Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב Melanogaster דרוזופילה
13 בדצמבר 2014
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות ההימנעות של אנשים לחוצים. פרדיגמה זו היא עוצמתית אך ידידותית למשתמש וניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההשפעה של גנים וסביבה על סוג אחד של אינטראקציה חברתית ב-Drosophila melanogaster.
מטרת הליך זה היא לכמת את תגובת הזבובים לאות החברתי הנפלט על ידי אנשים לחוצים. זה מושג על ידי איסוף ראשון, מגיב ופולט זבובים לא יותר מיומיים לפני הניסוי. השלב השני הוא להעביר גם את זבובי הפולט וגם את זבובי המגיב לבקבוקונים טריים שעתיים לפני הניסוי ולתת להם להתרגל לחדר המבוקר הסביבתי שבו תבוצע הבדיקה.
לאחר מכן, זבובי המגיב ממוקמים ב-TMAs ובהינתן הבחירה בין בקבוקון שבו זבובים נלחצו בעבר, ובכך מכילים את ריח הלחץ של הדרוזופילה לבין בקבוקון טרי, השלב האחרון הוא לספור את מספר זבובי המגיבים בבקבוקון הטרי בבקבוקון ה-DSO ובמעלית כדי לכמת את תגובתם ל-DSO. בסופו של דבר, מבוך ה-T משמש למדידת ההימנעות של זבובים מאות מתח חברתי, במיוחד ריח המתח של גילו. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשהייתי פוסט-דוקטורנט ב-Caltech.
באותה תקופה, גרג סו והמנחה שלו לפוסט-דוקטורט דיוויד אנדרסון, היו מעורבים בחקר פחד או הימנעות חברתית בפילה, אבל לא הייתה בדיקה קיימת לכך. הם פנו אלי מכיוון שביצעתי הרבה מבחני התנהגות במעבדה של מותגי S ובזמן שביצעתי ניסויי צילום מוניות ולמידת חוש הריח, שמתי לב שזבובים נמשכים לבקבוקונים שבהם זבובים אחרים בילו זמן מה ללא הפרעה תוך הימנעות מבקבוקונים שבהם זבובים היו לחוצים באותו זמן עם התחשמלות. רץ. הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שתהליך הניסוי של בדיקת ההימנעות החברתית דורש תרגול מסוים כדי להיות מהיר ויעיל בהעברת ה-BIOS מבלי לאבד זבובים או DSL.
היתרון העיקרי של טכניקה זו לבחינת אינטראקציות חברתיות על פני שיטות קיימות כמו מעקב וידאו בעזרת מחשב, הוא שזו בדיקה שקל לשלוט בה וליישם, אך היא חזקה מאוד לכמת את ההימנעות החברתית של אנשים לחוצים. כדי להתחיל בניסוי, חותכים יריעת פוליאתילן נקבובית לכיסוי קופסה בגודל 12.7 ס"מ על 10.2 סנטימטר. מלאו את הקופסה בקרח כתוש וכסו אותה בסדין כדי להשלים את מנגנון ההרדמה הקרה של דרוזופילה.
בצע את הניסוי על ספסל מכוסה בכיסוי ספסל לבן ולוח מחיק מלפנים כדי להבטיח תנאי תאורה הומוגניים. לאחר מכן, הכן את מנגנון חברי הצוות של שואב זבוב המערבולת, מדחום וטיימר. יום עד יומיים לפני הניסוי זבובים מרדימים את המעי הגס.
העבירו את הזבובים עם משפך לצינור של 50 מיליליטר והניחו את הצינור לדלי קרח מבודד מתחת לגובה הקרח. המתן חמש דקות עד שהזבובים ייכנסו לתרדמת צוננת. לאחר מכן העבירו את הזבובים על יריעת הפוליאתילן הנקבובית בטמפרטורת החדר ומיינו את זבובי המגיב תחת מיקרוסקופ סטריאו.
הפרד זבובים זכרים בני שלושה עד שבעה ימים מנקבות זבובים, ותחזק את הזבובים הללו בקבוצה של 40 זבובים פולטים מעורבים של קנטון. בעזרת שואב פה אפשר לזבובים. לילה אחד של התאוששות כדי למזער כל השפעה מבלבלת של האוסף על ההתנהגות.
לאחר מכן, פתח את שקית בקבוקוני הבדיקה כדי להחליף את האוויר המעופש מריח הפלסטיק בשקית באוויר צח. לפני הניסוי יש לוודא שטמפרטורת חדר הבדיקה היא 25 מעלות צלזיוס, שיש בחדר אור אחיד ושהלחות גבוהה מ-30%שעתיים לפני הניסוי העבירו את זבובי המגיב והפולט לבקבוקוני מזון טרי ואפשרו לזבובים להסתגל לסביבה על הספסל בו יבוצע הניסוי. הנח את מבוך התה על כרית החבטה והדק את תפס הבורג כך שהמעלית תהיה יציבה.
לאחר מכן, העבירו את זבובי המגיב לבקבוקון בדיקה טרי והצמידו את הבקבוקון המכיל את זבובי המגיב על גבי מבוך התה. לאחר מכן הטה את מנגנון מבוך התה והקש אותו על מחצלת החבטה כך שזבובי הפירות ייפלו במעלית. הזיזו את החלק העליון של המעלית כלפי מטה כדי למקם את הזבובים בין החלק העליון והתחתון של ה-TMA וודאו שהמעלית נמצאת מעל נקודת הבחירה כדי למנוע מהזבובים לברוח בזמן שזבובי המגיבים מסתגלים לסביבה החדשה.
מניחים את זבובי הפולט בבקבוקון בדיקה טרי ומעליו חתיכת כותנה. מערבב את הבקבוקון על מיני מערבולת בצורה זו. הזבובים יפלטו DSO, יעבירו את הזבובים לבקבוקון מזון ויניחו במהירות את הבקבוקון המלא ב-DSO באחד משני הצדדים של הצוות.
חלופה בצד המיקום עבור הבקבוקון המלא DSO. בכל ריצה חדשה, הניחו בקבוקון בדיקה טרי בצד השני של צוות A ואז הורידו את המעלית לגמרי כדי שזבובי הפירות יוכלו לבחור בין בקבוקון הבדיקה הטרי לבין הבקבוקון המלא ב-DSO. הפעל מיד את הטיימר.
לאחר דקה אחת, הזיזו את המעלית למעלה כדי להפריד את הזבובים בבקבוקון הטרי ואת בקבוקון ה-DSO מהזבובים שנתקעו במעלית. ספרו את מספר הזבובים בכל בקבוקון ובמעלית. חזור על זה.
עבור כל גנוטיפ ו/או מצב גודל קבוצת הזבובים המגיבים אינו משפיע על הימנעותם מ-DSO. לאחר ביצוע הניסוי בטווח של 10 עד 80 זבובים, מבחן T לא הראה מובהקות סטטיסטית בין מדדי הביצועים או ה-PI של זבובי המגיבים. מספר הזבובים הפולטים משפיע על הימנעות הזבובים מ-DSO כפי שמודגם בגרף זה, המייצג ניסויים שונים.
שימוש ב-10 עד 160 זבובים פולטים כל אחד. הימנעות משמעותית עדיין זוהתה עם 10 זבובים לחוצים בלבד. הבחירה, הזמן והרקע הגנטי של זבובי הפירות משפיעים על התגובה ל-DSO כפי שמודגם בגרף זה, הממחיש תגובה של זני קנטון ואלווד.
שני הגנוטיפים מציגים הימנעות חזקה יותר מה-DSO מאשר אורגון וכמה זני מרקין לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לזהות את המעגל העצבי העומד בבסיס התפיסה וההימנעות מ-CO2, אחד ממרכיבי ה-DSO. הוא שימש גם לחקר תפקידם של גנים מועמדים לאוטיזם בהשפעה על התנהגות חברתית.
בג'וזף אנו גאסטר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מחמש דקות לכל שכפול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת הימנעות חברתית מהכנת זבובי הפולט והמגיב לפני בדיקתם ועד ליצירת ביוגרפיות השדה של DSL והמניפולציה של חברי הצוות כדי לספק למגיבים בחירה בינארית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מכמת את התנהגות ההימנעות של Drosophila melanogaster בתגובה לאותות חברתיים מאנשים לחוצים. הוא מעריך ביעילות את ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים על אינטראקציות חברתיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה התנהגותית
- גנטיקה
רקע
- הבנת האינטראקציות החברתיות ב-Drosophila היא חיונית לחקר תגובות התנהגותיות.
- אותות לחץ יכולים להשפיע על התנהגותם של זבובים פולטים ומגיבים כאחד.
- שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות הגנטיות והסביבתיות על התנהגות חברתית.
- הגדרת מבוך T היא גישה חדשנית למדידת התנהגות הימנעות.
מטרת המחקר
- כימות התגובה של זבובים לאותות לחץ חברתיים.
- חקירת ההשפעות של לחץ על אינטראקציות חברתיות ב-Drosophila.
- פיתוח פרוטוקול ידידותי למשתמש עבור מבחני התנהגות.
שיטות ששימשו
- איסוף זבובים מגיבים ופולטים לפני הניסוי.
- הרגלה של זבובים בסביבה מבוקרת לפני הבדיקה.
- שימוש במבוך T להערכת הימנעות מחומרי ריח לחץ.
- ספירת זבובים מגיבים בבקבוקים שונים כדי לכמת תגובות.
תוצאות עיקריות
- זבובים מגיבים הראו הימנעות ניתנת למדידה מבקבוקים המכילים אותות לחץ.
- הפרוטוקול מבדיל ביעילות בין תגובות לזבובים לחוצים וללא לחץ.
- התוצאות מצביעות על שינויים התנהגותיים משמעותיים בתגובה לאותות לחץ חברתיים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר אינטראקציות חברתיות ב-Drosophila.
- הממצאים תורמים להבנת הגורמים הגנטיים והסביבתיים המשפיעים על התנהגות.
- גישת מבוך T יכולה להתאים למחקרים התנהגותיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput quantification of social avoidance behavior in Drosophila, providing a genetically tractable model for de-risking target validation in neuropsychiatric drug discovery. By linking genetic and environmental modulation to measurable behavioral outputs, it supports early-stage mechanistic screening for compounds affecting social cognition pathways. The low-cost, robust design facilitates scalable screening of mutant libraries or environmental conditions relevant to social deficit phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic contributions to social behavior phenotypes through strain-specific avoidance responses.
- Operational Value: Supports functional validation of candidate genes by quantifying avoidance as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates target de-risking by establishing dose- and genotype-dependent behavioral responses to social stress signals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative, binary-choice readout suitable for screening genetic or pharmacological modulators of social avoidance.
- Operational Value: Enables assay standardization through controlled emitter/responder ratios and environmental habituation.
- Scalability: Compatible with multi-genotype screening due to short duration (<5 min/replicate) and minimal equipment needs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Connects Drosophila social avoidance mechanisms to conserved pathways relevant to human social cognition disorders.
- Preclinical Continuity: Supports cross-species validation by measuring conserved behavioral responses to stress-induced chemical signals.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of genetic background with avoidance phenotypes for target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable screening prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying avoidance behavior as a function of genetic and environmental variables.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing responder performance across conditions.
- Analytics: Generates performance indices (PIs) enabling statistical comparison of avoidance strength between genotypes.
- Translational Research: Aligns with phenotypic screening for social deficit models via conserved stress-response pathways.
- Enterprise Reuse: Reusable across projects studying social behavior, stress reactivity, or neuropsychiatric target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in social behavior studies through quantifiable, genetically modifiable avoidance responses.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized habituation, emitter titration, and blind counting procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic evidence of target engagement in social circuits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying modifiers of social avoidance with high predictive confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, sex separation, and behavioral assay execution.
- Depends on controlled environmental conditions (25°C, >30% humidity, uniform lighting) for reproducible results.
- Necessitates standardization of emitter fly numbers and stress induction protocols across runs.
- Adaptation to alternative genotypes requires validation of baseline avoidance performance.
- Limited to measuring avoidance; does not capture approach or other social interaction dimensions.
