העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג יעילות גבוהה, פלסמיד, טרנספקציה של תאי רשתית כדי לאפשר מחקרים גנטיים פונקציונליים בתרביות רשתית ראשוניות. זה מושג על ידי איסוף עוברי תרנגולות בשלב 27 של מערכת ההמבורגר והמילטון. בימוי מתאים הוא קריטי להשגת יעילות אופטימלית.

השלב השני הוא לנתח את העיניים העובריות ולהסיר את האפיתל הפיגמנטי ברשתית החושף את הרשתית העצבית. לאחר מכן, הרשתית מונחת בתא מלא בתמיסת פלסמיד. לאחר מכן הוא נתון לאלקטרופורציה בתנאים אופטימליים באמצעות אלקטרודות בהתאמה אישית שנבנו בקלות.

השלבים האחרונים הם הסרת גוף הזגוגית והעדשה וניתוק הרשתית העצבית לתאים בודדים לתרבית ראשונית בצפיפות נמוכה. בסופו של דבר, ניתן לדמיין תאים שעברו טרנספטציה על ידי ביטוי של גנים מדווחים או אימונוהיסטוכימיה, וניתן להעריך את המניפולציה הגנטית היעילה על ידי הערכת הביטוי של גנים במורד הזרם ו/או שינויים פנוטיפיים בתאים היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ליפופקציה או טרנספקציה כימית, הוא שהיא מגדילה את קצב הטרנספקציה של תאי הרשתית פי חמישה ומניבה יעילות של 22 עד 25% מכלל אוכלוסיית התאים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של קולטני האור, מכיוון שהיא מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים בתרביות רשתית ראשוניות ברמת יעילות שיכולה לספק תובנות בעלות משמעות ביולוגית. ההשלכות של טכניקה זו חורגות מעבר למחקר בסיסי מכיוון שניתן להתאים אותן בקלות לטכנולוגיות תפוקה גבוהה לפיתוח תרופות. התחל בדגירת ביצי תרנגולת מופרות עם קרן רגל לבנה ב-37.5 מעלות צלזיוס ו-60% לחות יחסית למשך חמישה ימים בחממת ביצים.

לפני הניסוי, השג חוט קופסה המשמש בדרך כלל במשיכות מיקרו פיפטה. השתמש במלקחיים כדי לבטל את הקופסה המרובעת וליישר את החוט לרצועה ארוכה. לאחר מכן בעזרת סרגל כמדריך, כופפו את החוט לצורת u מרובעת, באורך שלושה מילימטרים בבסיס וגובה שני מילימטרים בצד אחד עם הצד השני, האורך הנותר של החוט השתמש במלקחיים כדי לטבול את האלקטרודה באתנול 96% ולהדליק לזמן קצר את האלקטרודה על מנת לעקר אותה.

לאחר מכן חבר כבל חשמלי עם קליפ תנין קטן לזרוע הארוכה של האלקטרודה. לאחר מכן, נקו את האלקטרודה העבה עם קצה הזהב באמצעות אתנול 70%. לאחר מכן הכינו את תא האלקטרופורציה על ידי חיתוך המכסה של צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר באמצעות מספריים מעוקרים והצמדתו עם הצד השטוח כלפי מטה לצלחת פטרי של 100 מילימטר באמצעות סרט.

לאחר מכן, עקרו את כלי המיקרו-דיסקט על ידי טבילת קצות המכשיר באתנול 96% והבערה קצרה שלהם. כמו כן, נגב את היקף החיתוך באמצעות 70% אתנול. חממו בקבוק של תמיסת מלח איזון סטרילית ללא סידן ומגנזיום של הנקס באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שהוא חם, השתמש בו כדי למלא צלחת פטרי סטרילית בגודל 100 מילימטר שלושת רבעי הדרך מלאה. לאחר מכן, הנח את תא האלקטרופורציה תחת מיקרוסקופ דיסקציה נקי. לאחר מכן חבר את האלקטרודות למנגנון האלקטרופורציה, וודא שהאלקטרודה בהתאמה אישית מחוברת לקוטב השלילי, והאלקטרודה עם קצה הזהב מחוברת לקוטב החיובי של המכונה.

נקו את הביצים על ידי ניגוב החלק החיצוני של הקליפות באתנול 70%. היזהר ושמור על סטריליות לאורך שאר הפרוטוקול. כדי להימנע מנשיאת זיהום לתרביות באמצעות מלקחיים גדולים ומעוקלים של מלוני, פתחו בזהירות חור בקליפת הביצה על ידי הקשה עדינה על הקצה המעוגל של הביצה ישירות מעל תא האוויר.

משוך החוצה את כל חלקי הקליפה עם זוג מלקחיים נוסף. הסר את הממברנות ואסוף את העובר על ידי הוצאתו בזהירות מהביצה. מניחים את העובר בצלחת פטרי עם תמיסת מלח Hanks Balance ללא סידן ומגנזיום.

כאשר נאסף מספר מתאים של עוברים, ודא שכולם בשלב הנכון. על פי מערכת ההמבורגר והמילטון ליעילות אופטימלית, העוברים חייבים להיות בשלב 27. המתת חסד של העוברים על ידי עריפת ראשים באמצעות מלקחיים מלוני, ולאחר מכן השתמש בפינצטה של דומונט כדי לגרעין את העיניים בזהירות.

העבירו את העיניים לצלחת פטרי חדשה עם HBSS ללא סידן ומגנזיום. התחל בחלק האחורי של כל עין קרוב לראש עצב הראייה, ולאחר מכן הכנס קצה אחד של כל זוג פינצטה דומונט בין הרשתית העצבית לאפיתל פיגמנטי ברשתית. עבדו מהחלק האחורי של העין לכיוון הקדמי, השתמשו בפינצטה כדי לנתח בזהירות את האפיתל הפיגמנטי של הרשתית.

להיזהר שלא לפגוע ברשתית העצבית. הגדר את האלקטרו פרטר לספק חמישה פולסים מרובעים של 15 וולט במשך 50 אלפיות השנייה ומרווח של 950 אלפיות השנייה. לאחר מכן, מלאו את תא האלקטרופורציה ב -120 מיקרוליטר תמיסת פלסמיד בריכוז של 1.5 מיקרוגרם למיקרוליטר ב- PBS.

לאחר מכן הנח את האלקטרודה השלילית בצורת U בתוך תא האלקטרופורציה של מכסה המיקרו צנטריפוגה. בעזרת זוג פינצטה מעוקלת של דומונט. העבירו רשתית אחת לתא האלקטרופורציה והניחו אותה בתוך האלקטרודה בצורת U.

מקם את הרשתית כך שהחלק האחורי שלה יהיה לכיוון החלק התחתון של האלקטרודה והעדשה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הנח את האנודה כך שתיגע בחלק הקדמי של העין ליד העדשה. לאחר מכן השתמש בדוושת הרגל של האלקטרו ריידר כדי לספק חמישה פולסים חשמליים.

בסיום, העבירו את הרשתית החשמלית לצלחת פטרי חדשה מלאה ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום. חזור על הליך האלקטרופורציה עם כל גביעונית רשתית נוספת. ניתן לאלקטר עד שש כוסות רשתית עם אותה תמיסת פלסמיד ללא ירידה משמעותית ביעילות הטרנספקציה.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים עם שיניים קשורות כדי להסיר בעדינות את העדשה וגוף הזגוגית מכל דגימה אלקטרופוטית תוך החזקת העין במקומה עם החלק האחורי של פינצטת הדומונט המעוקלת לאחר שהוסרו, המשך לדיסוציאציה ותרבית של תאי הרשתית האלקטרופוטיים בטכניקות סטנדרטיות. תאי הרשתית המוצגים כאן עברו אלקטרופוציה עם ביטוי GFP, פלסמיד, מנותקים ותרבית במשך ארבעה ימים. מיקרוגרפים פלואורסצנטיים הראו גרעיני כתמים ו-GFP המבטאים תאי רשתית.

צביעת נוגדנים נגד ויסין בוצעה לזיהוי תאים קולטני אור. הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול זה עברו אופטימיזציה כדי להשיג יעילות טרנספקט בממוצע של 22% בהשוואה לכלל האוכלוסייה לאחר ארבעה ימים. בתרבות, מדד זה עולה ליעילות ממוצעת של 25% כאשר רק אוכלוסיית קולטני האור נחשבת נחשבת לאחר שליטה.

טכניקה זו מאיסוף עוברים ועד לניתוח אלקטרו יכולה להיעשות תוך פחות מ-30 דקות לשש עיניים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלא צריכות לעבור יותר משלוש שעות בין איסוף העוברים לציפוי תאים מנותקים על מנת לקבל תרבית באיכות טובה. ניתן ליישם טכניקה זו על ביטוי יתר או מתאם של גנים, למשל, באמצעות מערכת RNAi.

בנוסף, רשתית שעברה טרנספטציה בעקבות הליך זה יכולה לשמש לתרביות רשתית אורגנוטיפיות.