בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית תאי גזע מזנכימליים אנושיים על מטריצת עצם נקבובית. זה מושג על ידי בידוד תאי גזע מזנכימליים מקרום מי השפיר האנושי או AM hcs. לאחר מכן, דיסקי מטריצת העצם הנקבוביים מוכנים להעדיף חלוקה נכונה של חומרים מזינים לצמיחת התאים.

לאחר מכן מתרבית ה-AM hcs על דיסקי מטריצת העצם הנקבוביים. לבסוף, יחידות יוצרות מושבות נספרות ומורפולוגיה. התפשטות תאים והידבקות תאים מנותחים כולם.

בסופו של דבר, מורפולוגיה תאית, מספר היחידות היוצרות מושבה, התפשטות התאים והדבקת התאים מנותחים באמצעות צביעת מיקרוסקופיה אופטית עם צבעים חיוניים ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהתאמה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול שלנו בפציעות עצם מכיוון שאפשר להעביר את תאי הגזע המזנכימליים לביו-חומרים מקרו-נקבוביים המחקים את העצם הטבעית. כדי לבודד תאי גזע מזנכימליים מקרום מי השפיר האנושי, החזיקו את חבל הטבור ביד אחת, וביד השנייה נתקו את קרום מי השפיר, שנראה כמו יריעה שקופה.

אם הצ'ון קיים בדגימה, נתח אותו ידנית כדי להפריד אותו מרקמת מי השפיר. השתמש בחמישה מיליליטר PBS כדי לשטוף את הדגימה שלוש פעמים כדי להסיר שאריות דם והשתמש במלקחיים פשוטים כדי להסיר קרישי דם בעזרת אזמל. ערוך חתכים קטנים בקרום מי השפיר כדי ליצור שברים של כ- 0.5 סנטימטרים רבועים.

כדי לעכל את הממברנה, הניחו את השברים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.125% טריפסין 0.5 מילי-מולרי תמיסת EDTA. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות לפני שתסתובב ב-200 גרם ו-25 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. ואז השליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסיפו 15 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג 2 ודגרו במשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מדי פעם על פי פרוטוקול הלבה בכלל. מיד לאחר העיכול מוסיפים 15 מיליליטר PBS וצנטריפוגה ב -200 גרם ו -25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את כדור התא לפני שתסובבו שוב למשך 15 דקות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו 10 מיליליטר של H-G-D-M-E-M לגלולה והשעו מחדש על ידי ניעור עדין. להרחיב תאי גזע מזנכימליים. זרע שני מיליליטר תרחיף תאים בבקבוק תרבית והוסף שני מיליליטר דגירה של H HG DMEM.

ולאחר חמישה עד שבעה ימים, הסר תאים שאינם נצמדים על ידי שינוי מדיום התרבית. לאחר מכן כל שלושה ימים למשך שבעה עד 10 ימים נוספים, החלף את מדיום התרבית עד שהתאים יהיו 90% מתלכדים. הוסף 0.125% טריפסין EDTA ודגר במשך חמש דקות לפני שאיבת תרחיף התא והעברתו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

אחרי סיבוב התאים והשלכת הסופרנטנט, השתמשו ב-HG DMEM כדי להשעות מחדש את תרבית כדורי התאים. התאים ב-2 צלוחיות של 75 סנטימטרים רבועים ושומרים על התרבית במפגש של 90%. חזור על האיזציה וציפוי החזרות עד המעבר התשיעי או תת-התרבות.

לאחר מכן שחזר את התאים לצורך זרימה ציטומטרית או מחקרים אחרים. להכנת דיסקי מטריצת עצם נקבוביים. התחל בהוספת שלושה מיליליטר של HG DMEM ללא FBS לכל דיסק NKB ודגר למשך הלילה באווירה לחה על פי FAA etal למחרת.

מניחים כל דיסק בצינור חרוטי של 50 מיליליטר וסובבים בחום של 200 GS למשך חמש דקות כדי להסיר את מדיום התרבות העודף, ואז מעבירים לצלחת תרבית של 24 בארות. הוסף 500 מיקרוליטר H-G-D-M-E-M וודא שאין בועות אוויר על הדיסקים כדי להעדיף את החלוקה הנכונה של חומרים מזינים ותאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס משלוש תת-תרבויות לאט וברציפות.

זרעו תרחיף סלולרי על פני הדיסק הביו-חומרי הנשוי מראש ודגרו למשך 30 דקות לאחר הדגירה, הוסיפו בזהירות 1.5 מיליליטר של H-G-D-M-E-M לפני המלחמה ותחזקו את התרבית למשך שלושה ימים כדי לבצע בדיקת התפשטות תאים, הוסיפו 150 מיקרוליטר של חומר צבע חיוני AB לדגימות דיסק התא בהתאם להנחיות היצרן. מדוד מיד את הספיגה ב-570 ננומטר עם אורך גל ייחוס של 600 ננומטר. דגרו על התאים במשך שבעה ימים ומדדו את הספיגה כל 24 שעות.

מדוד יחידות יוצרות מושבה על ידי תרבית 100 תאים לכל דיסק תרבית רקמה של 100 מילימטר ב-H-G-D-M-E-M ודגירה במשך 14 יום. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התרבית והשתמש ב-0.5% סגול קריסטל במתנול כדי להכתים את התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הצלחות פעמיים לפני השימוש במיקרוסקופ כדי לספור את התאים כפי שניתן לראות בהיסטוגרמות ציטומטריית זרימה אלה.

אוכלוסיית התאים שבודדה מקרום מי השפיר הגיבה חזק לסמנים המזנכימליים של פני השטח CD 90, CD 73 ו-CD 1 0 5 והגיבה באופן שלילי לסמנים ההמטופויאטיים CD 34 ו-CD 45, מה שמצביע על כך שה-AM HSCs היו למעשה מזנכימליים. כפי שמוצג במיקרוגרפיות הסריקה הללו, פני השטח של החומר הביולוגי היו מכוסים בתאים כדוריים ביום הראשון וה-AMC ככל הנראה הוצמדו למשטח מטריצת הבקר ביום השביעי. באמצעות תהליכי מילוי בהגדלה גבוהה יותר, התאים יוצרים קשר זה עם זה.

גרף זה מראה ירידה קטנה ביחידות הספיגה היחסיות של מטריצת בקר. לאחר יום אחד של דגירה, נוכחות הפיגום גורמת לעלייה בשגשוג התאים, מובהקת סטטיסטית בהשוואה לתרבית המבוצעת בהיעדר מטריצת בקר באמצעות בדיקת היחידה היוצרת מושבה לניתוח תאי גזע. גרף זה ממחיש כי ה-AM HSCs מבודדים כפי שמודגם בסרטון זה, ומצופים בצפיפות משתנה שימרו את יכולתם ליצור מושבות נפרדות ב-14 יום בתרבית.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להעביר את תאי הגזע המזנכימליים לביו-חומרים מקרו-נקבוביים.