שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin
22 באוקטובר 2014
לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. זה מושג על ידי השגת עיכול נקי ומלא של רקמת בלוטת יותרת הכליה של העכבר. השלב השני הוא ניתוק וצלחת תאים מבלוטת יותרת הכליה.
לאחר מכן מזוהים תאי כרומין ומהדקים טלאי כדי להשיג רישומי קיבול מחוברים לתאים. בסופו של דבר, ניתן להבחין בשלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הקלטות מחוברות לתאים של תעלות יונים בודדות, הוא שאנו מסוגלים לזהות אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס של שלפוחיות בודדות.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שקשה ללמוד להשיג חותם ג'יגה. כמו כן, זה יכול להיות קשה לזהות תאים בין סוגי תאים מעורבים שנמצאים בתוך הצלחת. כדי להתכונן לניתוח התחל בחיטוי זוג דיסקציה גדולה וקטנה, מספריים ושני זוגות מלקחיים.
לאחר מכן הניחו את מגש החיתוך על דלי קרח. התחל גם לבעבע את תמיסת האנזים עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% חמצן. התמיסה בצבע ורוד בוהק לפני הבעבוע. הבא.
לאחר המתת חסד ועריפת ראשו של עכבר בן שלושה ימים, השתמש בסט המספריים הקטן יותר כדי לחתוך את גב הגור העוקב אחר עמוד השדרה מאזור צוואר הרחם לאזור הלב. הקפידו לחתוך באופן שטחי מתחת לעור כדי למנוע פירסינג בחלל הגוף. לאחר מכן, קלף את העור מעמוד השדרה כך שהשרירים ייחשפו ותהיה תצוגה ברורה של עמוד השדרה.
כעת בצע חתך חתך בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן בצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה עם זוג מלקחיים אחד המחזיק את הגוף העיקרי של החיה. השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה לאחור עד שהכליות נחשפות. לאחר איתור בלוטות יותרת הכליה על גבי הכליות, השתמש במלקחיים כדי להסיר אותן.
לאחר מכן הניחו בזהירות את בלוטות יותרת הכליה לתוך צינור חרוטי מלא בתמיסת נעילה. השתמש בזוג מלקחיים שני כדי לעקור את בלוטות יותרת הכליה. אם הם נדבקים לזוג המלקחיים הראשון, הניחו את הצינור החרוטי על הקרח.
ניתן לשמור את הבלוטות בתמיסת נעילה עד שעתיים. בשלב זה, בדוק את תמיסת האנזים כדי לוודא שהתמיסה המאוזנת הפכה מצבע ורוד בוהק לצבע כתום ורדרד. לאחר מכן, הוסף פפה לתמיסת האנזים המבעבעת הטרייה בריכוז סופי של 20 עד 25 יחידות למיליליטר.
לאחר מכן הוסף את תמיסת אנזים הפרופאן לצינור חרוטי חדש והשתמש במלקחיים כדי להעביר את בלוטות יותרת הכליה לצינור האנזים פרופאן. דגרו על הבלוטות במשך 40 עד 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 75% מתמיסת האינאקטיבציה לכל צינור ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
לאחר 10 דקות, העבירו בעדינות את הבלוטות לצינור חדש שסומן ושטפו את הבלוטות שלוש פעמים במצע תרבית. לאחר הכביסה, הנח את הבלוטות לתוך 200 מיקרוליטר של אמצעי התרבית, ולאחר מכן טיטר בעדינות את הבלוטות למעלה ולמטה דרך קצה הפיפטה של פיפטה של 200 מיקרוליטר. בעת טיטרציה, שמור על הבלוטות בתחתית הצינור בכוח כלפי מטה מקצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר והפעל את הרקמה בעדינות ולאט הקפד להשתמש במשיכות איטיות ומתמשכות, לעולם אל תבצע פיפטינג מהיר או פתאומי לאחר טיטרציה, הוסף עוד 250 מיקרוליטר של אמצעי תרבית כדי להביא את הנפח הכולל של אמצעי התרבות עד 450 מיקרוליטר.
במקום הבא, שבע החלקות כיסוי מצופות מראש PDL בגודל 12 מילימטר בצלחת צלחת תרבית בגודל 60 על 50 מילימטר. לאחר מכן צלחו 60 מיקרוליטר מהתא המכיל תמיסה על כל אחת משבע החלקות הכיסוי. לאחר הציפוי, מניחים את המנה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, הוסיפו בעדינות חמישה מיליליטר של מצע תרבית חם מראש לצלחת התרבית, ולאחר מכן דגרו במשך 24 שעות לפני ביצוע הקלטות מחוברות לתא. לאחר מקום הדגירה, הכיסוי בגודל 12 מילימטר מחליק המכיל את תאי יותרת הכליה לתמיסה החוץ-תאית. מכיוון שנעשה שימוש בכל בלוטות יותרת הכליה, השלב הבא הוא להבדיל בין תאי הכרום לתאי קליפת המוח.
בתרבית, תאי הכרומין בדרך כלל בהירים מאוד עם צבע בז' חום וצורה מעגלית כמעט מושלמת. לעומת זאת, תאי קליפת המוח קטנים ועמומים יותר מתאי ה-CHRO. לאחר משיכת פיפטות התיקון כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טבלו את קצה הפיפטה בשעווה מומסת כדי להפחית את קיבול הזכוכית.
לאחר מכן יש ללטש את הקצה באש כדי לפוצץ את השעווה הזו מתוך קצה הפיפטה. לאחר מכן, בנה את הפיפטה עם תמיסת פיפטת התיקון כך שההתנגדות שלה תהיה כשני מגה אוהם. חבר את פיפטת התיקון למניפולטור שלה והביא אותה למרחק של כמה מיקרונים מהתא.
המשך לקדם את הפיפטה בחיפוש אחר עיוות קל בתאים. לאחר זיהוי העיוות, הפעל יניקה עדינה עד להשגת איטום ג'יגה-אום. מניב תצורה מחוברת לתא.
לאחר חשיפת חותם ג'יגה אום, בצע הקלטות מחוברות לתא באמצעות מגבר מהדק EPC שבע פלוס תיקון, ומגבר נעילה אנלוגי דו-פאזי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הגדר את השלב של מגבר הנעילה, כך ששינויים בקיבול חולף המיוצרים על ידי יניקה עדינה. פולסים מופיעים רק בקיבול התיקון, או עקבות Im ללא הקרנה לתוך התיקון, מוליכות או שחזור תהליך התיקון משמש כגירוי מכני. מכיוון שניתן לרשום זרם פעולה בדרך כלל מרוב התאים, זהה שינויי קיבול אופייניים על ידי הצעד המסומן כלפי מטה.
השלב האחרון הוא שמירת הנתונים לניתוח עתידי. מוצגת כאן הקלטת קיבול טיפוסית המחוברת לתא עם מספר שלבים כלפי מטה. כל שלב כלפי מטה קשור לאנדוציטוזיס iCal יחיד.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את תרבית התאים תוך שעתיים-שלוש, וניתן לבצע הקלטות תוך ארבעת הימים הבאים לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההעברה הסינפטית לחקור את מיחזור השלפוחית הסינפטית בתאי כרומין נוירואנדוקריניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מתמקד בזיהוי ציטוזיס של שלפוחית יחידה ואנדוציטוזיס בתאי כרומפין של בלוטת יותרת הכליה בעכבר. השיטה כוללת פאטץ' קלמפינג כדי להשיג הקלטות קיבוליות תלויות-תאים, המאפשרות תצפית על אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס של שלפוחיות יחידות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- אקסוציטוזיס הוא תהליך של היתוך שלפוחית עם הממברנה הפלזמטית.
- אנדוציטוזיס מחזירה את הממברנה המותכת ויוצרת מחדש שלפוחיות סינפטיות.
- הבנת תהליכים אלו חיונית להבנה של העברה עצבית.
- הקלטות קיבוליות מספקות שיטה לניתוח אירועים אלו ברמת שלפוחית יחידה.
מטרת המחקר
- לזהות ולנתח ציטוזיס של שלפוחית יחידה ואנדוציטוזיס.
- לשפר את השיטות הקיימות לחקר דינמיקה של שלפוחיות.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני העברה סינפטית.
שיטות ששימשו
- עיכול רקמת בלוטת היותרת של העכבר כדי להשיג תאים.
- ניתוק וריסוס של תאי כרומפין של בלוטת היותרת.
- זיהוי תאי כרומפין לפאטץ' קלמפינג.
- הקלטות קיבוליות תלויות-תאים לצפייה בדינמיקה של שלפוחיות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס של שלפוחית יחידה.
- הוכחת יתרונות של הקלטות קיבוליות על פני שיטות מסורתיות.
- מתן תובנות לגבי מנגנוני מחזור של שלפוחיות סינפטיות.
- תרומה להבנת תהליכי שחרור נוירוטרנסמיטורים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת לימוד מפורט של דינמיקה של שלפוחיות.
- הממצאים משפרים את ההבנה של העברה סינפטית.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תהליכים נוירוביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-resolution cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cells enable direct quantification of single-vesicle endocytosis, a critical process in synaptic vesicle recycling. This capability strengthens mechanistic de-risking and predictive confidence in early neurobiology target validation. The method supports translational continuity by providing quantitative, reproducible data on vesicle dynamics relevant to neurotransmission and neuroendocrine function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of vesicle recycling mechanisms at the single-event level.
- Supports functional target validation by quantifying endocytic kinetics in neuroendocrine cells.
- Reduces mechanistic ambiguity in synaptic transmission studies.
- Facilitates predictive confidence for neurobiology-focused portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated electrophysiological readouts for downstream assay development.
- Enables standardization of vesicle event detection for reproducible screening workflows.
- Delivers quantitative outputs suitable for compound evaluation in synaptic function assays.
- Supports scalability and platform reuse in neuroendocrine model systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neurotransmitter release and vesicle recycling.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of synaptic targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vesicle dynamics.
- Provides mechanistic de-risking for neuroendocrine and synaptic transmission programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development for neuroendocrine and synaptic transmission research.
- Discovery Biology: Quantifies endocytic events to clarify vesicle recycling pathways and test mechanistic hypotheses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative capacitance measurements for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides high-resolution readouts for comparing experimental conditions and kinetic parameters.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neurotransmitter release and synaptic function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for diverse neurobiology R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in synaptic biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable electrophysiological measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch clamp electrophysiology and cell identification.
- Needs specialized amplifiers and analytical infrastructure for capacitance recordings.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different neuroendocrine or neuronal cell types.
- Technical challenges include achieving giga-ohm seals and distinguishing cell subtypes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Adrenal Gland Isolation
2:52
Tissue Digestion
3:50
Cell Dissociation and Plating
5:16
Cell Identification and Gigaohm Seal Formation
6:41
Cell-attached Capacitance Recordings
7:34
Results: Cell-attached Capacitance Recording Shows Endocytosis in Chromaffin Cells
7:52
Conclusion
