הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור גליקופרוטאינים במעטפת אחת של RIC HIV או אישור ENV עם נוגדנים חד שבטיים. זה מושג על ידי תאי היצמדות ראשונים כדי לבטא חלבוני HIV כימריים אחד E NV על פני התא. כשלב שני, התאים מודגרים בנוגדנים חד שבטיים נגד ENV, אשר יקשרו את ENV בהתאם לחשיפה לאפיטופ.

לאחר מכן, מתווסף נוגדן משני מצומד HRP על מנת לכמת אינטראקציה של נוגדנים על ידי בדיקת כימילומינסנציה. מתקבלות תוצאות המראות רמות יחסיות של נוגדנים קשורים ל-VNV בהתבסס על יחידות האור היחסיות שנרכשו עבור כל אחד מהם. ובכן, היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קשירה מבוססת עובדות, הוא שניתן לבצע טכניקה זו עם כמות נמוכה של נוגדנים ובתפוקה גבוהה, פוסט-דוקטורנט במעבדה יבצע טכניקה זו.

תאי אוסטאוסרקומה אנושיים משמשים בניסוי זה יום אחד לפני צלחת הטרנספקציה, פעמיים כפול 10 לתאים הרביעיים לבאר. בצלחת תרבית תאים אטומה 96 באר המתאימה לקריאת זוהר. מדיום נשר משומש בתוספת סרום בקר עוברי וסטרפטומיצין פניצילין דוגרים על התאים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למחרת.

הכן את תערובת הטרנספקציה. ראשית, הציבו שני צינורות, שני מפרצים ושניים B עד שני מפרצים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של DMEM בתוספת 25 מילי-מולארי היפי, ואחריהם 10 ננוגרם של טאט וציפוי פלסמיד, ו-150 ננוגרם של HIV כימרי גליקופרוטאין מעטפת אחת המקודד פלסמיד.

שים לב שהפלסמיד המקודד TAT נדרש רק בעת שימוש בגליקופרוטאין מעטפת אחת תלויה ב-TAT ב-HIV המקודד פלסמיד לשני B בחמישה מיקרוליטרים של DMM ו-450 ננוגרם של פוליאתלין או PEI. יש להתאים את כמויות הריאגנטים וה- DNA בהתאם למספר הבארות שיש להעביר עם אותו גליקופרוטאין מעטפת אחת של HIV. לאחר מכן, מוסיפים את התוכן של שני B לשני מפרצים ומערבבים היטב על ידי מערבולת למשך 10 שניות.

דגרו את תערובת הטרנספקציה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, הוסיפו 10 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל באר של צלחת 96 הבארות הדגירה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% תחמוצת פחמן. ה- Ali SA לחקר הזיהוי של גליקופרוטאין מעטפת אחת של HIV כימרי על ידי נוגדנים חד שבטיים מבוצע יומיים לאחר הטרנספקציה של תאי האוסטאוסרקומה האנושיים.

הכן 250 מיליליטר של מאגר כביסה לכל צלחת המשמשת בו זמנית. הכן 125 מיליליטר של מאגר חוסם לצלחת על ידי הוספת 1% חלב יבש ללא שומן וחמישה מילימולר של טריס pH 8.0 למאגר הכביסה. הסר את אמצעי תרבית התאים ותערובת הטרנספקציה מצלחת 96 הבארות.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם לבאר ודגר למשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את הסופרנטנט והוסף 50 מיקרוליטר נוגדן לכל באר מדוללת לריכוז המתאים במאגר חוסם. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם ואז לחזור על תהליך הכביסה שלוש פעמים. יש לשטוף שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לאחר הכביסה האחרונה. הסר את הסאטה.

מוסיפים 100 מיקרוליטר של חיץ חוסם ודוגרים למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את הסופרנטנט והוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל אחד ל-3000 במאגר חוסם. דגירה למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר לאחר 40 דקות.

יש לשטוף שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר חסימה, ולאחר מכן שלוש כביסות עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כדי להכין את הדגימות לרכישת נתונים, הסר את הסופרנטנט מלוח 96 הבארות והוסף 30 מיקרוליטר של מצע כימילומינסנציה משופר אחד לכל באר. רכוש אות כימילומינסנציה למשך שנייה אחת לכל באר בקורא צלחות מתאים.

על פי הוראות היצרן, ההשפעה של CD 4 או S CD 4 מסיס על החשיפה של CD 4 I אפיטופים על גליקופרוטאינים של מעטפת או ENV הייתה אינטראקציה של CD 4 עם ENV גורמת לשינויים מאשרים ENV החושפים אפיטופים של 17 B ו-48 D החופפים את אתר הקישור של הקולטן, אך אינם משפיעים על התחום החיצוני המזהה נוגדן 2 G 12. כדי להעריך את ההשפעה של מוטציות נקודתיות באישור ה-NV, נעשה שימוש בשני מוטציות ENV H 66 A, שיש לו נטייה מופחתת לדגום באופן ספונטני את אישור CD ארבע קשור ו-S3 75 W, מה שגורם ל-NV למצב CD 4 קשור. נרמול הנתונים הגולמיים בהתאם לרמות הביטוי, מגלה כי H 66 A מפחית את זיהוי CD 4 I 17 B, בעוד ש-S3 75 W משפר את האות 17 B ומספיק כדי לשחזר את הפנוטיפ של H 66.

מוטציה של תאים בודקים עריסה שהועברה עם כמויות הולכות וגדלות של CD ארבע מבטא. יחד עם הפסים הכחולים של NV חשפו אותות הולכים וגדלים לנוגדנים חד-שבטיים CD four I, A שלוש, שניים ו-C 11, שזיהו אפיטופים לא רציפים בתחום הפנימי של גליקופרוטאין ENV. זיהוי GP אחד 20 ENV על ידי שני נוגדני G 12 לא הושפע.

לבסוף, הנתונים הגולמיים נורמלו לשני G 12, היעדר אפנון 32 ו-C 11 כאשר ENV הועבר עם מוטציה CD ארבע עם ירידה ביכולת לקיים אינטראקציה עם ENV מצביע על כך שהאותות המוגברים היו תלויים באינטראקציה של E NV CD ארבע לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות.