בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק
7 באוקטובר 2014
המעי הדק הוא לעתים קרובות נחשף לרעלים שיכולים להשפיע על זרימת דם ולהשפיע לרעה על מזין קליטה. שימוש בעורק multimyograph וmesenteric ווריד מבודד, תרכובות או רעלים של עניין יכול להיות מוקרן לvasoactivity.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד חתכים של עורקים וורידים מזנטריים של בקר בגרף מולטימ כדי לאפשר סינון של תרכובות ניסיוניות לפעילות כלי הדם שלהן. זה מושג על ידי איסוף תחילה דגימת רקמה מזנטרית מהחיה. בשלב השני מנקים את הדגימה וחותכים את הכלים.
לאחר מכן, החלקים מותקנים ומאוזנים על שתל המיו. בשלב האחרון, הכלים המבודדים נחשפים לתרכובות המעניינות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקה ביולוגית זו של העורקים והוורידים כדי להעריך את פעילות כלי הדם של התרכובות ואת ההשפעות שיש להן על זרימת הדם בתוך כלי הדם המזנטרי של בקר.
היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כמו מדידת זרימת דם in vivo, הוא שבעזרת טכניקה זו, רקמה מבעל חיים בודד יכולה להיחשף למספר תרכובות בו זמנית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה בתסמונות בעלי חיים ספציפיות מאוד שעלולות לגרום להתכווצות כלי דם כגון פסקו, רעילות או ארגוטיזם, ניתן ליישם אותה גם על תרחישים אחרים שעשויים לעניין את החוקרים, כגון תרופות המפותחות או מוצרים טבעיים. בנוסף, ניתן ליישם אותו לא רק על כלי דם של בקר, אלא גם על כלי דם מכל מין אחר של יונקים.
לאחר הוצאת כלי הדם מהרקמה המזנטרית, השתמש בזוג מלקחיים כדי להניח את דגימת הרקמה על משטח חיתוך ולהטביע אותה חלקית בתרנגולות קרות כקרח. לאחר מכן באמצעות תכשיטן מספר חמש, מלקחיים ורעש, מספריים של איריס מנתחים בזהירות את השומן ורקמות החיבור המקיפות את הכלים. לאחר הפרדת העורק והווריד, זהה את פתח הכלי בקצה אחד של הקטע ותפס בזהירות את הפאשיה המקיפה את הכלי בעזרת המלקחיים.
לאחר מכן החלק את קצה המספריים מתחת לפאשיה המוגבהת כדי לבצע חתך עם המספריים במקביל לכלי. לאחר החתך הראשוני, חתכו את שני צידי הכלי כדי לנתק עוד יותר את השומן ורקמות החיבור, ולנקות את הכלי. הניחו את כלי הדם הנקיים בשפופרת טרייה של מאגר האור Krebs Henzel, ואחסנו את הצינור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד 24 שעות.
כשהוא מוכן, השתמש בפורס רקמות כדי להשיג חתכים עקביים של הכלי המעניין למספר הרצוי של שני חתכים מילימטריים, ולאחר מכן בדוק כל קטע בהגדלה של פי 12.5 כדי לוודא שלכל דגימה אין חריגות, ענפים, שסתומים או נזק שטחי שנרכש במהלך תהליך החיתוך והניקוי. אחסן את חלקי הכלי הפרוסים המקובלים שקועים במאגר אור קרבס הנזל בארבע מעלות צלזיוס למשך עד 30 דקות. לאחר מכן הכנס בעדינות את התומכים דרך הלומן של כל דגימה, והשתמש במיקום המיקרו על שתל המיאו כדי להגביר בהדרגה את המתח כדי להרכיב את הכלי על שתל המיאו.
הקפד לא למתוח את הכלים מעל קריאה של שניים עד שלושה גרם. לאחר שכל התאים מכוסים, שואבים את המאגר מכל תא וממלאים אותם מחדש בחמישה מיליליטר של מאגר טרי. לאחר שכל חלקי הכלי התאזנו במשך 1.5 שעות כדי להשיג מתח מנוחה יציב של גרם אחד ב-500 מיקרוליטר של 1.32 אשלגן כלורי מולארי לריכוז סופי של 0.12 מולארי לתמיסה של 5.5 מיליליטר, רחיצת הכלי.
אין לכוונן את המתח באופן ידני, מכיוון שהתגובה המקסימלית לאשלגן כלורי תשמש לנורמליזציה של נתוני הטיפול, החלף את התמיסה במאגר אור קרבס הנזל טרי במרווחים של 15 דקות עד שהמתח יחזור לערך הבסיס של גרם אחד. לאחר שהמתח חזר לקו הבסיס, הוסף את התקנים ב-25 מיקרוליטר לכל תא בהתאם לפרוטוקול הניסוי. לאחר הוספת התקן האחרון, הפעל טיימר של תשע דקות.
בתום הדגירה, הסר את המאגר המכיל טיפול מהתאים והוסף חמישה מיליליטר חיץ טרי לכל תא. לאחר מכן התחל טיימר של 2.5 דקות לאחר השלמתו, חזור על שטיפה זו של 2.5 דקות. פעם שנייה בסוף השטיפה השנייה, שאפו את התאים.
לאחר מכן לאחר הוספת מאגר טרי פעם נוספת, התחל טיימר של דקה אחת כדי לספור לאחור לתחילת המהדורה הסטנדרטית השנייה. כפי שנצפה בתקופות הדגירה של תשע הדקות המוצגות כאן, ישנן עליות מצטברות בתגובה לתקנים שעם הגדלת הריכוזים של הטיפול, תוספת האשלגן כלורי בסיום הניסוי חיונית מכיוון שהיא מאשרת את כדאיות הרקמה. ניתן להשתמש בבדיקה ביולוגית זו כדי להעריך את פעילות כלי הדם של תרכובות הניסוי על כלי הדם המספקים חומרים מזינים למעי הדק, כמו גם על כלי הדם הנושאים את החומרים המזינים הנספגים.
לדוגמה, בניסוי זה, לא נצפה הבדל בתגובות ההתכווצות העורקיות או הוורידיות לאחר חמישה טיפולים בהידרוקסי טריפטמין. לעומת זאת, התגובה ההתכווצת של הווריד המזנטרי לריכוזים ההולכים וגדלים של נוראדרנלין הייתה גדולה מזו של העורק המזנטרי. בעקבות הליך זה, ניתן לשנות את השיטה עוד יותר כך שתכלול אגוניסטים או אנטגוניסטים במאגר שהיו בעלי עניין ספציפי לחוקר.
זה יאפשר לחוקר להבין טוב יותר את המעורבות של קולטנים ספציפיים מאוד ואת המנגנונים מאחורי תגובות כלי הדם שנצפו במהלך ניסוי המיאו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף, לעבד ולבודד כלי דם. לניסוי שלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד עורקים וורידים ממסרק הבקר (mesenteric) כדי להעריך את הפעילות הווסוקולרית של תרכובות שונות. באמצעות שימוש במולטי-מיוגרף (multimyograph), חוקרים יכולים להעריך כיצד תרכובות אלו משפיעות על זרימת הדם ועל ספיגת רכיבי תזונה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של כלי דם
- רעלנות
רקע
- המעי הדק חשוף לעיתים קרובות לרעלים שעלולים לשבש את זרימת הדם.
- הבנת הוואסואקטיביות חיונית להערכת ספיגת רכיבי תזונה.
- כלי דם מזנטריים ממלאים תפקיד מרכזי בפיזיולוגיה של מערכת העיכול.
- סריקה ניסויית יכולה לסייע בזיהוי תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
מטרת המחקר
- לבידוד עורקים וורידים ממסרק הבקר לצורכי מחקר.
- לסריקת תרכובות לבחינת תכונותיהן הוואסואקטיביות.
- להערכת השפעתן של תרכובות אלו על זרימת הדם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות של רקמת מסנטרים (mesenteric tissue) ממקורים בקרים.
- ניקוי וחיתוך של כלי הדם.
- קיבוע והשגת שיווי משקל של החתכים על מולטי-מיוגרף (multimyograph).
- חשיפת כלי דם מבודדים לתרכובות הנחקרות לצורך הערכה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של עורקים וורידים מזנטריים.
- זיהוי תרכובות בעלות השפעות ואזו-אקטיביות משמעותיות.
- הדגמת יעילות השיטה בהערכת שינויים בזרימת הדם.
- השלכות פוטנציאליות להבנת הדינמיקה של ספיגת חומרים מזינים.
מסקנות
- הבדיקה הביולוגית מעריכה ביעילות את הפעילות הווסוקולרית של תרכובות.
- שיטה זו יכולה לתרום למחקר על בריאות מערכת העיכול.
- מחקרים נוספים עשויים לבחון יישומים טיפוליים של התרכובות שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בדיקה ביולוגית זו (bioassay) במערכת in vitro מאפשרת הערכה בשלבים מוקדמים של השפעות תרכובות על טונוס כלי הדם בעורקים ובוורידים מזנטריים של בקר, ובכך תומכת בתיקוף המטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפרמקולוגיה של מערכת העיכול. על ידי בידוד כלי דם מבעל חיים בודד ובדיקה של מספר תרכובות בו-זמנית, השיטה מגבירה את רמת הביטחון בתוצאות החזויות ומפחיתה את ההסתמכות על מודלים in vivo במהלך זיהוי תרכובות מובילות (lead identification). גישה זו מספקת ערך תרגומי להערכת סיכונים וסו-אקטיביים או מועמדים טיפוליים המשפיעים על זרימת הדם במעיים ועל ספיגת חומרים מזינים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת פעילות כלי דם (vasoactivity) המושרית על ידי תרכובות בכלי דם מסוג התנגדות (resistance) וקיבול (capacitance) של מחזור הדם המזנטרי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות פרופיל של אגוניסטים/אנטגוניסטים להבהרת תגובות וסקולריות המתווכות על ידי רצפטורים.
- ערך אסטרטגי: תומך בביטחון חיזוי ובמיון פורטפוליו על ידי זיהוי מוקדם של סיכונים או הזדמנויות הקשורים לפעילות כלי דם בשלבי הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקות המשך, באמצעות בידוד והרכבה של חתכי כלי דם על מולטי-מיוגרף למדידת כושר התכווצות בזמן אמת.
- ערך תפעולי: אספקת פלטים כמותיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור (למשל, שינויים במתח), המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות תחת תנאי טיפול שונים.
- ערך אסטרטגי: שיפור המוכנות והיכולת להרחבה של תהליך הסריקה, המאפשר בדיקה של תרכובות מרובות עבור כל דגימת רקמה מבעל חיים, ובכך משפר את תפוקת הבדיקה ואת יעילות המשאבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מידול מערכתי רלוונטי למחלה באמצעות שימוש בכלי דם מהאספקה האפרנטית והאפרנטית של המעי הדק, כדי לשקף דינמיקה פיזיולוגית של זרימת דם.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי שמירה על חיוניות הרקמה ותנאים ניסויים עקביים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים, על ידי קישור החשיפה לתרכובת לתוצאות וסקולריות תפקודיות הרלוונטיות לבריאות מערכת העיכול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה הביולוגית (bioassay) משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לזיהוי מוביל (lead identification), ומספקת קריאה תפקודית המגשרת בין פעילות מולקולרית לבין תגובות כלי דם ברמת הרקמה בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומך בבחינת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מדידת תגובות וזו-אקטיביות לתרכובות רלוונטיות, מה שמאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות כלי דם.
- סריקה (Screening): מספק מוכנות של בדיקות ומדידות כיווץ כמותיות המאפשרות השוואה של השפעות תרכובות בין ריכוזים שונים וקבוצות טיפול.
- אנליטיקה (Analytics): מייצר נתוני מתח בזמן אמת מנורמלים לתגובה המקסימלית של potassium chloride, מה שמאפשר השוואה סטנדרטית של עוצמה ויעילות וזו-אקטיבית.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול של כלי דם המעורבים בספיגת חומרים מזינים ובפרפוזיה במעי, רלוונטי למודלים של הפרעות במערכת העיכול (GI).
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): משמש כפלטפורמת סריקה של כלי דם לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לתרכובות, מינים ומסעות של אפיון רצפטורים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתגובות כלי דם באמצעות הערכה תפקודית ישירה מבוססת רקמה.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות נהלי קיבוע, שיווי משקל ונורמליזציה מבוקרים במולטי-מיוגרף (multimyograph).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי זיהוי מוקדם של השפעות וזואקטיביות, המסייעות בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go).
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון על בסיס פוטנציאל טיפולי או סיכון לכלי דם באינדיקציות של מערכת העיכול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של כלי דם, טיפול ברקמות ותפעול מיאוגרף להכנה והרכבה עקבית של כלי הדם.
- תלוי בגישה למערכת מולטי-מיאוגרף (multimyograph), פרפוזיה של בופר בבקרת טמפרטורה ומיקרו-פוזיציונרים מדויקים לוויסות מתח.
- מחייב סטנדרטיזציה של הפרוטוקולים בין צוותים עבור חיתוך כלי הדם, זמני שיווי משקל והגשת תרכובות, כדי להבטיח הדירות בין המשתמשים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לסוגים שונים של כלי דם, מינים או מודלים של מחלות, במיוחד בנוגע לטון הבסיס ולביטוי קולטנים.
- מוגבל על ידי משך החיוניות של כלי הדם לאחר הבידוד, מה שמחייב ביצוע ניסויים בזמן תחת תנאי אחסון אופטימליים בבופר.
