מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את חוק הדיפוזיה של שומנים וחלבונים בקרומי תאים חיים כדי לעשות זאת. ראשית, פונקציית התפשטות הנקודה של המיקרוסקופ מכוילת על ידי הדמיית חרוזים פלואורסצנטיים ננוסקופיים. לאחר מכן, וקטורים מבוססי ליפוזום, כולל מולקולה מתויגת פלואורסצנטית מעניינת, מוכנים ומוחדרים לתאים חיים על ידי טרנספקציה או שילוב ישיר.

הדמיה מהירה של קרום הפלזמה של התא החי מתבצעת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית מלאה. לבסוף, פונקציית המתאם מחושבת וחוק הדיפוזיה המולקולרית מופק על ידי התאמה גאוסית. הנתונים המתקבלים.

זהה את אופן התנועה של השומן או החלבון הנחקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני התאוששות פלואורסצנטית קונבנציונלית לאחר גישת הלבנת פוטו או ספקטרוסקופיה קלאסית של מתאם פלואורסצנטי חד נקודתי הוא שהיא מאפשרת מדידת חוק דיפוזיה מולקולרית. אנחנו יודעים ידע ראשון בסדר העדיפויות של המערכת.

כמו כן, בניגוד למתודולוגיות הקלאסיות של מעקב אחר חלקיק בודד. כאן, תזוזה מולרית נמדדת ללא צורך בחילוץ מסלולי חלקיקים. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש במתכת זו בקלות בשילוב עם מולקולה נחשבת וצפופה יחסית כמו, למשל, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית.

בסך הכל, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית התאית, כגון כיצד תנועת חלבון או שומנים מווסתת את מבנה קרום הפלזמה והארגון הפונקציונלי התשובה לשאלות אלה ולשאלות קשורות תהיה זמינה לכולם ועל ידי שימוש במיקרוסקופ מסחרי בלבד, הדגמה של ההליך הכולל תבוצע על ידי zo, דוקטורנטית מהמעבדה. התחל פרוטוקול זה על ידי כיול פונקציית התפשטות הנקודה של מערכת ההדמיה. התחל בדילול של 10 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים פלואורסצנטית ב-90 מיקרוליטר מים מזוקקים שנוספו בעבר לצינור צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר.

סוניקציה של התמיסה למשך 20 דקות באמבט קייטרינג בסאונה באמצעות אזמל, חותכים חתיכה של סנטימטר מרובע של ג'ל ורדים 3% AGA ומניחים אותה בצלחת פטרי. הפקידו 10 מיקרוליטר מתמיסת החרוז הפלואורסצנטי המדולל על החלק העליון של הג'ל. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הפוך את חתיכת הג'ל בצלחת פטרי זכוכית של שני סנטימטרים.

שוב, באמצעות מלקחיים. לחץ כלפי מטה על חתיכת הג'ל כדי לפזר את הטיפה. לאחר מכן, הפעל את מערך הרכישה, המורכב ממיקרוסקופ פלואורסצנטי מסחרי של השתקפות פנימית כוללת.

מצויד בחממה ומצלמת E-M-C-C-D מהירה המחוברת למחשב המריץ חבילת יישומים, תוכנת פלורסנט מתקדמת ו/או תוכנת רכישת תמונות Solis. הנח את הדגימה במחזיק על המיקרוסקופ stage באמצעות חתיכת I והאור המועבר. התמקדו בגבול הג'ל.

לאחר מכן מרכז את הג'ל מעל המטרה והתאם את המיקוד כדי להתחיל את הליך יישור הלייזר בחבילת היישומים של Leica, תוכנת פלורסנט מתקדמת בוחרת יישור אוטומטי ופועלת לפי הליך היישור האוטומטי. לאחר יישור הלייזר בתוכנת הרכישה ו/או Solis, לחץ על כפתור ההגדרות. ייפתח חלון.

הגדר את חשיפת המצלמה ל-100 אלפיות השנייה, ה-EM עלה ל-1000, החזרה ל-100, וסמן את תיבת הסימון של העברת הפריימים. לאחר מכן לחץ על חלון השמירה האוטומטית והכנס את שם הניסוי. מצא שדה ראייה עם נקודות בודדות מבודדות.

התמקדו בנקודה בהירה, המייצגת בדרך כלל צבירת חרוזים. ואז רכוש 100 פריימים. חזור על שלב זה חמש עד שש פעמים כדי לקבל תמונות של כמה נקודות בודדות.

ייבא את הסדרה הנרכשת לתוכנת עיבוד נתונים כגון MATLAB וממוצע את המחסנית בזמן. לאחר מכן הציגו את תמונת העוצמה הממוצעת הנמדדת. התקרב לנקודה פלואורסצנטית בהירה וקטנה וזהה בערך את המרכז כפיקסל הבהיר ביותר של הנקודה.

לבסוף, בחר את גודל אזור העניין שברצונך לצייר סביב החלקיק, בדרך כלל מיקרון אחד ליד כדי להתאים את התפלגות העוצמה שנבחרה לפונקציה גאוסית. בחר את הפקודה gause fit. בדוק את השאריות שהתקבלו כדי לאמת את טוהר ההתאמה.

לבסוף, כייל את המצלמה כמתואר במסמך הנלווה. לאחר כיול המערכת, הגיע הזמן לתייג את התאים לרכישת תמונה. התחל להכין את הליפוזומים הנדרשים לשילוב שומנים על ידי המסת מיליגרם אחד של DOPE, מיליגרם אחד של D-O-T-A-P ומיליגרם אחד של PPE ADO 4 88 כל אחד בצינור מיקרו צנטריפוגה נפרד המכיל מיליליטר אחד של כלורופורם.

לאחר מכן, שלב 0.5 מיליליטר כל אחד מתמיסות DOPE ו- D-O-T-A-P עם 25 מיקרוליטר של תמיסת PPE ATO 4 88. הכניסו את הצינור למאייד צנטריפוגלי והתחילו את הסיבוב ב-280 גרם. הפעל את משאבת הוואקום ואפשר לה להסתובב במשך 24 שעות.

למחרת, הוסף 0.5 מיליליטר של 20 מילי-מולרי heis buffer לצינור ומערבל אותו למשך 15 דקות. לאחר מכן הנח את הצינור באמבט קייטרינג קולי וסוניקט למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. להכנת התאים יש לשטוף צלחת P 100 של שחלת אוגר סיני או תא CHOK אחד שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS.

לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, הוסף תשעה מיליליטר של D-M-E-M-F 12 בתוספת 10% של FBS כדי להשעות את התאים זרע 150 מיקרוליטר של תמיסה המכילה תא זה. בצלחת פטרי תחתית זכוכית 22 מילימטר המכילה 800 מיקרוליטר מאותו מדיום.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לשילוב שומנים, החלף את מדיום התא ב-500 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום, ודגירה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים שני מיקרוליטרים של תמיסת ליפוזום ודוגרים למשך 15 דקות נוספות.

לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS והוסיפו DM EMF 12 חדש. לפני ההדמיה לפחות 12 שעות לפני הניסוי, הפעל את חממת המיקרוסקופים כדי להעלות את שלב המיקרוסקופ ואת הרכיבים האופטיים לטמפרטורת הניסוי. השלב הקשה ביותר בהליך זה הוא הרכישה.

על מנת להבטיח הצלחה, הקפד לבצע אופטימיזציה של כל פרמטר רכישה עבור המערכת. במחקר. ביום הניסוי, הפעל את המיקרוסקופ, המתן עד שהמצלמות יגיעו לטמפרטורת העבודה.

כדי לבצע את הניסוי נשתמש בשתי מצלמות. מצלמה אחת תשמש להדמיה ומצלמה שנייה תשמש לבחירת התא. תצורה זו תאפשר את זמן הרכישה המהיר ביותר שניתן להשיג בתוכנה.

כדי להגדיר את הפרמטרים להדמיית אור מועבר. הזן 20 אלפיות השנייה עבור זמן החשיפה, הזן אחד עבור רווח EM עבור שתי המצלמות. לאחר מכן פתח את חלון מצב הניגודיות בתוכנה ועזב.

לחץ על BF כדי לבחור באפשרות השדה הבהיר. הכניסו את הדגימות למחזיק תוך כדי צפייה בדגימה דרך חלקי העיניים. הבא את הדגימה למיקוד.

לאחר מכן שלח ידנית את האור למצלמה הראשונה ודחף בעדינות את החריצים כך שרק ההחזר על ההשקעה לתמונה יהיה מואר. לאחר מכן, העבר תא לאזור שנבחר ובאמצעות התוכנה, שלח את האור למצלמה שתיים. לאחר מכן בתוכנה, צייר החזר ROI כדי ליצור הפניה.

ראשית, כדי ליישר את הלייזר לפי תוכנה בחר יישור אוטומטי. לאחר מכן, כדי להתחיל בהליך היישור האוטומטי, בחר הפעל קולימטור. לאחר מכן פתח את החממה בחלק העליון וקולימציה של קרן הלייזר.

כאשר הלייזר מיושר בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנה משמאל, לחץ על כפתור 70 כדי להגדיר את עומק החדירה ל-70 ננומטר. זה יתאים לזווית השכיחות של הלייזר על הזכוכית התחתונה של כ-70 מעלות בחבילת היישומים של לייקה. תיבת טקסט לזמן חשיפה לתוכנה פלואורסצנטית מתקדמת.

הזן 70 אלפיות שניה בתיבת הטקסט הגבר EM. הזן 1000 כדי לעשות את אותו הדבר במצלמה השנייה. פתח את חלון ההגדרות והזן את אותם מספרים בתיבות הטקסט המתאימות.

לאחר מכן לחץ על כפתור השידור החי. הקרינה תישלח למצלמה הראשונה, ותמונה של הדגימה תופיע על המסך. העבר את הדגימה עד שתא פלואורסצנטי יגיע לאזור הייחוס המעניין.

לאחר מכן לחץ על הכפתור בחזית גוף המיקרוסקופ כדי לשלוח את האור למצלמה השנייה ולהזיז את גלגל המיקום Z במדויק כדי להתמקד בקרום התא בתוכנת ו/או היחידה. פתח את חלון ההגדרות והגדר את זמן החשיפה המינימלי שניתן להשיג 1000 EM מצב חיישן חתוך 10 לחזרות החמישיות, והגדר את אפשרות השמירה האוטומטית כדי להתחיל לרכוש את סדרת התמונות. לחץ על סמל המצלמה של התוכנה והמתן לסיום הרכישה.

לאחר מכן פתח את חלון ההגדרות, השבת את רווח ה- EM והסר את הסימון מאפשרות המצב החתוך. במהלך הרכישה, טמפרטורת המצלמה עולה בדרך כלל כשתיים עד שלוש מעלות. לפיכך, לפני רכישת תמונות מתא חדש, המתן עד שתגיע לטמפרטורת העבודה האופטימלית.

שוב, לאחר השלמת ההדמיה, עקוב אחר ההוראות במסמך הנלווה כדי לחשב את התזוזה הריבועית הממוצעת מההדמיה כדי לקבל גרסה מתויגת פלואורסצנטית של המולקולה המעניינת. תאי CHOK one סומנו עם ADO 4 88 PPE או הועברו עם העברה בקולטן או T-F-R-G-F-P וצולמו על ידי TIRF כמתואר בסרטון זה. כפי שניתן לראות כאן, חוק הדיפוזיה הנמדד עבור ADO 4 88 PPE הוא שטוח, מה שמצביע על דיפוזיה חופשית ברובה כפי שהוצג בעבר על ידי פלואורסצנציה של דלדול פליטה מגורה, ספקטרוסקופיה של מתאם או מדידות FCS במקום לאחר טרנספקציה עם T-F-F-P, חוק הדיפוזיה הנמדד עבור T-F-R-G-F-P הוא בתחילה שטוח ונשאר מתחת ל-100 ננומטר של תזוזה מולקולרית ממוצעת עם מקדם דיפוזיה ממוצע לכאורה של כ-0.7 מיקרון בריבוע לשנייה.

לאחר מכן מגיעה ירידה מהירה בדיפוזיביות לכאורה עד 0.2 מיקרון בריבוע לשנייה. הערך הנמדד בדרך כלל על ידי FCS מוגבל עקיפה. מעניין לציין שכפי שמוצג בדוגמה האחרונה, הגישה הנוכחית יכולה למדוד בקלות תזוזה מולקולרית ממוצעת ברזולוציה של כמה עשרות ננומטר אפילו על ידי שימוש בתוויות עמומות וצפופות יחסית כגון GFP.

יתר על כן, קנה המידה המרחבי שבו מקדם הדיפוזיה לכאורה מתחיל לרדת קובע את הגודל האופייני של כליאה חלקית של חלבון על ידי שלד הממברנה בסביבות 120 ננומטר בהתאם להערכות קודמות. לאחר שליטה בהליך ניתוח הנתונים והרכישה הזו יכולה להתבצע תוך מספר דקות. אנו מאמינים כי טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקר בתחום הביולוגיה התאית והמולקולרית לחקור בקלות וכמותית את הוויסות המרחבי-זמני של דיפוזיה של חלבונים ושומנים בדגימות חיים.