lt;1 מיקרומטר × &lt;3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100...

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

הוראה מפורטת מתואר כיצד לבנות מאוד נוטה נסחף מיקרוסקופ אריח (HIST) ואת השימוש עבור הדמיה מולקולה בודדת.

מדריך לבניית מאוד נוטה נסחף מיקרוסקופ אריח עבור הדמיה מולקולה בודדת שדה-of-view מורחבת

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

למד מיקרוסקופיית SPIM תלת-ממדית לתרביות תאים ספרואידיות באמצעות מודול תאורת מודול לזיהוי תרופות וסוכנים פלואורסצנטיים במערכת מיקרו-נימים.

מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב

גלה סרטונים נוספים