Name: דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד לייצר תאי גזע pluripotent מושרים מחולי ניוון שרירים באמצעות תאים נגזרים משתן ושיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה. שיטה זו מאפשרת איסוף לא פולשני ואישור מצב נקי מטרנסגנים בנתיחה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי קידום ויסקונסין בריאה יותר והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, המכונים הלאומיים לבריאות, באמצעות מענק מספר 8UL1TR000055. תוכנו הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.

הערה: חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם צריכים לתת הסכמה מדעת להשתתפות במועצה לביקורת מוסדית אישרו מחקר. 1. חוצצים והכנות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ כביסה: כדי להכין של חיץ כביסה 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של עט 100x / פתרון סטרפטוקוקוס (100 U / ml פניצילין + 100 / מיליליטר מיקרוגרם של סטרפטומיצין) 99 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט חיץ (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא אב שתן בינוני (UPC): כדי להכין מדיום UPC, לערבב כמויות שווה של תא בינוני keratinocyte סרום חינם (KSF) בינוני + אב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KSF בינוני: כדי להכין מדיום keratinocyte, להוסיף 5 / מיליליטר ng של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 50 / מיליליטר ng של תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE), 30 / מיליליטר ng של רעלן הכולרה, ופתרון העט / סטרפטוקוקוס (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) ל 500 מיליליטר בינוני KSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא אב בינוני: להוסיף שלושה רבעים של DMEM עם רבע מתקשורת Ham-F12 ולהשלים עם 10% FBS, 0.4 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 0.1רעלן הכולרה ננומטר, 5 ng / ml אינסולין, 1.8 x 10 -4 אדנין M, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 2 x 10 thyronine M triiodo, 10 ng / ml EGF, והעט / סטרפטוקוקוס פתרון -9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הס בינוני: הוסף 20% החלפת KO-סרום (K-SR), חומצות אמינו לא חיוניות 1x ממ, l-גלוטמין 2 מ&quot;מ, β-mercaptoethanol 100 מיקרומטר, 20 ng / ml bFGF ועט / סטרפטוקוקוס 400 מיליליטר DMEM / בינוני F12. </li></ol> אוסף דוגמאות 2. שתן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות לחולים לשתות נוזלים 30 דקות לפני איסוף שתן על מנת להבטיח כי כמות מספקת (~ 30-40 מיליליטר) של שתן יכולה להיות שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם ערכת איסוף שתן המכילה את הפריטים הבאים: (1) הוראות בכתב על איך להשיג דגימת שתן לתפוס סטרילי או נקייה, (2) toilettes אנטי בקטריאלי הלח, ו- (3) 100 מיליליטר סטרילי כוס אוסף דגימה. להורות חולים כדי לאסוף דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את דגימות שתן על קרח ולהעביר לlaboraטורים בצידנית. לעבד את השתן לבידוד תא באופן מיידי. אם עיכוב הוא בלתי נמנע, לאחסן את הדגימה על קרח במשך שעה עד 4 עם הפסד מינימאלי של כדאיות תא. </li></ol> 3. בידוד והרחבת תאים שתן הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפטפות סטרילי, דגימות שתן להעברת סטרילי צינורות צנטריפוגה 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה בg × 400 במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant עוזב 1 מיליליטר בצינור; להיזהר לא להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ולשלב את כדורים מצינורות מרובים לתוך 7 מיליליטר של חיץ כביסה וחזור צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, עוזב את התא גלולה ו~ 0.2-0.5 מיליליטר של supernatant. Resuspend ב 2-3 מיליליטר של תא אב שתן בינוני (UPC) ולהעביר את ההשעיה ל4-6 בארות של האו&quot;םצלחת 24 מצופה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 72 שעות, להשלים את התרבות עם 0.5 מיליליטר של מדיום UPC טרי בכל טוב ולשנות בינוני כל 2-3 ימים לאחר. אריתרוציטים ותאי קשקש שלא לצרף הצלחת יוסרו עם השינויים בינוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התרבות לאחר 4-6 ימים. הערה: מושבות תאים קטנות 2-4 יתחילו להופיע. תאים יעוגלו או מאורכים המייצגים סוג I או II סוג של האפיתל כליות (RE) תאי בהתאמה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל 2-3 ימים מאז פעם התאים מופיעים, הם יעברו שלב התרחבות מהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים מגיעים 80-90 מפגש%, סביב 9-15 ימים לאחר ציפוי, לנתק והמעבר התאים (15,000-18,000 תאים / 2 סנטימטר) על 2-4 בארות של 24 צלחת גם להתרחבות נוספת. מסמן זאת כתא מעבר 1 (P1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין תאי שתן למפרטי שושלת באמצעות ניתוח התזרים cytometric, immunohistochemצביעת iCal או באמצעות תגובת שרשרת transcriptase-פולימראז הפוכה (RT-PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת מחדש תאי שתן מבודדים (סעיף 4) או להקפיא אותם בהקפאה בינונית (DMEM בתוספת סרום 10% ו -10% DMSO) לcryostorage לטווח ארוך. </li></ol> תכנות מחדש Cell 4. תנו שימוש וירוס סנדאי הערה: הטיפול הנכון והשימוש בPPE (ציוד מגן אישי) מומלצת בעוד מניפולציה סוכני transfecting. בצע את השלבים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט הבא. הסילוק נאות של transfecting תאי סוכן ו / או transfected מומלץ להימנע מסיכון של סכנות בריאותיות וסביבתיות. לתכנות מחדש של תאי שתן, להשתמש סנדאי תכנות מחדש קיט עם שינויים לפרוטוקול המזין תלוי של היצרן כפי שיפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח תכנות מחדש יעילות גבוהה באמצעות וירוס סנדאי, שימוש קטעים 1-5 תאי שתן שמהיריםly החלוקה. אם התאים לא לשכפל היטב או להיות senescent, להשליך אותם כפי שהם לא לתכנת מחדש את יעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 60,000 תאים לכל גם בשתי בארות של צלחת 6 היטב. מארק זה כמו יום -2. התאם צפיפות זריעת תאים (5 x 4-9 אוקטובר x 10 4 תאים לכל טוב) לפי צורך כדי להגיע 80-90% על ידי מפגש יום 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0 (48 שעות לאחר ציפוי התאים), להכין את וקטורי סנדאי תכנות מחדש (sev) המכילים כל אחד מגורמי OSKM ארבעה. להוסיף כל אחד מהווקטורים עד 1 מיליליטר של מדיום UPC מחומם מראש. השתמש במשרד פנים של 1-1.5 (5-7.5 x 10 5 CIU), אשר הוא מספק לתאי שתן תכנות מחדש. לשאוב הבינוני ומוסיף באיטיות 1 מיליליטר UPC + sev לטוב אחד תאי השתן. השתמש גם השני כשליטת התמרה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, להחליף את מדיום UPC + sev עם מדיום UPC טרי. מוות של תאים מסוימים נתפס לאחר 24 שעות בשל cytotoxicity ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם ליעילות של תכנות מחדש clonתצורות דואר והמורפולוגיה הקומפקטית, לשמור על שינוי הבינוני מדי יום עד שהיום 6 או 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני הניתוק של תאי transduced (יום 5 או 6), להכין צלחות מזין MEF ידי ציפוי mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 3 שעות) שטופל MEFs בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר, על 0.1 ג&#39;לטין% מצופה 100 מנות מ&quot;מ 2 תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום 6 או 7), לנתק את התאים עם טריפסין 0.25%, resuspend התאים במדיום UPC וצלחת 5 x 10 4 - צלחת מזין 2 x 10 5 תאים / 100 מ&quot;מ 2 MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לעבור למדיום הס ולשנות את המדיום בכל יום. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ כדי לפקח על תאים הפכו. הערה: התאים ליצור אגרגטים משובטים עם מורפולוגיה אופיינית מרוצפת ויש להם גרעין גבוה יחס cytoplasmic (לאחר התמרה 12-18 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך שבועות עד שלושה שבועות לאחר התמרה, לאסוף מושבות ולהעביר לצלחות חדשות לclonהרחבת אל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים תא חי לבחירת השיבוטים iPSC ידי דוגרים תאים עם TRA-1-81 נוגדן עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור ואחריו מכתים דלפק עם נוגדנים משני מצומדות צבע ניאון ספציפי עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט אינץ &#39;G ½ 1 26 לצלב-לבקוע TRA-1-81 שיבוטים גדולים יותר החיוביים iPSC לחתיכות בגודל שווה קטנות (4-6 חתיכות לשיבוט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה טיפ סטרילי כדי לאסוף ולהעביר 10-20 חתיכות צלב בקע משיבוטים מרובים לבאר כל Matrigel (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) -coated 24 צלחת היטב עם מדיום הס. הערה: פיסות משיבוט אחד מצופה בנפרד לתוך באר אחד לא להרחיב או לשמור על pluripotency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות מהס עד בינוני iPSC 24-48 שעות לאחר השיבוטים לתכנות מחדש מחוברים אל פני השטח Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תחזוקה על צלחות Matrigel מצופה, ידני scraPE-את כל תאים מובחנים או תאים מזינים MEF לזהם בעזרת פיפטה טיפ להעשיר לשיבוטי dystrophic לתכנות מחדש וpluripotent מלא iPSC (MD-iPSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיבוטים בודדים שהגיעו לגודל מיקרומטר ~ 100, להרחיב את השיבוטים על ידי מתנער עם 0.48 mM EDTA (חומצת ethylenediaminetetraacetic) פתרון במשך 3 דקות וציפוי אגרגטים תא קטנים של MD-iPSCs התלוי במדיום iPSC (בתוספת 5 מיקרומטר Y27632, Rho קינאז מעכב ) על matrigel הטרי (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) מצופה 12 צלחת גם. שנה בינונית iPSC יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנות מחדש מלא של כל שיבוט יכול להיקבע על ידי שני ניתוח ביטוי גנים של גני OSKM ומכתים immunohistochemical של סמני pluripotency (Oct3 / 4 וTRA-1-81). הערכה קפדני של פוטנציאל pluripotency צריך להיות מועסק כדי לאשר קווי iPSC לתכנות מחדש באופן מלא יכולים להתמיין לשלוש שכבות נבט. זה יכול להיות מושלם גם על ידי גוף embryoid assay (EB) היווצרות והבידול או terassay היווצרות Atoma. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

דוגמנות מחלות לב וכלי דם באמצעות iPSCs הופכת גישה נפוצה להבין את התרומה הגנטית 4-6. כמה קשיים בלתי צפויים של קבלת דגימות תאים מחולים, ילדים צעירים במיוחד, יכולים להימנע על ידי המציע את האפשרות של גישה לא פולשנית כגון איסוף שתן. באוכלוסיית חולים הצעירה הזה, הוא לעתים קרובות קשה לאסוף נפח השתן מספיק כדי להניב מספיק תאי שתן לתכנות מחדש. אימון החולים הצעירים לשתות נוזלים 30 דקות לפני האיסוף שתן משפר את ההצלחה של בידוד תא שתן. עם זאת, אוספי שתן חוזרים ייתכן שיהיו צורך באוכלו...

קרדיומיופתיה היא הסיבה המובילה השניה למוות בחולים עם מחלת ניוון שרירים דושן והבקר (MD). למרות שמוטציות בגן דיסטרופין צמוד X להתרחש ב 1: 3,500 לידות של זכרים, מעט מאוד ידוע על האירועים המולקולריים ותאיים שמוביל לנזק לשרירי לב מתקדם. תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה נגזרים מחולי ניוון שרירים צמחו ככלי רומן כדי לחקור את מנגנוני מחלה הבסיסיים ולהשתמש בסמים להקרנת 1,2. אי הנוחות הצפויה של ביופסיות עור או דגימות דם עלול להניא חולים צעירים ו / או האפוטרופוסים שלהם לתת את ההסכמה להשתתפות במחקר. דגימות שתן הן מקור בלתי פולשנית של תאים סומטיים שamendable לשיטות תכנות מחדש. הראינו לאחרונה כי תאי שתן שנאספו מחולי ניוון שרירים יכולים להיות מתורבתים וביעילות לתכנות מחדש לiPSCs באמצעות התמרה retroviral עם גורמי יאמאנאקה (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc; OSKM) 1. החסרון של מסירת גן retroviral הוא שילוב של גני תכנות מחדש לכרומוזומים המארח האקראי. כדי להתגבר על מגבלה זו, השתמשנו וירוס סנדאי הלא שילוב לתכנות מחדש של תאי שתן. פרוטוקול זה מפרט את תכנות מחדש של תאי וירוס סנדאי שתן מבודדים מחולי ניוון שרירים אז מה שיכול להיות מובחן לתוך שריר לב או סוגי תאים אחרים למחקר נוסף. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם למחלות ספציפיות מטופל אחרים.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים</חזקים></td></tr><tr><td>4 אונקיות כוס דגימה עם מכסה</td><td>STL אספקה רפואית</td><td>M9AMSAS340</td><td>לאיסוף דגימות שתן</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות BD-Falcon</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות BD-Falcon</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep עם גלוטמין&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>תוסף B-27 עם אינסולין (50x)</td> <td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>תוסף B-27 עם אינסולין (50x)</td> <td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Versene, 1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>bFGF (10 ומיקרו; ז)</td> <td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מחסניות Cell Counter Cartridges</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>סרום נוקאאוט (500&nbsp; בקבוק מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>תרבית תאי התאוששות הקפאה</td> טכנולוגיות <td>חיים בינוניים</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>תערובת התזונה F-12 של Ham&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>חלבון אנושי רקומביננטי EGF, Liquid Form</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>אינסולין, רקומביננט אנושי, אבץ Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>5940</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מעכב ROCK (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>מטריצה מוסמכת hESC, ערכת מיני RNeasy ללא LVED</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td> <td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>מוסמך</td><td>FBS סיגמא אולדריץ'</td><td>F6178</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Adenine Bioreagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>רעלן כולרה מ-Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>חם ב-37 מעלות ו-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H0888-1G</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>הולו-טרנספרין מאדם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T0665-50MG</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine מלח נתרן</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>T6397-100MG</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous הרכבה בינונית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>נוגדנים</חזקים></td></tr><tr><td>עכבר אנטי CD44 - מסומן ב-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti CD146 - מסומן ב-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti CD73 - מסומן ב-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&alpha;-Smooth Muscle actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי אוק 3/4</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד דיסטרופין</td><td>Leica</td><td>Biosystems NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

cardiomyopathy dystrophic הוא תוצאה הבינה היטב של ניוון שרירים. יצירת תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מחולים עם מחלת ניוון שרירים היא מקור רב ערך לסלולרי במבחנה מערכות מודל מחלה ויכולה לשמש למחקרי הקרנת סמים. תאי שמקורם בחולה שתן כבר בשימוש בתכנות מחדש מוצלח בתאי גזע pluripotent מושרה במטרה לבנות מודל cardiomyopathy dystrophic 1. בהתייחסו לחששות הבטיחות של שילוב מערכות וקטור, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות וקטור וירוס שאינו שילוב סנדאי לתמרה של יאמאנאקה גורמים לתאי שתן שנאספו מחולים עם מחלת ניוון שרירים. פרוטוקול זה יוצר לתכנות מחדש באופן מלא שיבוטים תוך 2-3 שבועות. תאי pluripotent הם נטול וקטור על ידי מעבר-13. יכול להיות מובחן iPSCs dystrophic אלה לתוך שריר לב ומשמש גם ללמוד מנגנוני מחלה או להקרנת סמים.

רוב התאים המבודדים משתן אנושי הם חיוביים לסמני אב וpericyte uroepithelial כגון CD44, CD73, וCD146 (97.37%, 97.09%, ו97.3% בהתאמה; איור 1 א ו -1 B). תאים אלה באו לידי ביטוי גם סמני mesenchymal אחרים כגון אקטין אלפא-שריר החלק וvimentin (איור 1). ניתוח RT-PCR נותן עדות לאוכלוסייה מעורבת של תאים בתרביות שביש ביטוי חלש של cytokeratin-7 (CK-7) וUroplakin (UP) -Ia &amp; -IIIa, סמנים של שושלת uroepithelial (איור 1 ג). </p...

פרוטוקול זה כולל נהלים מפורטים לבידוד תאים שמקורם בשתן מחולי ניוון שרירים; תכנות מחדש יעיל ומהיר שלהם באמצעות התמרת נגיף סנדאי.

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או IPSC, מחולי ניוון שרירים, החל מתרביות תאים שמקורן בשתן ושיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה. זה מושג על ידי איסוף דגימות שתן תחילה מחולי ניוון שרירים. כשלב שני, תאי השתן מבודדים ומורחבים לתרביות תאים שמקורן בשתן.לאחר מכן, התאים שמקורם בשתן עוברים טרנספורמציה עם נגיף סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה ומושבות פלוריפוטנטיות אופייניות מופיעות לאחר 12 יום. בסופו של דבר על ידי מעבר 13, ניתן לאשר את המצב החופשי מהטרנסגנים של תאי הגזע הפלוריפוטנטיים על ידי ניתוח R-T-P-C-R. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תכנות מחדש של פיברובלסטים מבודדים בעור באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים הוא שבעזרת טכניקה זו, ניתן להשיג את התאים הסומטיים באופן לא פולשני ממטופלים ולהשתמש בהם ליצירת ה-IPCs ביעילות באמצעות שיטת אפס טביעת רגל של תכנות מחדש ויראלי.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ניוון שרירים, כגון כיצד ניתן לעצב את התנאים הללו במבחנה ללא חששות בטיחותיים ליישום אנושי. מדגימים את ההליכים מוחמד זישאן אל, פוסט-דוקטורנט קורטני גסטינג, טכנאית, ומלאני ריידר, שלושתם מהמעבדה שלי כדי לאסוף דגימת שתן התחל בהמלצה למטופל לשתות נוזלים 30 דקות לפני האיסוף כדי להבטיח שניתן לאסוף כ-30 עד 40 מיליליטר שתן. כאשר המטופל מוכן, תן למטופ

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-muscular-dystrophy

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.

CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של שריר ניוון שרירים Duchenne באמצעות MYOD1-המרה בתאי השתן כדי להעריך את השיקום של mrna הדיסטרופין ואת רמות החלבון לאחר דילוג קפיצה.

Exon דילוג ישירות מיותצינורות שהתקבלו מתאי שתן אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד, הרחבה ותכנות מחדש של תאים אנושיים ולא אנושיים שמקורם בשתן של פרימטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כמו גם הוראות לתחזוקה ללא הזנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שנוצרו.

ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

למד לייצר תאי גזע pluripotent מושרים מחולי ניוון שרירים באמצעות תאים נגזרים משתן ושיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה. שיטה זו מאפשרת איסוף לא פולשני ואישור מצב נקי מטרנסגנים בנתיחה מולקולרית.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

גלה סרטונים נוספים