Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין תת-קבוצות של תאים מיאלואידים של עכבר במוח האיסכמי בשתי מתודולוגיות שונות. ראשית, מודל קבוע של איסכמיה מוחית מוצג על ידי חסימה, הן עורק הצוואר המשותף או CCA והן תא המטען הדיסטלי של עורק המוח האמצעי או MCA היוצר אוטם המשפיע בעיקר על קליפת המוח. לאחר מכן עבור הכימות הסטריאולוגי של תת-קבוצות התאים המיאלואידים, קטעי העטרה הסדרתיים של המוח הם כתם חיסוני עבור התאים המעניינים, ואז התאים שחדרו מכומתים על ידי גישת המפרק האופטי.

לחלופין, ניתן לבודד את התאים המיאלואידים מרקמת מוח טרייה על ידי דיסוציאציה מכנית, ולאחר מכן לצבוע ולנתח אותם על ידי ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן להשיג כימות מדויק ואפיון איכותי מפורט של תת-קבוצות התאים המיאלואידיים הספציפיים החודרים למוח העכבר לאחר איסכמיה מוחית על ידי כימות סטריאו וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית בהתאמה. היתרון העיקרי של מודל סדרתי איסכמיה זה על פני אחרים הקיימים הוא שלטכניקה שלנו יש שיעורי תמותה נמוכים משמעותית משיטות אחרות, מה שממזער את מספר בעלי החיים הנדרשים למחקר.

תחום זה הוא שיטה שיכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השבץ, כגון מהם התפקידים של מיקרו-הפעלה מחדש, אקסטרווזציה של מקרופאגים המטוגנים או נויטרופילים בפגיעה מוחית? הם כימות תיאולוגי מדויק על גישות הציטומטריה הרב-פרמטריות המודגמות במאמר זה יכול לספק תובנה לגבי המספר, הפנוטיפ והתפקוד של אוכלוסיית התאים המיאלואידים בתגובה החיסונית המולדת לאיסכמיה CE. כדי לקשור את ה-CCA תחילה, בצע חתך קו אמצע של סנטימטר אחד סביב פני הגחון של צוואר החיה תחת מיקרוסקופ כירורגי.

לאחר הניתוח, השתמש בתפר ניילון שש אפס כדי לחסום את ה-CCA השמאלי עם קשר קבוע כדי לקשור את ה-MCA הדיסטלי. לאחר מכן, בצע חתך אופקי בשריר הטמפורלי מימין לשמאל. לאחר מכן בצע חתך אנכי שני בצד ימין של השריר הטמפורלי.

יש להקפיד להימנע מחיתוך הווריד הטמפורלי. משוך את השריר הטמפורלי מהגולגולת והחזק אותו עם תפר כדי לשמור על משטח גולגולת נקי. לאחר מכן נקו את הגולגולת עם מי מלח סטריליים קרים כדי לזהות את המיקום המדויק של ה-MCA השמאלי באמצעות שקיפות הגולגולת.

לאחר זיהוי ה-MCA, השתמש בקוצים מנירוסטה כדי לבצע קרניוטומיה עגולה של מילימטר אחד באונה הקדמית בין הקשת הזיגומטית לעצם הקשקש. הסר בזהירות את הגולגולת החושפת את ה-MCA. לאחר מכן השתמש בתפר ניילון תשע אפס כדי לחסום את ה-MCA השמאלי בתא המטען הדיסטלי ממש לפני ההסתעפות בין ענפי ה-MCA הקדמיים והאחוריים עם קשר קבוע.

כדי להסיר את המוח, ערפו את ראשו של העכבר שהומת ממש מעל חוט השדרה ובצעו חתך קדמי אחורי בעור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן בצע שני חתכים רוחביים בצומת הקירות הצדדיים ובסיס הגולגולת והסר את חתיכת העצם הקטנה. לאחר מכן, בצע חתך דרך הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי והשתמש במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת המכסה כל המיספרה כדי לחשוף את המוח.

השתמש במרית כדי להפריד את המוח מהגולגולת ולהעביר אותו לתמיסה של 4% PFA. לאחר שלוש שעות, הסר את ה-PFA ודגר את המוח בתמיסת סוכרוז של 30% כדי להגן על המוח בהקפאה. לאחר 48 שעות, הסר את תמיסת הסוכרוז והקפיא את המוח במהירות בפנטן איזופ שלילי של 40 מעלות צלזיוס ואז השתמש במיקרוטום מקפיא כדי ליצור קטעי מוח קורונליים של 30 מיקרומטר.

איסוף 10 סטים סדרתיים בתמיסה משמרת קריו. כל סט סדרתי מורכב מכ-14 עד 16 פרוסות עטרה עם מרחק בין פרוסות של 300 מיקרומטר. כדי להבטיח דגימה נאותה של מוח העכבר בין 1.94 ל-2.46 שלילי ל-bgma כדי להעריך את המספר הכולל של נויטרופילים שהסתננו.

לאחר חסימת MCA על ידי מפרק אופטי, תחילה חיסון את הנויטרופילים עם נוגדן החולדה נגד LY 6 G והנוגדן המשני המתאים על קטעים צפים בטכניקה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית. לאחר מכן הרכיבו את חלקי המוח על שקופיות מיקרוסקופ סופר כפור כשהאזור האוטם ממוקם בצד ימין ופתחו את תוכנת חוקר הסטריאו. לאחר מכן, לחץ על תפריט מנהל החלקים הסדרתי של הכלים והוסף קטע חדש עם כפתור הקטע החדש.

הגדר את מרווח ההערכה ל-10 עבור שבר דגימה אחד של פרוסה עשירית. ואז מתפריט קווי המתאר למטה, בחר בכלי מתאר האזור האוטם. צייר קו מתאר כדי לתאר את האזור האוטם תחת המטרה 10 x.

לאחר מכן עבור למטרה של פי 100 במיקרוסקופ ומתחת לתפריט המטרה. כדי לכמת את הנויטרופילים בתפריט הבדיקות, בחר כעת את המקטע האופטי והגדר את מיקום ה-XY של מסגרות הספירה ל-230 עבור גדלי הרשת X ו-Y. כעת בחר את כפתור הנויטרופילים מסרגל הסמן וסמן את הנויטרופילים המוכתמים באזור האוטם.

ייצא את תוצאות הכימות לקובץ גיליון אלקטרוני כדי להפריד את המוח לתרחיף תא בודד. לאחר הסרת המוח כפי שהודגם זה עתה, נתח את הליבה ואזורי האוטם של קליפת המוח המקבילה ממוחו של עכבר איסכמי במוח. שקלו את רקמת המוח והניחו אותה בחמישה מיליליטר של RPMI קר כקרח לכל קריאה לנורמליזציה בין קבוצות הניסוי, ולאחר מכן השתמשו במטחנת רקמות עם עלי טפלון כדי לפרק את הרקמה לתרחיף תא בודד.

העבירו את מתלי התאים לצינור אולטרה-צנטריפוגה של 50 מיליליטר והוסיפו עוד חמישה מיליליטר של RPMI לכל תמיסת קריאה לדגימות. לאחר צנטריפוגה מתלי התא למשך 30 דקות ב -7, 800 GS ו -25 מעלות צלזיוס. ודאו ששכבה בצבע לבן המתאימה למיאלין מופיעה בחלק העליון של התמיסה.

הסר בזהירות את שכבת המיאלין וסנן את כל תרחיף התאים, כולל התאים הגלוליים דרך מסננת רשת ניילון בגודל 40 מיקרומטר. שטפו את המסננת עם 10 מיליליטר RPMI כדי להבטיח שכל התאים מסוננים דרך הרשת, ולאחר מכן העבירו את התמיסה לצינור של 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של RPMI לתאים ולאחר מכן לאחר סיבוב התאים השעו מחדש את כדור הלויקוציטים.

במיליליטר אחד של PBS דגרו על התאים למשך שתיים עד שלוש דקות בארבעה מיליליטר של מאגר ליזה בטמפרטורת החדר כדי לסובב את האריתרוציטים ואז לסובב את התאים. סמן את התאים ב-200 מיקרוליטר של PBS המכילים 1% BSA ואת הנוגדנים המתאימים על קרח. לאחר מכן, לאחר 45 דקות, שטפו את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS קר ו-Resus השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר זרימת פקס לניתוח זרימה ציטומטרי.

מודל זה מאופיין בנפחי אוטם הניתנים לשחזור 24 שעות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי כפי שהוערך בשיטת קבליירי. בקטעים מוכתמים בניאל בהסכמה עם מחקרים קודמים, חדירת נויטרופילים נמצאת בקורלציה ישירה עם גודל האוטם. בנוסף, בידוד לויקוציטים ואפיון ציטומטרי זרימה מאפשרים בידוד של תאים מיאלואידים מקליפת המוח של חצי הכדור הנגעי IPS של עכברים איסכמיים, המהווים 10 עד 30% מכלל האירועים המצויים בתרחיף התא ומציגים פרמטר פיזור קדימה נמוך הקשור לפסולת תאית.

לתאים החיוביים ל-CD 11 B יש ערך פיזור קדימה גבוה יותר, מה שמצביע על כך שפסולת התא אינה מסומנת בסמן זה וכפי שצוין קודם לכן, ניתן להוציא אותה מניתוח נוסף על ידי קביעת סף FSC על 200 נויטרופילים המאופיינים כ-LY שישה תאים חיוביים G הם אוכלוסיית התאים המסתננת הגדולה ביותר שנמצאה 24 שעות לאחר חסימת MCA במוח העכבר האיסכמי באמצעות מודל זה של איסכמיה מוחית ו מהווים 70 עד 80% מהתאים הגבוהים CD 11 B חיוביים CD 45. שאר התאים הם בעיקר תת-אוכלוסייה של CD 11 B, CD 45 חיובי, LY גבוה 6 G, שלילי שישה C מונוציטים פרו-דלקתיים גבוהים, הנמצאים במספרים גבוהים באזורי המוח האיסכמיים בין 24 ל-48 שעות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי. ניתן לבצע מודל P-M-C-A-O זה תוך 30 דקות אם הוא מבוצע כראוי בעקבות הליך ציטומטריית הזרימה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיון של תת-קבוצה ספציפית של תאים כדי לענות על שאלות נוספות כמו מהם דפוסי הביטוי, שינויים מטבוליים או פעילויות אצטיות של תאים מיאלואידים במערכת מודל זו. לאחר צפייה בסרטון זה רק כדי להבין היטב כיצד ליצור מודל איסכמיה והכי חשוב, כיצד לאפיין את המספר והפנוטיפ של התאים המיאלואידים החודרים על ידי שתי גישות שונות בפגיעה מוחית של עכבר או במודל איסכמיה של עכבר.