מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים בחדירות כלי הדם, לכמת תגובות אלרגיות מקומיות. זה מושג על ידי רגישות החיות תחילה לאלרגן, כגון O אלבומין. השלב השני הוא לאתגר את האוזניים בהזרקה תוך עורית של האלרגן.

ואז הצבע הכחול של אוון מוזרק לווריד הזנב. השלב האחרון הוא לחלץ את הצבע מהאוזניים המאותגרות על ידי דגירה למשך הלילה. בצורה, אמיד פוטומטריית ספקטרו בסופו של דבר משמשת לכימות כמות הצבע שנכנסה לאוזן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שאקסטרוואזציה של צבע נמדדת על ידי ספקטרומטריה. המשמעות היא שהבדיקה אינה נתונה בקלות להטיית הצופה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהזרקות ורידים תוך עוריים וזנב מאתגרות מבחינה טכנית ודורשות תרגול רב כדי להשיג מיומנות.

התחל בהבאת תמיסת מלאי ביציות לטמפרטורת החדר לשימוש. בטמפרטורת החדר, יש לדלל את מלאי הביציות לריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ב-XPBS אחד. השתמש בצינור תחתון עגול מפוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר.

מערבל את הצינור במהירות בינונית, והוסף בזהירות נפח שווה של הומוגני ביסודיות. הזריק אלום לתמיסת הביציות טיפה. במקביל, הכינו תמיסת בקרה שלילית של אלום מעורבב ל-PBS ביחס של אחד לאחד באותה טכניקה.

לאחר מכן מכסים את הצינורות ומאבטחים אותם למערבולת. הפעל את המערבולת בהגדרה הנמוכה ביותר למשך חצי שעה כשהצינורות מחוברים. כאשר הפתרונות מוכנים, המשך מיד ברגישות לעכברי BAB.

טען את תערובת אלום הביציות למזרק של מיליליטר אחד. לאחר מכן, בעזרת מחט בגודל 27, הזרקו 100 מיקרוליטר לצפק של כל עכבר. חזור על כך עבור עכברי הביקורת השליליים המשתמשים בתמיסת אלום ללא ביציות במהלך שלושת השבועות הבאים.

חזור על תהליך זה בסך הכל שלוש זריקות לעכבר לאחר ההזרקה האחרונה, המתן לפחות שבועיים לפני ביצוע בדיקת האנפילקסיס המקומית ממלאי ביציות קפואות. התחל בהכנת פתרון עבודה של חמישה מיליגרם למיליליטר ב- PBS. מערבל אותו לזמן קצר, תוך שימוש ב-5% ISO פלואור.

הרדמו עכבר רגיש, וכאשר הוא הופך לחסר תנועה, חייגו את האיזו פלואור ל-3%עכשיו טענו מזרק אינסולין של שלושה 10 עם 10 מיקרוליטר מתכשיר הביציות, וכסו אותו במחט בגודל 31 וטענו מזרק שני עם 10 מיקרוליטר של XPBS אחד. לאחר מכן עטפו צינור חרוטי של 15 מיליליטר עם סרט דבק שקוף עם הצד הדביק החוצה מתחת למיקרוסקופ מנתח, הצמידו את הצד הגבי של האוזן השמאלית של עכבר מורדם לצינור. הכנס את המחט של מזרק PBS עם הצד המשופע כלפי מעלה בין שני עלי האוזן והזריק לאט את 10 המיקרוליטרים המלאים.

הימנע מפגיעה בכלי דם. הזרקה מוצלחת תגרום לבליפ תוך-עורי ברור. זה קריטי להזריק את כל הנפח לאוזן.

אם נוזל כלשהו דולף מאתר ההזרקה, לא ניתן להשתמש בבעל החיים בניתוח. כמו כן, אם המחט עוברת דרך האוזן לחלוטין או שורטת את פני האוזן, הבדיקה אינה תקפה מכיוון שטראומה זו תבלבל את התוצאות לאוזן ימין. השתמש באותה שיטה כדי להזריק את הביציות במהלך פרק הזמן של שלוש דקות.

העבירו את העכבר למסננת והניחו אותו מתחת למנורת חום. לאחר מכן הזריקו לאט 200 מיקרוליטר של 0.5% צבע כחול אוונס לווריד הזנב. באמצעות מחט בקוטר 27, הזרקה מהירה עלולה להזיק אם הכלי נהרס לפני הזרקת כל הצבע.

המשך להזריק בצד הנגדי של הזנב. כעת המתן 10 דקות ולאחר מכן המת את העכבר בפחמן דו חמצני, ואחריו נקע צוואר הרחם. לאחר המתת החיה השתמשו במלקחיים ובמספריים כדי להסיר את האוזניים.

תפוס את קצה האוזן עם המלקחיים מבלי להפעיל לחץ על מקום ההזרקה. לאחר מכן חותכים קרוב לרכס הסחוס בבסיס האוזניים, אך לא דרכו. אסוף כמה שיותר רקמות.

כעת, תוך נקיטת אמצעי זהירות נאותים, הוציא 700 מיקרוליטר של אמיד צורה לכל אוזן לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה. העבירו אוזן לכל צינור ודגרו אותם למשך הלילה בחום של 63 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש, למחרת רוב הצבע יופק, אך האוזניים עשויות להיראות מעט כחולות. הוסף 300 מיקרוליטר מכל דגימה בשכפול לצלחת של 96 בארות.

הימנע מהעברת פרווה כלשהי ואל תיצור בועות לחסר. טען שתי בארות עם 300 מיקרוליטר אמיד צורה. לאחר מכן מדוד את הספיגה ב-620 ננומטר.

הפחיתו את הערכים מהרקע ונתחו את התוצאות. בעלי חיים רגישים ל-PBS לא הגיבו לאתגר הביציות או לאתגר PBS. כצפוי, שתי האוזניים נותרו לבנות.

השנה שבה קיבל את אתגר ה-PBS בבעלי חיים רגישים ל-OVA הייתה לבנה לחלוטין או כחולה קלה, ממוקמת במקום ההזרקה שבו האוזניים שלו שקיבלו את אתגר הביציות הפכו כהות יותר בהדרגה במשך 10 דקות לאחר מתן הצבע, רקמת האוזן שטופלה ב-IDE של בעלי חיים רגישים ל-PBS הייתה בעלת קריאות ספיגה זניחות לאחר אתגר PBS ו-OVA. בעוד שעבור בעלי חיים רגישים לביציות, הזרקת PBS הביאה בדרך כלל לקריאת ספיגה ממוצעת של 0.13. לעומת זאת, אתגר ביציות של 50 מיקרוגרם הביא לקריאת ספיגה ממוצעת של 0.58.

ניתן להתאים את כמות הביציות המשמשת לאתגר בגבולות. לדוגמה, 20 מיקרוגרם של אתגר הביא לספיגה ממוצעת של 0.30. עם זאת, אתגר של פחות מ-20 מיקרוגרם לא נתן תוצאות אמינות.

למרות שזה מאתגר ברגע שאדם מיומן בהזרקות תוך עוריות ותוך ורידיות, ניתן לבצע טכניקה זו על בעל חיים אחד תוך כ-15 דקות כאשר שני אנשים עובדים יחד, אחד מבצע את זריקות האוזן והשני מבצע את הזרקות וריד הזנב. ניתן לבצע את ההליך על 10 בעלי חיים תוך כשעה. בדיקה זו היא רב-תכליתית מכיוון שהיא יכולה לשמש לאנפילקסיס עורי אקטיבי ופסיבי כאחד.

זה יכול לשמש גם למגוון רחב של אלרגנים. אל תשכח שלאיזוף פלואור יכולות להיות השפעות שליליות על מערכת הרבייה האנושית. השתמש בו רק בחדר מאוורר היטב ויש לך מיכל ניקוי מחובר לתא האינדוקציה כדי לנטרל גז פסולת אם את בהריון.

בזמן השימוש באיזוף פלואור, יש ללבוש מסכת מסנן פחמן כדי למזער את החשיפה.