Name: שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתאי כרומאפין של עכבר. טכניקת patch clamp מאפשרת זיהוי אקסוציטוזה ואנדוציטוזה של וסיקולות בודדות בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי פרס הקרן הלאומית למדע (1145581) ל-LWG.

הערה: כל ההליך נערך בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות, כפי שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. 1 פתרונות ותכשירי מדיה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הפתרונות ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. שמור את התקשורת והתרבות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של תקשורת בתרבות 100 מ&quot;ל על ידי ערבוב 1 מ&quot;ל של תמיסת עט סטרפטוקוקוס ו1 מ&quot;ל של ITSX (אינסולין transferrin-סלניום-תוספים) לעם DMEM 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים על ידי ערבוב 250 מ&quot;ל של DMEM, 2.5 מ&quot;ל של 100 מ&quot;מ CaCl 2, ו2.5 מ&quot;ל של 50 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון איון על ידי ערבוב 225 מ&quot;ל של DMEM, 25 מ&quot;ל של FBS, 625 מ&quot;ג של אלבומין, ו625 מעכבי טריפסין מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון של לוק של 154 mM NaCl, 5.6 מ&quot;מ KCl, 5.0 HEPES מ&quot;מ, 3.6 מ&quot;מ NaHCO3, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הכן פתרון poly-D-ליזין (PDL) של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. השתמש בריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לcoverslips מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תאי של 140 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ-NaOH, ו10 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH עם osmolarity של 310 nmol / קילוגרם ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיפטה של 50 mM NaCl, 100 מ&quot;מ TEACl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו10 HEPES מ&quot;מ. כדי להתאים את pH 7.3 עם NaOH עם osmolarity של 290 nmol / קילוגרם ~. </li></ol> בידוד .2 הכליה בלוטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מספריים לנתיחה קטנים וגדולים ושני זוגות מלקחיים. ללבוש כפפות במהלך כל התהליך ולמקם את המגש לנתח בדלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים שצולמו ביום 0-3. להרדים חיות עם CO 2 טנק בלחץ ואחריו עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל את הקבוצה קטנה יותר של מספריים כדי לצמצם את החלק האחורי של הגור הבא עמוד השדרה מCervi<html> קאל לזנב אזור. הקפד לחתוך באופן שטחי מתחת לעור ולא לחדור לתוך חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, עור לקלף מן העמוד שדרה, כך שרירים שנחשפו ליש תצוגה ברורה של עמוד השדרה. מכאן, לעשות חתך transectional בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן לבצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים מחזיקים את הגוף העיקרי של בעלי החיים, להשתמש בזוג מלקחיים האחר כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה עד כליות חשופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע זה, לדמיין את בלוטת יותרת הכליה בחלק העליון של הכליות. לאחר מכן למקם בזהירות שתי בלוטות מכל חיה לתוך צינור חרוטי מלא פתרונו של לוק. הערה: לפעמים הבלוטות תדבק המלקחיים. אם זה המקרה, בעדינות להשתמש זוג נוסף של מלקחיים על מנת לסייע בהסרת הבלוטות מהמלקחיים ולפתרונו של לוק. יכולות להיות כל הזמן הבלוטות במצב הזה עד שעה 2. </li></ol>דואר &quot;&gt; 3. עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, בועת פתרון האנזים עם 5% CO 2 + 95% O 2 במשך 15 דקות לפני השימוש. ודא כי פתרון equilibrated הופך מצבע ורוד בהיר לצבע ורדרד / כתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את פפאין לפתרון האנזים הטרי מבעבע בריכוז סופי של 20-25 יחידה / מ&quot;ל. דגירה כל זוג בלוטות מכל חיה ל40-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס בפתרון האנזים עם פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75% מפתרון איון על צינור אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 10 דקות. דגירה זה מנטרלת את פעילות האנזים של פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 10 דקות עם פתרון איון, בעדינות להעביר את הבלוטות לתוך צינור שכותרתו חדשה ולאחר מכן לשטוף את הבלוטות 3x עם תקשורת והתרבות. </li></ol> .4 תא דיסוציאציה וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, הנח שתי בלוטות ל200 μl של התקשורת והתרבות ואז בעדינות לכייל את הבלוטות ולמטה דרך קצה פיפטה עם טפטפת 200 μl עד שהוא כבר לא חתיכה גדולה של רקמה בפתרון. הערה: כאשר titrating, לשמור על בלוטות בחלק התחתון של הצינור עם כוח כלפי מטה מקצה פיפטה 200 μl ולעסוק הרקמות בעדינות ובאיטיות. להיות בטוח לשימוש תנועות איטיות, מתמשכים, אף פעם לא pipetting מהיר או פתאומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תקשורת ותרבות 250 μl נוספת להביא עד 450 μl הנפח הכולל של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 60 μl של פתרון המכיל תא זה על כל אחד משבעה coverslips 12 מ&quot;מ מצופה PDL מראש, אשר ממוקמים בצלחת תרבות 60 x 15 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצופים ברגע, מניח את הצלחת לתוך החממה שנקבעה ל37 מעלות צלזיוס ומתוחזק עם זרימה / אספקה ​​קבועה של 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי להבטיח סביבה לכדאיויות תא. לאחר דגירה, בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות מראש חימם לצלחת התרבות ולהחזיר את הצלחת בחזרה לתוך החממה ל24 שעות לפני תא נספחהקלטות ד. הערה: בדרך כלל, התאים יכולים לשמש לקלטות אלקטרו עד 4 ימים. </li></ol> .5 סלולארי גיבוש זיהוי וGigaohm חותם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip 12 מ&quot;מ לפתרון תאי. מאז בלוטת יותרת הכליה השלמה משמשות להכנת תא, לערבב את תאי chromaffin (בדרך כלל בהירים מאוד עם חום / צביעה בצבע בז&#39; וצורה מעגלית מושלמת ליד (איור 1) בתרבות עם תאים בקליפת המוח (קטנים ועמומים יותר chromaffin תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את טפטפות התיקון בארבעה שלבים באמצעות חולץ P-97 לתכנות. טובלים את קצה פיפטה לתוך שעווה מותכת, שיעזור להפחית את הקיבול של הזכוכית ולאחר מכן לירות פולני טיפ ל&quot; לפוצץ משם &quot;שעווה זה מחלק הפנימי של קצה פיפטה. הערה: כאשר מלא פתרון פיפטה התיקון, יש לי טפטפות תיקון בדרך כלל התנגדות של ~ 2 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב לפיפטה התיקון הקרובה לתא בתוך כמה מ &#39;icrons. כדי להשיג תצורה המצורפת תא, לחפש כל עיוות תא קלה במהלך הגישה של פיפטה התיקון הקרוב יותר לתא. החל שאיבה עדינה עד חותם GΩ מושגת. </li></ol> .6 הקלטות קיבוליות-מצורף סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחותם GΩ מתגלה, לבצע הקלטות מצורפים תא באמצעות מגבר EPC-7 בתוספת תיקון מהדק ומגבר נעילה ב אנלוגי שני שלבים (ראה טבלה המצורפת של ציוד). החל sinewave עם משרעת של 50 mV (RMS) ותדירות של 20 kHz ממגבר הנעילה ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מסנן המוצא של מגבר הנעילה ב 1 בקבוע זמן אלפיות שני ו24 db. הגדר את השלב של מגבר הנעילה ב כך ששינויי קיבול זמניים המיוצרים על ידי פולסים שאיבה עדינים מופיעים רק בזכר קיבול תיקון (Im) ללא הקרנה לזכר מוליכות תיקון (Re) (איור 2). הערה: אנא ראה את הפרטים לכיול של המערכת מחדשפרנץ 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות טיפוסי קיבול שינויים בצעדים &quot;כלפי מטה&quot; (איור 3). הערה: הקלטה מוצקה תיחשב כסוג דמיון &quot;מדרגות&quot; עם הרבה צעדים כלפי מטה, דבר המצביע על הפנמת שלפוחית ​​אחת. תהליך התיקון משמש כגירוי מכאני מאז נוכחי פעולה יכולה להיות מוקלטת בדרך כלל מרוב התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם קבצים כתיקיות בודדות כולל תאריך: MM / DD / שנה וכל הקלטה המצורפת סלולארי כשל המספור בודד (xx) בתוך קובץ ש. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מדידות קיבול מצורף תא דורשות כמה שלבים קריטיים על מנת להשיג הצלחת הקלטות באיכות גבוהה: 1) תאי קיימא ובריאים שהוכנו מבלוטת יותרת הכליה; 2) ציפוי PDL של coverslips; 3) היווצרות חותמת gigaohm; רמת רעש של המערכת 4); ו5) תיקון שלב. לניתוח של בעלי חיים, שינויים אחד יכול באופן פוטנציאלי לעשות הוא להתאים את הגישה הניתוחית למיומנות החליפה הטובה ביותר וכדי למנוע נזק במהלך נתיחה. בנוסף, תרגול מספיק באיתור והסרה של בלוטת יות...

שידור סינפטי מתווך על ידי exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית המכיל מוליך עצבי, ושלפוחית ​​אלה חייבת לעבור מחזור endocytic מקומי במסוף העצב לשמור על תקשורת עצבית בטווח הארוך. בהתחשב בתפקיד החיוני של שידור סינפטי במוח, הבנת המנגנון המולקולרי המהווה את מעגל השלפוחית ​​הסינפטית הוא בסיס חיוני להבנה טובה יותר בתקשורת הסלולרית בכללותו. בין מערכות מודל תא, תא chromaffin יותרת הכליה סיפק כמה תובנות העקרוניות ביותר למכונות מולקולריות שבבסיס מחזור שלפוחית ​​הסינפטית. Exocytosis, השלב האחרון בשחרור הנוירוטרנסמיטר, נחקר מאוד ובחן באמצעות השימוש בתאי chromaffin יותרת הכליה 1,2. למעשה, רוב השחקנים המולקולריים שלתזמר את ההיווצרות, מיקוד, עגינה, ושילוב של גרגרי הפרשה זוהו בשל יישום של divטכניקות erse בתאי chromaffin 1. יתר על כן, על ידי מתן הזדמנות לאפשר לרזולוציה יחידה שלפוחית ​​של מכונות החלבון מעורבות בexocytosis, תא chromaffin נשאר מודל רב עוצמה כדי לענות על השאלות של שלפוחית ​​היתוך 3. מדידות קיבול מצורף תא נוצלו ראשונה בפתרון היתוך יחיד שלפוחית ​​במהלך exocytosis 3. Exocytosis של שלפוחית ​​קטנה כמו ~ 60 ננומטר בקוטר הוכח להיות מזוהה על ידי מדידות להתקבל קרום תא עם טכניקת מהדק תיקון בתצורת התא מצורף 4-7. אדמיטנס מוגדר כמדד של כמה בקלות מעגל או התקן יאפשר לזרם לזרום; זה הוא ההופכי של עכבה. לפיכך, מדידות להתקבל לספק הבנה של קיבול הקרום. המטרה זו מושגת על ידי השילוב של קרום לפוחי לתוך קרום הפלזמה; התאגדות זו חושפת שינויים במשטחאזור 8. כל שלפוחית ​​פיוזינג גורמת לעלייה הדרגתית ב9,10 קיבול קרום. בנוסף, מדידה להתקבל זה מספקת את מוליכות הממברנה ומוליכות נקבוביות ההיתוך במהלך אירוע exocytotic 3. כטכניקה זו סיפקה כלי ייחודי בזיהוי קינטיקה יחידה שלפוחית ​​במהלך exocytosis, המעבדה שלנו לאחרונה מיושמת תפיסה זו כדי לזהות אנדוציטוזה של שלפוחית ​​אחת 11,12. העניין הספציפי שלנו הוא אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME), שכבר נחשב כמרכיב ניהול משק בית בסיסי בתאים רבים 13 וכדרך הראשית לאנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית במסופים עצביים 14,15. CME ידוע להיות חשוב מבחינה ביולוגית, לעומת זאת, קינטיקה שלה תישאר לא מובנת היטב בשל מגבלות טכניות בניטור אירועי endocytic ייחודיים. בהתחשב בקווי הדמיון במנגנוני exocytic בין תאים ונוירונים 1 chromaffin, זה plausible שמנגנוני הביקוע בתאי chromaffin עשויים עשויים לחול על אנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית בתאי עצב. מדידות הקיבול מצורף התא כבר נוצלו כדי לעקוב אחר אירועי endocytic בודדים ולנתח את קינטיקה הביקוע, שרוב השיטות לא מצליחות לפתור. בהקלטות מצורפים התא שלנו, גל סינוס ב20 kHz משולב לתוך פוטנציאל ההחזקה, והתפוקה הנוכחית מופרד למוליכות קרום בקיבול ערוץ וקרום אחד בערוץ האחר משני שלבי נעילה ב מגבר 16- 18. מהשינויים במוליכות הממברנה וקיבול, ניתן לחשב את קינטיקה של הביקוע נקבובי, שסביר להניח מתאים לצוואר קרום הצינור שמחבר את שלפוחית ​​ההפנמה לקרום הפלזמה לפני שלפוחית ​​קמצוץ-off. באופן קולקטיבי, טכניקה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון את מנגנוני הוויסות של ביקוע שלפוחית ​​במהלך CME.

<table><tbody><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>להרחיק מ-UV</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Carolina Biological 633029</td><td></td><td>12 מ"מ</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>רק להפשיר על ICE!</td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 פלוס מגבר תיקון</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 לוח רכישת נתונים</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor תוכנת רכישת נתונים</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 חולץ פיפטות</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ 
קוטר פנימי: 1.10 מ"מ 
אורך: 10 ס"מ</td></tr></tbody></table>

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה chromaffin

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

הולכה עצבית היא חלק בלתי נפרד מהתקשורת התאית בתוך המוח. דה-פולריזציה של הממברנה הפרה-סינפטית מובילה לאיחוי שלפוחית המכונה אקסוציטוזיס המתווך העברה סינפטית. שליפה לאחר מכן של שלפוחיות סינפטיות נחוצה כדי ליצור שלפוחיות חדשות מלאות במוליכים עצביים בתהליך המזוהה כאנדוציטוזיס. במהלך אקסוציטוזיס, איחוי ממברנות שלפוחית יביא לעלייה בשטח הפנים ואנדוציטוזיס לאחר מכן מביא לירידה בשטח הפנים. כאן, המעבדה שלנו מדגימה מבוא בסיסי להקלטות קיבוליות המחוברות לתאים של אירועים אנדוציטיים בודדים בתא הכרומפין של יותרת הכליה של העכבר. סוג זה של הקלטה חשמלית שימושי להקלטות ברזולוציה גבוהה של אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס ברמת השלפוחית הבודדת. בעוד שטכניקה זו יכולה לזהות גם אקסוציטוזיס שלפוחית וגם אנדוציטוזיס, המוקד של המעבדה שלנו הוא אנדוציטוזיס שלפוחית. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לנו לנתח את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. כאן מתוארות השיטות לדיסקציה של רקמת בלוטת יותרת הכליה של עכבר, תרבית תאי כרומפין, טכניקות בסיסיות המחוברות לתאים ודוגמאות עוקבות של עקבות בודדים המודדים אירוע אנדוציטי יחיד.

כדאיות התא והאיכות של חותם gigaohm הן קריטיות בקביעת האיכות של הקלטות קיבול מצורף תא. לכן, זה קריטי כדי להשיג תרבית תאים אפקטיבית ויעילה לפני קלטות אלקטרו, ותאי קיימא טיפוסיים באיור 1. העיסוק והזמן יהיה מועילים בהשגת חותם gigaohm עם איכות גבוהה. אם אחד יכול לראות בבירור עיוות תא כאשר פיפטה התיקון מתקרבת התא כפי שמתוארת בשלב פרוטוקול 5.3, יש סיכוי טוב יותר בקבלת חותם איכות גבוהה. איור 3 מדגים הקלטה טיפוסית של קיבול קרום עם מטה מרובים הקשורים לשלבים...

לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. זה מושג על ידי השגת עיכול נקי ומלא של רקמת בלוטת יותרת הכליה של העכבר. השלב השני הוא ניתוק וצלחת תאים מבלוטת יותרת הכליה.לאחר מכן מזוהים תאי כרומין ומהדקים טלאי כדי להשיג רישומי קיבול מחוברים לתאים. בסופו של דבר, ניתן להבחין בשלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הקלטות מחוברות לתאים של תעלות יונים בודדות, הוא שאנו מסוגלים לזהות אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס של שלפוחיות בודדות.הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שקשה ללמוד להשיג חותם ג'יגה. כמו כן, זה יכול להיות קשה לזהות תאים בין סוגי תאים מעורבים שנמצאים בתוך הצלחת. כדי להתכונן לניתוח התחל בחיטוי זוג דיסקציה גדולה וקטנה, מספריים ושני זוגות מלקחיים.לאחר מכן הניחו את מגש החיתוך על דלי קרח. התחל גם לבעבע את תמיסת האנזים עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% חמצן. התמיסה בצבע ורוד בוהק לפני הבעבוע. הבא.לאחר המתת חסד ועריפת ראשו של עכבר בן שלושה ימים, השתמש בסט המספריים הקטן יותר כדי לחתוך את גב הגור העוקב אחר עמוד השדרה מאזור צוואר הרחם לאזור הלב. הקפידו לחתוך באופן שטחי מתחת לעור כדי למנוע פירסינג בחלל הגוף. לאחר מכן, קלף את העור מעמוד השדרה כך שהשרירים ייחשפו ותהיה תצוגה ברורה של עמוד השדרה.כעת בצע חתך חתך בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן בצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה עם זוג מלקחיים אחד המחזיק את הגוף העיקרי של החיה. השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה לאחור עד שהכליות נחשפות. לאחר איתור בלוטות יותרת הכליה על גבי הכליות, השתמש במלקחיים כדי להסיר אותן.לאחר מכן הניחו בזהירות את בלוטות יותרת הכליה לתוך צינור חרוטי מלא בתמיסת נעילה. השתמש בזוג מלקחיים שני כדי לעקור את בלוטות יותרת הכליה. אם הם נדבקים לזוג המלקחיים הראשון, הניחו את הצינור החרוטי על הקרח.ניתן לשמור את הבלוטות בתמיסת נעילה עד שעתיים. בשלב זה, בדוק את תמיסת האנזים כדי לוודא שהתמיסה המאוזנת הפכה מצבע ורוד בוהק לצבע כתום ורדרד. לאחר מכן, הוסף פפה לתמיסת האנזים המבעבעת הטרייה בריכוז סופי של 20 עד 25 יחידות למיליליטר.לאחר מכן הוסף את תמיסת אנזים הפרופאן לצינור חרוטי חדש והשתמש במלקחיים כדי להעביר את בלוטות יותרת הכליה לצינור האנזים פרופאן. דגרו על הבלוטות במשך 40 עד 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 75% מתמיסת האינאקטיבציה לכל צינור ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.לאחר 10 דקות, העבירו בעדינות את הבלוטות לצינור חדש שסומן ושטפו את הבלוטות שלוש פעמים במצע תרבית. לאחר הכביסה, הנח את הבלוטות לתוך 200 מיקרוליטר של אמצעי התרבית, ולאחר מכן טיטר בעדינות את הבלוטות למעלה ולמטה דרך קצה הפיפטה של פיפטה של 200 מיקרוליטר. בעת טיטרציה, שמור על הבלוטות בתחתית הצינור בכוח כלפי מטה מקצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר והפעל את הרקמה בעדינות ולאט הקפד להשתמש במשיכות איטיות ומתמשכות, לעולם אל תבצע פיפטינג מהיר או פתאומי לאחר טיטרציה, הוסף עוד 250 מיקרוליטר של אמצעי תרבית כדי להביא את הנפח הכולל של אמצעי התרבות עד 450 מיקרוליטר.במקום הבא, שבע החלקות כיסוי מצופות מראש PDL בגודל 12 מילימטר בצלחת צלחת תרבית בגודל 60 על 50 מילימטר. לאחר מכן צלחו 60 מיקרוליטר מהתא המכיל תמיסה על כל אחת משבע החלקות הכיסוי. לאחר הציפוי, מניחים את המנה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר הדגירה, הוסיפו בעדינות חמישה מיליליטר של מצע תרבית חם מראש לצלחת התרבית, ולאחר מכן דגרו במשך 24 שעות לפני ביצוע הקלטות מחוברות לתא. לאחר מקום הדגירה, הכיסוי בגודל 12 מילימטר מחליק המכיל את תאי יותרת הכליה לתמיסה החוץ-תאית. מכיוון שנעשה שימוש בכל בלוטות יותרת הכליה, השלב הבא הוא להבדיל בין תאי הכרום לתאי קליפת המוח.בתרבית, תאי הכרומין בדרך כלל בהירים מאוד עם צבע בז' חום וצורה מעגלית כמעט מושלמת. לעומת זאת, תאי קליפת המוח קטנים ועמומים יותר מתאי ה-CHRO. לאחר משיכת פיפטות התיקון כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טבלו את קצה הפיפטה בשעווה מומסת כדי להפחית את קיבול הזכוכית.לאחר מכן יש ללטש את הקצה באש כדי לפוצץ את השעווה הזו מתוך קצה הפיפטה. לאחר מכן, בנה את הפיפטה עם תמיסת פיפטת התיקון כך שההתנגדות שלה תהיה כשני מגה אוהם. חבר את פיפטת התיקון למניפולטור שלה והביא אותה למרחק של כמה מיקרונים מהתא.המשך לקדם את הפיפטה בחיפוש אחר עיוות קל בתאים. לאחר זיהוי העיוות, הפעל יניקה עדינה עד להשגת איטום ג'יגה-אום. מניב תצורה מחוברת לתא.לאחר חשיפת חותם ג'יגה אום, בצע הקלטות מחוברות לתא באמצעות מגבר מהדק EPC שבע פלוס תיקון, ומגבר נעילה אנלוגי דו-פאזי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הגדר את השלב של מגבר הנעילה, כך ששינויים בקיבול חולף המיוצרים על ידי יניקה עדינה. פולסים מופיעים רק בקיבול התיקון, או עקבות Im ללא הקרנה לתוך התיקון, מוליכות או שחזור תהליך התיקון משמש כגירוי מכני. מכיוון שניתן לרשום זרם פעולה בדרך כלל מרוב התאים, זהה שינויי קיבול אופייניים על ידי הצעד המסומן כלפי מטה.השלב האחרון הוא שמירת הנתונים לניתוח עתידי. מוצגת כאן הקלטת קיבול טיפוסית המחוברת לתא עם מספר שלבים כלפי מטה. כל שלב כלפי מטה קשור לאנדוציטוזיס iCal יחיד.לאחר השליטה, ניתן להשלים את תרבית התאים תוך שעתיים-שלוש, וניתן לבצע הקלטות תוך ארבעת הימים הבאים לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההעברה הסינפטית לחקור את מיחזור השלפוחית הסינפטית בתאי כרומין נוירואנדוקריניים.

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

לשד הכליה תרבות chromaffin מערכות סלולריים הם מאוד שימושי לחקר צימוד עירור הפרשת ב-בקביעת חוץ גופית. פרוטוקול זה ממחיש את שיטת לנתח את יותרת הכליה ואז לבודד את האזור מדולרי ידי הפשטת משם קליפת יותרת הכליה. מערכת העיכול של לשד לתוך אחד התאים chromaffin מודגם אז.

עכבר בידוד הכליה Chromaffin Cell

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

כאן אנו מציגים שיטה כדי לבודד את בלוטת יותרת הכליה של עכברים, לתקן את הרקמות, סעיף אותם ולבצע immunofluorescence מכתים.

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

ההורמון מופרש על ידי קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות החולדה הראשית תאי בלוטת יותרת הכליה. זה יכול להיות פלטפורמה במבחנה טוב עבור חוקרים את המנגנונים מהתרכובת עניין steroidogenesis בלוטת יותרת הכליה, ביוסינטזה השומנים.

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

פותחה גישה איתנה וניתנת לשחזור להקמת תרביות ראשוניות דו-ממדיות של תאי גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה מועשרים לקורטקס האדרנל של העכבר. מערכת זו שומרת על תכונות מולקולריות ותפקודיות מרכזיות של כל אזור, ומאפשרת חקירה ממוקדת של מסלולי איתות, ייצור הורמונים והתנהגות תאי אדרנל קורטיקס מחוץ לחיים.

הקמת תרבויות ראשוניות מועשרות אזורים מקורטקס אדרנל העכברים

למד שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתאי כרומאפין של עכבר. טכניקת patch clamp מאפשרת זיהוי אקסוציטוזה ואנדוציטוזה של וסיקולות בודדות בזמן אמת.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

גלה סרטונים נוספים