דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או IPSC, מחולי ניוון שרירים, החל מתרביות תאים שמקורן בשתן ושיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה. זה מושג על ידי איסוף דגימות שתן תחילה מחולי ניוון שרירים. כשלב שני, תאי השתן מבודדים ומורחבים לתרביות תאים שמקורן בשתן.

לאחר מכן, התאים שמקורם בשתן עוברים טרנספורמציה עם נגיף סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה ומושבות פלוריפוטנטיות אופייניות מופיעות לאחר 12 יום. בסופו של דבר על ידי מעבר 13, ניתן לאשר את המצב החופשי מהטרנסגנים של תאי הגזע הפלוריפוטנטיים על ידי ניתוח R-T-P-C-R. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תכנות מחדש של פיברובלסטים מבודדים בעור באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן להשיג את התאים הסומטיים באופן לא פולשני ממטופלים ולהשתמש בהם ליצירת ה-IPCs ביעילות באמצעות שיטת אפס טביעת רגל של תכנות מחדש ויראלי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ניוון שרירים, כגון כיצד ניתן לעצב את התנאים הללו במבחנה ללא חששות בטיחותיים ליישום אנושי. מדגימים את ההליכים מוחמד זישאן אל, פוסט-דוקטורנט קורטני גסטינג, טכנאית, ומלאני ריידר, שלושתם מהמעבדה שלי כדי לאסוף דגימת שתן התחל בהמלצה למטופל לשתות נוזלים 30 דקות לפני האיסוף כדי להבטיח שניתן לאסוף כ-30 עד 40 מיליליטר שתן. כאשר המטופל מוכן, תן למטופל ערכת איסוף שתן המכילה את הפריטים הבאים, הוראות כתובות כיצד להשיג אסלות אנטיבקטריאליות סטריליות או נקיות ונקיות, וכוס איסוף דגימות סטריליות של 100 מיליליטר.

לאחר איסוף הדגימה, הניחו מיד את האיסוף על קרח והעבירו את הדגימה למעבדה בצידנית. לאחר מכן השתמש בפיפטות סטריליות כדי להעביר את דגימת השתן לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר, וסובב את הצינורות ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ב-BSL שני ארון בטיחות ביולוגי שואבים את כולם מלבד האחרון, מיליליטר של הסופרנטנט, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה.

לאחר מכן שטפו את התאים בשבעה מיליליטר של מאגר כביסה וסובבו את התאים שוב כלפי מטה. הפעם שואף את כל הסופרנטנט מלבד האחרון, כ-0.2 עד 0.5 מיליליטר. כעת השתמש שוב בגלולה בשניים עד שלושה מיליליטר של תא אב שתן או מדיום UPC והעביר את התרחיף לארבע עד שש בארות של צלחת 24 בארות לא מצופה לאחר 72 שעות, השלם את התרבית עם 0.5 מיליליטר של מדיום UPC טרי לבאר.

עקוב אחר התרבית בין ארבעה לשישה ימי דגירה. מושבות קטנות של שתיים עד ארבע תאים של תאים מעוגלים או מוארכים המייצגים תאי אפיתל כליה מסוג אחד או סוג שני בהתאמה אמורות להתחיל להופיע. המשך להחליף את המדיום כל יומיים-שלושה.

מכיוון שהמושבות יעברו שלב התרחבות מהיר בסביבות תשעה עד 15 ימים של תרבית, התאים צריכים להיות מתכנסים ב-80 עד 90% בשלב זה, לפצל את התאים לשתיים עד ארבע בארות של צלחת של 24 בארות להתרחבות נוספת. סימון תרבית זו כמעבר תאים ראשון, ניתן לאפיין את תאי השתן לסמנים ספציפיים לשושלת באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה, צביעה אימונוהיסטוכימית, או באמצעות תגובת שרשרת פולימראז טרנסקריפטאז הפוך כדי להבטיח תכנות מחדש ביעילות גבוהה לימים שלפני זרע ההעברה, 60,000 תאים לבאר. ממעבר תרבית אחת עד חמש לשתי בארות של צלחת שש בארות ביום האפס.

הכן את וקטור התכנות מחדש של סנדאי על ידי הוספת כל אחד מארבעת גורמי ה-OSKM ב-MLI מתאים לתכנות מחדש למיליליטר אחד של מדיית UPC חמה מראש, שאב את מדיית המתח והוסף לאט את תרחיף הנגיף לבאר אחת של תאי השתן במשך ששת הימים הבאים. החלף את הסופרנטנט מדי יום במדיום UPC טרי ביום החמישי צלחת זרעי מיטומיצין שטופלו MES על כלי תרבית מצופים ג'לטין בגודל 100 מילימטר מרובע ביום השישי. נתק את תאי השתן עם טריפסין, השהה אותם מחדש במדיום UPC וצלח אותם בחמש פעמים 10 מהרביעית עד פעמיים 10 מהתאים החמישיים לכל צלחת הזנה של מת'.

למחרת, החלף את מדיום ה- UPC בשלב עוברי אנושי או מדיום HES ועקוב אחר התאים במיקרוסקופ כדי לצפות בתאים שעברו טרנספורמציה סביב 12 עד 18 יום. לאחר התמרת, התאים צריכים ליצור אגרגטים משובטים עם מורפולוגיה מרוצפת אופיינית ויחס גרעין לציטופלזמי גבוה יותר. כדי לזהות את שיבוטי ה-IPSC שתוכנתו מחדש, בצע צביעת תאים חיים עבור נוגדן TRA 180 1.

לאחר מכן השתמש במחט בגודל 26 בגודל חצי אינץ' כדי להצליב את אגרגטים משובטים חיוביים TRA 180 1 לארבע עד שש חתיכות קטנות שוות בגודל לכל שיבוט. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לבחור ולהעביר 10 עד 20 חתיכות צולבות ממספר שיבוטים לכל באר צלחת מצופה מטריג'ל 24 באר עם HESC. בינוני, 24 עד 48 שעות לאחר ציפוי השיבוטים המתוכנתים מחדש על משטח המטריג'ל.

החלף את המדיום במדיום IPSC. השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד ידנית כל תא ממויין או תאי הזנה מזהמים של מת' כדי לסייע בטיהור שיבוטי ה-IPSC הדיסטרופיים המתוכנתים מחדש והפלוריפוטנטיים. לאחר שהשיבוטים הגיעו לגודל של כ-100 מיקרומטר, נתקו את התאים עם EDTA למשך שלוש דקות, ולאחר מכן צלחו אגרגטים של תאים קטנים של ה-IPSC הדיסטרופי המתוכנת מחדש, תלויים במדיום IPSC בתוספת מעכב RO קינאז על צלחת 12 רדיד מצופה מטריג'ל טרי.

לבסוף, אשר את הפלוריפוטנטיות של כל שיבוט הן על ידי ניתוח ביטוי גנים והן על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית. עבור סמנים פלוריפוטנטיים, רוב התאים המבודדים משתן אנושי חיוביים לסמני אב ותאי גזע כגון CD 44, CD 73 ו-CD 1 46. התאים מציגים גם סמנים מזנכימליים כמו אלפא, שריר חלק, אקטין ומנטון.

R-T-P-C-R של התאים המבודדים מספק עדות לאוכלוסייה מעורבת של תאים בתרביות. בכך יש ביטוי חלש של ציטוקרטין 7 ו-UIN 1 A ו-3 A סמנים של תאי אפיתל אירופיים. תאי השתן הופכים מתאים מוארכים מסוג 2 ביום האפס לתבנית מרוצפת ביום הרביעי של תכנות מחדש.

עד היום ה-12, נצפים שיבוטים פלוריפוטנטיים טיפוסיים ומסוגלים לשמור על המורפולוגיה הפלוריפוטנטית שלהם בתנאים ללא מזין. ניתן להשתמש בצביעת תאים חיים עבור TRA 180 1 כדי לזהות את השיבוטים שתוכנתו מחדש. כדי לאשר את היצירה של שיבוטים פלוריפוטנטיים חופשיים וקטוריים וטרנסגנים, ניתן לבצע R-T-P-C-R באמצעות פריימרים כנגד גנום נגיף סנדאי וכל אחד מגורמי ה-OSKM האקסוגניים.

ביטוי הגנים האקסוגני אינו מזוהה עוד במעבר 13, אך ניתן להבחין בוויסות יתר של גורמים אנדוגניים. צביעה אימונו-פלואורסצנטית מאשרת את הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים על ה-IPCs אך לא על תאי השתן. לאחר מכן ניתן לאמת את הביטוי של חלבון הדיסטרופין והגן על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית נוספת, כתמים מערביים ו-R-T-P-C-R בהתאמה, כפי שהודגם בתמונות מייצגות אלה מבקרת סוג פרא וקווי תאים דיסטרופיים.

לאחר המאסטר, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להשיג תכנות מחדש חופשי של ucs. תוך מספר שבועות לאחר הליך זה, אנו יכולים להבדיל את ה-IPCs לקרדיומיוציטים או מיוציטים שלד על מנת לקדם את המנגנונים שמאחורי ניוון שרירים.