מטוס אחד תאורת מודול וגישת מיקרו-נימים למיקרוסקופ שדה רחב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מיקרוסקופ תאורה במישור יחיד באמצעות מודול עירור גיליון אור למיקרוסקופים הפוכים ולהחיל אותו על ספרואידים תלת מימדיים של תאים. זה מושג על ידי שימוש תחילה בפיפטה כדי להעביר כדור תא מהבאר של צלחת מיקרוטיטר לבאר שנייה כדי לדגור לאחר הכביסה. לאחר מכן מוכנס הספרואיד S לנימים מלבניים.

השלב השני הוא הרכבת מודול תאורת גיליון האור על לוחית הבסיס של שולחן מיקום המיקרוסקופ ההפוך. לאחר מכן, הנימים המכילים את הסטרואידים מונחים במחזיק דגימה מיוחד למיקרוסקופיה. השלב האחרון הוא להגדיר את ההתאמה בין גיליון האור למישור המוקד של עדשת האובייקט של המיקרוסקופ בנתיב הזיהוי.

בסופו של דבר, ניתן לבצע מדידות פלואורסצנטיות תלת מימדיות על ידי וריאציה של מישור המוקד בתוך ספרואיד התא כדי לקבל מידע על תמונות בודדות או Zacks לגבי ספיגת תרופות או מבנה הספרואיד S. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מיקרוסקופים קיימים של יריעות אור הוא שהיא חסכונית ורב-תכליתית ביותר מכיוון שהיא מורכבת ממודול שניתן להתאים למיקרוסקופ קיים ומספקת מידה רבה של חופש למחקר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחקר של תרופות וחומרים המשמשים לטיפול ואבחון, בפרט, מכיוון שהתאמת המערכת המיקרופלואידית מאפשרת חקירה של תהליכים מהירים בתנאי זרימה.

כעת שיטת עירור זו בשילוב עם כל טכניקת זיהוי יכולה לספק תובנה לגבי סטרואידים של תאים חיים במינונים של אור נמוך. ניתן ליישם אותו גם על מערכות חיות אחרות כגון דגי ציפרו, עוברי ארטילה, כמו גם דגימות רקמת CLE אופטיות. כדי להתחיל, הוסף 50 מיקרוליטר של 1.5 אירוס מחומם במדיום תרבית לכל באר של צלחת 96 באר ותן לה להתמצק במשך שעה עד שעתיים.

לאחר מכן זרעו כ-150 MCF שבעה תאי סרטן שד בכל באר של 96 בארות ברוטו למשך חמישה עד שבעה ימים, עד לקוטר של כ-200 עד 300 מיקרומטר באינקובטור ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו על סטרואידים בתא עם האנטיביוטיקה אנתרציקלין דוקסורוביצין הידרוכלוריד למשך שש שעות בריכוז שנע בין שני מיקרומולר לשמונה מיקרומולר בתרבית. בינוני לאחר הדגירה, שטפו את התאים OID עם תרבית, מדיום או תמיסת מלח איזון ארל לפני המיקרוסקופיה.

השתמש במיקרוסקופ הפוך והרכיב את מיקרוסקופ התאורה במישור יחיד או מודול עירור SPM על לוחית הבסיס של שולחן המיקום. ציידו את המיקרוסקופ בעדשת אובייקט מיקרוסקופ מגדילה פי 10 או פי 20 ומסנן מעבר ארוך מתאים בנתיב הזיהוי של המיקרוסקופ. לאחר מכן התקן מצלמה משולבת ליציאת הזיהוי של המיקרוסקופ.

השתמש בקרן אסופה מקבילה של לייזר או דיודת לייזר עם אורך גל עירור של 470 ננומטר מועדף והחל אותה על מודול הספין. לאחר מכן, סובב את העדשה הגלילית ב-90 מעלות, מה שמעביר את יריעת האור למצב אנכי להתאמה צירית של מותני הקרן של יריעת האור. הניחו נימים המכילים נוזל עם צבע פלורסנט במחזיק הדגימה.

חבר את מחזיק הדגימה עם הנימים לשולחן המיקום של המיקרוסקופ. יישר את מיקום הנימים כך שהוא ממורכז ומותני הקרן של יריעת האור יהיו בפוקוס. התאם את מותני הקורה על ידי וריאציה של המיקום הצירי של העדשה הגלילית עצמה.

סובב את העדשה לאחור לאחר ההתאמה. הנח את סטרואיד התא בנפרד או בקבוצות בתוך נימי זכוכית סיליקט מלבניים עם חתך פנימי של 600 על 600 מיקרומטר ועובי דופן של 120 מיקרומטר. כדי להשיג זאת, קח את הנימים הריק זקוף עם האגודל והאצבע האמצעית ואטום את הפתח העליון עם האצבע.

קרב את הפתח התחתון לספרואיד התא בנוזל הסובב אותו, שחרר את האצבע המורה מנוזל הפתח העליון עם הסטרואידים בפנים. הוא ייספג מיד על ידי כוחות נימיים. התאם את המיקום של כדור ה-S בתוך הנימים הממולאים על ידי כוח הכבידה.

לחלופין, מרחו את הסטרואידים על הנימים באמצעות פיפטינג. הקפד שפתח קצה הפיפטה יהיה מצד אחד גדול מספיק לגודל הספרואיד S ומצד שני, קטן או שווה בגודלו לקוטר הפנימי של הנימים. לאחר מכן, הניחו את הנימים המכילים את הספרואיד S במחזיק דגימה מיוחד ממיקרוסקופיה.

חבר את מחזיק הדגימה עם הנימים לשולחן המיקום של המיקרוסקופ ויישר את מיקום סטרואיד התא כך שהוא מרוכז וממוקד. הגדר את ההתאמה בין גיליון האור למישור המוקד של עדשת האובייקט של המיקרוסקופ בנתיב הזיהוי על ידי התאמת מיקום מראת ההשתקפות והעדשה הגלילית. מלאו את הנימים בסרום עגל עוברי או FCS למשך 30 דקות כדי לתמוך בהידבקות תאית מאוחרת יותר של סטרואידים תאיים למשטח הזכוכית הפנימי.

תן לציפוי ה-FCS הנותר בנימי המדולדל להתייבש לפחות 12 שעות לאחר הכנסת סטרואיד התא לנימים המצופים FCS. כמו קודם, השאירו את הנימים באינקובטור למשך שעתיים עד ארבע שעות נוספות כדי לגרום להידבקות תאית של הסטרואידים. לאחר מכן, הגדר את חלק ה-flx של המערכת המיקרופלואידית כולל מלכודת בועות.

השתמש במשאבה פריסטלטית כדי למלא את ה-flx של הצינור במדיום תרבית המכיל את תרופה או חומר הצבע הפלואורסצנטי. ראשית מהדקים את הנימים נטולי הבועות לצינור הפליטה ולאחר מכן מהדקים את הצד השני של הנימים לצינור הניקוז. כוונן את טמפרטורת הנוזל של אמבט המים לערך הרצוי.

לאחר מכן כוונן את המשאבה הפריסטלטית למהירות המשאבה הרצויה. אסוף את הנוזל הנשאב לתוך נמען עם הגדרת לולאה פתוחה לרכישת נתונים וניתוח. הגדר את עוצמת הלייזר ואת זמן האינטגרציה לרכישת התמונה.

הגדר את התוספת עבור מחסנית ZS לערך בין חמישה ל -10 מיקרומטר, דבר עדיף לניתוח נתונים תלת מימדי. מכיוון שעובי יריעת האור הוא כ-10 מיקרומטר, המשך לבצע מדידות של תמונות בודדות או Zacks על ידי וריאציה של מישור המוקד בתוך סטרואיד התא. מוצגת סריקת זאק של סטרואיד mc שבעה תאים שהודגר בעבר עם שמונה דוקסורוביצין מיקרו-מולרי במשך שש שעות.

התמונות נותנות מידע מפורט על הספיגה וההפצה התאית של דוקסורוביצין ופירוקו. תוצר בתוך שכבת התא החיצונית של דוקסורוביצין פלואורסצנטי אדום סטרואיד ממוקם בעיקר בגרעין, בעוד שבאזורי הכדור הפנימיים, פלואורסצנט ירוק המוגש על ידי תוצר פירוק הופך לדומיננטי בקרום התא. ספיגת התרופה הכימותרפית דוקסורוביצין בתא סרטן שד אנושי מקומי mc 7 S מתוארת עבור שכבת תא בודדת שנבחרה על ידי spm.

עם יישום של שני מדיום מיקרו-מולרי ותרבית בתוך מערכת הזרימה, הקרינה האדומה והירוקה של דוקסורוביצין ותוצר הפירוק שלו גדלה ברציפות עם יישום שני דוקסורוביצין מיקרו-מולרי במדיום תרבית בתוך מערכת הזרימה, הקרינה האדומה והירוקה של דוקסורוביצין ותוצר הפירוק שלו גדלה ברציפות. לאחר השליטה, לוקח רק כמה דקות מהרכבת מודול חיסול יריעות האור ועד להקלטת תמונות פלואורסצנטיות של דגימות תלת מימד. בעת מדידה ומצב הזרימה, חשוב ביותר לוודא שהדגימה נדבקת למשטח הפנימי של הנימים ולהימנע מבועות אוויר המגיעות לדגימה שעלולות לנתק אותה מהנימים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה של מיקרוסקופ תאורת גיליון אור עם המודול הרב-תכליתי המותאם למיקרוסקופים שונים.