Name: אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: למד כיצד אימונותרפיה תת לשונית מגבירה את התגובה החיסונית המולדת בריאות ומספקת הגנה מפני דלקת ריאות pneumococcal קטלנית בעכברים. שיטה זו מציעה חלופה בטוחה יותר להנחתה תוך אףיתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ז'אן-קלוד סיראר מהמרכז לזיהומים וחסינות של ליל, מכון פסטר דה ליל-פראנס, על שסיפק באדיבות את הפלאגלין המטוהר ולד"ר תרזה קאמו, מנהלת מעבדת הייחוס הלאומית, משרד הבריאות של אורוגוואי על מתן הזן הפנאומוקוק. 
המחברים מבקשים להביע את תודתם למר דייגו אקוסטה ומר איגנסיו טורל מ-BichoFeo Producciones-Uruguay על מחויבותם ועבודתם הקשה במהלך כל הפקת הסרטון והמהדורה. 
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים PR_FCE_2009_1_2783 ו-BE_POS_2010_1_2544 מהסוכנות הלאומית למחקר וחדשנות, ANII מאורוגוואי, התוכנית לפיתוח מדעים בסיסיים, PEDECIBA של אורוגוואי והוועדה הסקטוריאלית למחקר מדעי, CSIC-Universidad de la República, אורוגוואי.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+vaccines+WHO+position+paper--2012%5BTitle%5D)+AND+%22Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012.</a> Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).</li>
<li>Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en</a> (2013).</li>
<li>Appelbaum, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+antibiotic-resistant+Streptococcus+pneumoniae+by+children+in+eastern+and+central+Europe-a+multicenter+study+with+use+of+standardized+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods.</a> Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).</li>
<li>Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+needs+of+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Changing needs of community-acquired pneumonia.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).</li>
<li>Cuburu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunization+induces+broad-based+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice.</a> Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).</li>
<li>Pedersen, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+sublingual+route+for+administration+of+influenza+H5N1+virosomes+in+combination+with+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP.</a> PLoS One. 25, 1-12 (2011).</li>
<li>Song, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+vaccination+with+influenza+virus+protects+mice+against+lethal+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).</li>
<li>Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylaxis+for+acute+exacerbations+of+chronic+bronchitis+using+an+antibacterial+sublingual+vaccine+obtained+through+mechanical+lysis%3A+a+clinical+and+pharmacoeconomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomed%22%5BJournal%5D)">Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study.</a> Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).</li>
<li>Rosaschino, F., Cattaneo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimizing+compliance+of+paediatric+patients+for+seasonal+antibacterial+vaccination+with+sublingually+administered+Polyvalent+Mechanical+Bacterial+Lysates+%28PMBL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomed%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL).</a> Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).</li>
<li>Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+of+sublingual+immunotherapy+in+clinical+trials+and+real+life%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life.</a> Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+dendritic+cells+mediate+antigen-specific+tolerance+by+stimulating+TH1+and+regulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+lingual+immune+system+reveals+the+presence+of+both+regulatory+and+effector+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells.</a> Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).</li>
<li>Mascarell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+macrophage-like+cells+play+a+key+role+in+tolerance+induction+following+sublingual+immunotherapy+of+asthmatic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice.</a> Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).</li>
<li>Hervouet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-bearing+dendritic+cells+from+the+sublingual+mucosa+recirculate+to+distant+systemic+lymphoid+organs+to+prime+mucosal+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells.</a> Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).</li>
<li>Munoz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+administration+of+flagellin+protects+mice+from+Streptococcus+pneumoniae+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection.</a> Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).</li>
<li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+bacterial+flagellin+is+mediated+by+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5.</a> Nature. 410, 1099-1103 (2001).</li>
<li>Lightfield, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+function+for+Naip5+in+inflammasome+activation+by+a+conserved+carboxy-terminal+domain+of+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin.</a> Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).</li>
<li>Lightfield, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirements+for+NAIP5+in+activation+of+the+NLRC4+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome.</a> Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).</li>
<li>Honko, A. N., Mizel, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+administration+of+flagellin+induces+innate+immunity+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung.</a> Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).</li>
<li>Janot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioresistant+cells+expressing+TLR5+control+the+respiratory+epithelium%27s+innate+immune+responses+to+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin.</a> Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).</li>
<li>Van Maele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+signaling+stimulates+the+innate+production+of+IL-17+and+IL-22+by+CD3%28neg%29CD127%2B+immune+cells+in+spleen+and+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa.</a> J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+adverse+events+following+influenza+A+%28H1N1%29+vaccinations+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+international%3A+official+journal+of+the+Japan+Pediatric+Society%22%5BJournal%5D)">Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children.</a> Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).</li>
<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+facial+nerve+paralysis+%28Bell%27s+palsy%29+following+intranasal+delivery+of+a+genetically+detoxified+mutant+of+Escherichia+coli+heat+labile+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin.</a> PLoS One. 4, e6999(2009).</li>
<li>Mutsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+inactivated+intranasal+influenza+vaccine+and+the+risk+of+Bell%27s+palsy+in+Switzerland%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland.</a> N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).</li>
<li>Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunotherapy+in+children%3A+an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neonatol%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunotherapy in children: an updated review.</a> Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).</li>
<li>Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+flagellin%27s+hypervariable+region+abrogates+antibody-mediated+neutralization+and+systemic+activation+of+TLR5-dependent+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity.</a> J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).</li>
<li>
 Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada
 . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php">http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php</a> (2011).</li>
<li>Marques, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+acute+infection+shows+a+signature+of+Th17-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity.</a> Immunobiology. 217, 420-429 (2012).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. 4, Unit 4.1(2001).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).</li>
<li>Pedersen, G., Cox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+vaccine+quandary%3A+intranasal+vs.+sublingual+immunization+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).</li>
<li>Vitaliti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+sublingual+immunotherapy+in+respiratory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Regulators+and+Homeostatic+Agents%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders.</a> Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ממשל sublingual של סוכנים טיפוליים הוכח כאמצעי שימושי כדי לווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה. היתרון העיקרי של SLIT לטיפול במחלות דרך נשימה הוא שזה לא כרוך במשלוח ישיר של תרכובות לתוך הריאות או הנחיריים, להיות בטוח יותר מאשר טיפולים הבוסס על ממשל האף 31 ב. טיפול חיסוני תת לשוני ניתן להשתמש בם כדי לווסת את התגובה החיסונית בדרכים שונות, או לזירוז של תגובות רגולציה שיכולה לשפר את הסימפטומים של דלקת ואסטמה 32 אלרגיות או כדי לגרום להפעלה זמנית של מנגנוני חיסון מולדים לטיפול בדלקות ריאות חריפות כפי שמוצג כאן. מודל העכבר שהוצג בסרטון הזה הוא שיטה נוחה להקרנה של תרכובות שונות כסוכנים טיפוליים לSLIT. מודל חיה זה מהווה כלי שימושי כדי לקבוע את ההשפעהשל SLIT בתגובה החיסונית של הריאות כמו גם באיברים אחרים (למשל., ניקוז בלוטות לימפה או באתרים ברירית דיסטלי) שלא ניתן חיקו על ידי השימוש במודלים במבחנה. למרות שיש כמה מאמרים המתארים את התוצאות שהושגו באמצעות טיפול חיסוני תת לשוני, שיטות מפורטות לנהלים של ממשל sublingual לא היו זמינות עדיין. בנוסף, המודל יכול לשמש להערכה של חיסוני sublingual במטרה להעניק הגנה מערכתית כמו גם מקומית בדרכי הנשימה. כפי שניתן לראות בווידאו המצורף, ממשל sublingual של תרכובות הוא הליך פשוט שניתן לבצע בקלות ללא הצורך בהכשרה מקיפה. בדרך כלל, אדם בקיא בטיפול בבעלי חיים ידרוש 1 שעות לביצוע חתך בקבוצה של 10 עכברים באמצעות הרדמה בזריקות כפי שתואר בפרוטוקול זה. אם אתגר דלקת ריאות מתבצע כמו גם, יידרשו 90 דקות נוספות כדי להכין אתההשעיה והחיידקים לבצע אתגר אף של בעלי החיים. פרוטוקולי FACS שהוצגו כאן מאפשרים אפיון נוח של השפעה של SLIT באתר המקומי של ממשל, ניקוז בלוטות לימפה, כמו גם ההשפעות שלהם על דינמיקת התא של הריאות. ניתוח נפרד של parenchyma התוכן וריאות רונכואלוואולרית חשוב להפלות תושב חיסוני של דרכי הנשימה והסתננות סוגי תאים מאלה שנותרו בתוך הרקמה. ניתוח של תוכן BAL מאפשר הלימוד של מחזור מקרופאג מכתשי, כמו גם דינמיקה של גיוס תאים לתוך חללי מכתשי הנגרמים על ידי טיפולים שונים, למשל., PMNs, אאוזינופילים, מונוציטים. גם BAL ניתן להשתמש כדי להעריך את הנוכחות של ציטוקינים וכמוקינים מופרשים על ידי Assay Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) או זיהוי של נוגדני IgA מופרשים שהושרו לאחר חיסון תת לשוני. מחקר של רקמת הריאותיאפשר אפיון של סוגי תאים אחרים, תאים דנדריטים קלאסיים, תאי T ותאי B. הכנת דוגמאות BAL ובלוטות לימפה לניתוח FACS היא פשוטה. לאחר איסוף דגימה, בדרך כלל 60 דקות נדרשות כדי להשלים את הפרוטוקול מכתים ל10-20 דגימות. בניגוד לכך, בידוד של תאים מריאות או רקמה תת לשונית ידרוש זמן רב יותר מאז נדרש עיכול של מטריקס. קליטתו של הסוכן הטיפולי מועבר על ידי תוואי sublingual ניתן לטפל על ידי מעקב של מולקולות fluorescently או שכותרתו רדיואקטיבית תוך שימוש במערכות ההדמיה vivo. טיפול חיסוני תת לשוני הוא שיטה אטרקטיבית כדי לגרום ליעילות מערכת חיסונית בדרכי הנשימה, כמו גם באופן מערכתי שיכול לשמש כדי לטפל או למנוע מחלות דרך נשימה. הבהרת מנגנוני קביעת הפעלה לעומת סובלנות של התגובה החיסונית בדרכי הנשימה אחרי שאני SLITזה חיוני כדי לאפשר תכנון רציונלים של אסטרטגיות טיפוליות חדשות שיכול לשמש לבד או בשילוב עם טיפולים זמינים כנגד תנאים שונים בדרכי הנשימה.

המטרה הכוללת של עבודה זו היא להמחיש את היתרונות של אימונותרפיה תת-לשונית לטיפול בזיהומים נשימתיים חריפים (ARI) ולהציג את היתרונות של נתיב אספקה זה בהשוואה לדרכי מתן אחרות, כלומר תוך אף.
ARI גורמים למיליוני מקרי מוות מדי שנה, במיוחד בקרב ילדים מתחת לגיל חמש. סטרפטוקוקוס פנאומוניה נותר כאחד הגורמים האטיולוגיים העיקריים לדלקת ריאות חיידקית בתינוקות וקשישים1,2. להיום, הטיפול העיקרי הזמין מסתמך על שימוש באנטיביוטיקה אך זנים עמידים מופיעים ללא הרף3,4.
SLIT גורם לתגובות רחבות ברמה המערכתית וגם הרירית, במיוחד בדרכי הנשימה5. יש לו יעילות מוכחת נגד זיהום בשפעת, ומקדם הגנה לטווח ארוך עם ייצור תגובות הומורליות ותאיות6,7. חוץ מזה, הוכח כי טיפול מונע בליזאטים חיידקיים המועבר בדרך תת לשונית הפחית את ההחמרה של ברונכיטיס חסימתית כרונית בקרב קשישים8 ומנע זיהומים חוזרים בדרכי הנשימה בילדים9. SLIT נמצא בשימוש נרחב לטיפול באלרגיות ואסטמה. מחקרים קליניים הוכיחו לא רק את יעילותו לווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה, אלא גם את בטיחותו10. למרות העניין הגובר של חברות תרופות וחוקרים ב-SLIT, המנגנונים המעורבים בהשראת תגובות חיסוניות ריריות לאחר אספקה תת-לשונית של תרכובות נותרו מעורפלים. לאחרונה, תשומת הלב התמקדה במנגנונים המקדמים סבילות הקשורה לדה-סנסיטיזציה של אלרגנים. הוצע כי תאים תושבים ומגויסים ברירית התת-לשונית, כמו תאים דנדריטיים ומקרופאגים, יכולים לקדם סבילות לאחר SLIT11-13. תאים דנדריטיים של רירית הפה יכולים לקדם תאי T מסייעים לייצור IFN-גמא ו-IL-1011 וכן למחזור מחדש לרירית איברי המין הדיסטלית ולקדם תאי CD8+ T14. עם זאת, מעט ידוע על ההשפעה של SLIT על תאים מולדים או על יכולתו לשפר את פינוי הפתוגן במהלך זיהומים חריפים בדרכי הנשימה.
השליטה הטבעית בזיהום פנאומוקוק בריאות תלויה במידה רבה בהפעלה יעילה ומהירה של הגנות מולדות מקומיות. הראינו בעבר כי שיפור החסינות המולדת של הריאות על ידי מנה תוך-אפית אחת של פלאגלין (FliC), אגוניסט TLR5 ו-NLRC4, מגן על 75-100% מהעכברים המאותגרים במינון קטלני של מבודד קליני של סטרפטוקוקוס פנאומוניה סרוטיפ 1. הגנה זו הוכחה כתלויה בגיוס מקומי של תאי GR1+ (ככל הנראה נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים, PMNs) ואינה תלויה בנוגדנים, תאי B או T15. 
פלאגלין הוא המרכיב המבני של הפלאגלום החיידקי. בצורתו המונומרית הוא מזוהה על ידי שני קולטנים לזיהוי פתוגנים (PRRs), TLR5 החש FliC16 חוץ-תאי ודלקת NLRC4/NAIP5 המזהה פלאגלין תוך-תאי17,18. כאשר FliC מורגש על ידי ה-PRRs מופעלת תגובה דלקתית חשובה. אנו ואחרים הראינו כי החדרת FliC מטוהר מסלמונלה enterica serovar Typhimurium לריאות מניעה ייצור מהיר של כימוקינים וציטוקינים במיוחד כאשר הם מזוהים על ידי אפיתל הריאות אשר בתורם מתזמרים את גיוס תאי החיסון לדרכי הנשימה, בעיקר PMNs15,19-21. למרות שהיא חולפת, חדירת הנויטרופילים המשמעותית המתרחשת לדרכי הנשימה לאחר מתן FliC מהאף יכולה להוות דאגה אם מתקדמים לטיפולים קליניים לשימוש אנושי. דלקת מוגזמת עלולה להזיק לתפקוד הריאות. יתר על כן, הוכח כי אספקה תוך-אפית של מולקולות חיסוניות עלולה לגרום לשיתוק פנים ו/או לרעילות מוחית22-24. 
אימונותרפיה תת-לשונית מציעה אלטרנטיבה בטוחה יותר לווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה בהשוואה לנתיב התוך-אף. הוא לא פולשני, ללא כאבים, פשוט ובעל היענות טובה למטופלים25. יתר על כן, כפי שהוזכר קודם, הוא יכול לגרום לתגובות הגנה ברירית הנשימה ללא הסיכונים הכרוכים באספקה ישירה של פורמולציות תוך אף או תוך ריאתיות. ניתן להשתמש בנתיב תת-לשוני לחלופין כדי להעביר מולקולות בעלות השפעות גדולות על מערכת החיסון של הריאות, אך הוכחו כרעילות או מעוררות דלקת גדולה כאשר הן ניתנות דרך האף. מלבד יתרונות אלה, לתכשירים לאימונותרפיה תת-לשונית יש עלות ייצור נמוכה יותר מכיוון שניתן לספק מוצרים לא סטריליים בדרך זו והלם אנדוטוקסי אינו מהווה דאגה עבור SLIT. מצד שני, כדאי לשים לב כי מינונים גבוהים יותר של התרכובות החיסוניות בהשוואה לאלו המשמשים בנתיבים תוך-אפיים או פרנטרליים נחוצים כדי לגרום לתגובה חיסונית בריאות; כמו כן, יש צורך בפתרונות מרוכזים מאוד בעת שימוש במודל העכבר של SLIT מכיוון שהאתר האנטומי שבו מופקדים התכשירים הוא קטן. 
בהתבסס על הנתונים הקודמים שפורסמו, פיתחנו מודל של הגנה באמצעות אימונותרפיה תת-לשונית עם פלאגלין כממריץ חיסוני מודל. הראינו כי מנה אחת של פלאגלין גרמה לשרידות של 60% כנגד דלקת ריאות פנאומוקוקית פולשנית הנגרמת על ידי זן סרוטיפ 1 בעוד שכל העכברים בקבוצת הביקורת מתו מזיהום תוך 5 ימים. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי מספרים גבוהים יותר של PMN מגויסים לדרכי הנשימה של בעלי חיים מוגנים לאחר טיפול תת לשוני בפלאגלין, מה שמרמז על כך שתאים אלה עשויים להיות מעורבים במנגנון ההגנה המושרה על ידי אימונותרפיה תת-לשונית. 
סרטון זה מראה בפירוט כיצד לבצע אימונותרפיה תת לשונית וגם כיצד לשחזר רקמות רלוונטיות מהרירית התת-לשונית, ניקוז בלוטות לימפה כמו גם ריאות ודרכי נשימה לביצוע ניתוח נוסף. בנוסף, הוא ממחיש את הטכניקה הכללית של הכנת תאים לניתוח FACS ומראה בקצרה כיצד להכין תרחיפי סטרפטוקוקוס פנאומוניה וכיצד לבצע זיהומים תוך-אף בעכבר כדי להגדיר את מודל הזיהום החריף.

<table><tbody><tr><td>תמיסת קטמין (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Pharma Service, תמיסת Xilacine של אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(2%)</td><td>Portinco S.A., אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי 1 מ"ל</td><td>מודרני, אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט סטרילית 27 גרם</td><td>מודרנית, אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PBS סטרילי ללא Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Type-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 מצומד חולדה אנטי עכבר IgG2b אנטי CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>שיבוט M1/70</td></tr><tr><td>APC מצומד אוגר אנטי עכבר IgG1 אנטי CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>שיבוט HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 מצומד חולדה אנטי עכבר IgG2a אנטי Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>תמיסת מלח סטרילית</td><td>מעבדה Farmaco אורוגוואי, אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפטי סויה אגר</td><td>BD Difco, צרפת</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>דפיברין דם כבשים</td><td>ביוקי, אורוגוואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטרילי פטרי צלחות</td><td>גריינר</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 10 פיפטה</td><td>גילסון</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 20 פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 200 פיפטה</td><td>גילסון</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 200 פיפטה</td><td>קאפ</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 200 פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>עמ' 1000 פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>קצות מסנן סטריליות עמ' 10</td><td>גריינר</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>טיפים מסננים סטריליים p200</td><td>גריינר</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסנן סטרילי p1000</td><td>גריינר</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>נירוסטה מלקחיים עדינים קצה&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td> מלקחיים <td>מעוקלים וישרים</td></tr><tr><td>לרקמת חבישה</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>אורך 8 אינץ'</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-חיתוך</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>ישר&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-מלקחיים</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>מעוקל</td></tr><tr><td>מספריים מאיו</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה סטרילית פונץ' ואוסלאש; מעבדות סטיפל 3 מ"מ</td><td>בע"מ</td>ניתן להשתמש גם <td>2079D</td><td>בקוטר 5 מ"מ</td></tr><tr><td>שפופרות סטריליות 1.5 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות סטריליות 15 מ"ל שפופרות</td><td>גריינר</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>סטריליות 50 מ"ל שפופרות</td><td>גריינר</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות 5 מ"ל</td><td>גריינר</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות 10 מ"ל</td><td>גריינר</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות 25 מ"ל</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי, סדרה</td><td>Class II Thermo Scientific</td><td>1300, סוג A2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מבודד&nbsp; ארון תקשורת</td><td>&nbsp; איזוסיסטם&nbsp;</td><td>76144W</td><td>סופר&nbsp; עכבר&nbsp; 1800 AllerZone&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור&nbsp;</td><td>דגם תרמו מדעי</td><td>&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר סטריליות בעלות קצה דק</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר סטריליות</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>צלחת סטרילית 24 בארות</td><td>גריינר</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן כחולה&nbsp;</td><td>מונה</td> תאים אוטומטי <td>Life Technologies T10282</td><td></td></tr><tr><td>- Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת תאים של רוזנת שקופיות</td><td>Life Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ציטומטריית זרימה</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר PCR בזמן אמת - גן הרוטור Q או ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Reagent Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>מולקולרי ביולוגיה בדרגת</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18068-015</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td></tr><tr><td>DNAse-I מאגר 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td></tr><tr><td>EDTA 25 מ"מ</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18068015</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10977</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td></tr><tr><td>RNAse החוצה</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>100000840</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>פריימרים אקראיים</td><td>טכנולוגיות חיים N8080127</td><td></td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>M-MLV-RT מאגר</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18057-018</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>M-MLV-RT אנזים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>28025-021</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td> פריימרים ספציפיים <td>לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> חיים <td>כיתה ביולוגיה מולקולרית</td></tr></tbody></table>

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

מסלול תת-לשוני נמצא בשימוש נרחב כדי להעביר מולקולות קטנות לזרם הדם ולווסת את התגובה החיסונית באתרים שונים. הוכח כי הוא מעורר ביעילות תגובות הומורליות ותאיות באתרים מערכתיים וריריים, כלומר הריאות ודרכי השתן. חיסון תת לשוני יכול לקדם הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה התחתונות והעליונות; זה יכול גם לקדם סבילות לאלרגנים ולשפר את תסמיני האסתמה. אפנון התגובה החיסונית של הריאות על ידי אימונותרפיה תת-לשונית (SLIT) בטוח יותר ממתן ישיר של פורמולציות בנתיב תוך-אף מכיוון שהוא אינו דורש אספקה של מולקולות שעלולות להזיק ישירות לדרכי הנשימה. בניגוד ללידה תוך-אף, תופעות לוואי הכרוכות ברעילות מוחית או שיתוק פנים אינן מקודמות על ידי SLIT. המנגנונים החיסוניים העומדים בבסיס SLIT נותרו חמקמקים והשימוש בו לטיפול בזיהומי ריאות חריפים טרם נחקר. לפיכך, יש צורך בפיתוח מודלים מתאימים של SLIT בבעלי חיים כדי לחקור עוד יותר את היתרונות הפוטנציאליים שלו. 
עבודה זו מראה כיצד לבצע מתן תת-לשוני של חומרים טיפוליים בעכברים כדי להעריך את יכולתם להגן מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית חריפה. מודגמים היבטים טכניים של טיפול בעכברים במהלך חיסון תת לשוני, זיהוי מדויק של רירית תת לשונית, ניקוז בלוטות לימפה ובידוד רקמות, שטיפת סימפונות וריאות. פרוטוקולים להכנת תרחיף תא בודד לניתוח FACS מתוארים בפירוט. נדונים יישומים אחרים במורד הזרם לניתוח התגובה החיסונית. מוסברים גם היבטים טכניים של הכנת חיסון סטרפטוקוקוס פנאומוניה ואתגר תוך-אף של עכברים.
SLIT היא טכניקה פשוטה המאפשרת סינון של מולקולות מועמדות לווסת את התגובה החיסונית של הריאות. פרמטרים המשפיעים על הצלחת SLIT קשורים לגודל מולקולרי, רגישות לפירוק ויציבות של פורמולציות מרוכזות מאוד.

טיפול חיסוני תת לשוני ניתן להשתמש בם בהצלחה לווסת את התגובה החיסונית של ריאות. הראינו כי מנה בודדת של flagellin, אגוניסט TLR5 וNLRC4, יכולה לגרום להגברת ביטוי משמעותית של mRNA קידוד CXCL1 כמוקינים, CCL20 וציטוקינים IL-6 בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופל מלוחה. מקפלים אינדוקציה של רמות mRNA הגיעה לשיא של 8 שעות לאחר SLIT ולחזור לרמות בסיס לאחר 20 שעה (איור 1). עם זאת, כאשר SLIT בוצעה זיהום אף לפני 2 שעות עם S. Pneumoniae, רמות של Cxcl1 וIl6 mRNA נשארו הוגברו באופן משמעותי אפילו 24 שעות לאחר SLIT בהשוואה לבעלי חיים שאינם מטופלים (איור 2). ניתוח של אוכלוסיות התאים בBAL ורקמת ריאה על ידי FACS גילה כי בעלי החיים שטופלו בפלי ידי תוואי sublingual עלו מספר הנויטרופילים בדרכי הנשימה, אך לא ברקמות של הריאות (איור 3). s = "jove_content"&gt; לבסוף, הישרדות לאחר אתגר דלקת ריאות הושוותה בבעלי חיים שטופלו בעבר עם פלי ידי תוואי תת לשוניים או עם מי מלח כביקורת. כפי שניתן לראות באיור 4, SLIT עם flagellin קידם הגנה והגדיל את ההישרדות נגד דלקת ריאות דלקת ריאות חריפות. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> איור 1 קינטיקה של פרופיל תעתיק של הריאות לאחר טיפול חיסוני תת לשוני עם flagellin. עכברי BALB / ג שמונה ל10 שבועות (n = 4) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי תוואי תת לשוני בהרדמה. ריאות נאספו בנקודות זמן שונות והניחו במשמר חומצות גרעין. מיצוי RNA סה"כ בוצע וcDNA היה מסונתז. רמות mRNA הוערכו על ידי בזמן אמת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים המפורטים בtabl.1 כימות יחסית דואר נעשה על פי שיטת ΔCt באמצעות רמות ACTB mRNA לנורמליזציה. תוצאות מוצגות כגידול של פי בהשוואה לקבוצה שטופל מלוחה כחציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P &lt;0.05) מחושבים על פי מבחן Mann-Whitney. תוצאות הן נציג של 2 ניסויים בלתי תלויים. <img alt="איור 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> פרופיל תעתיק 'ריאות איור 2 במהלך דלקת ריאות דלקת ריאות לאחר טיפול חיסוני תת לשוני עם flagellin. עכברי BALB / ג ישנים שמונה ל10 שבועות (n = 4 לקבוצת ביקורת וn = 7 לקבוצה שטופלה) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי מסלול sublingual תחת הרדמה. 2 שעות מאוחר יותר עכברים היו תיגר על ידי מסלול אף עם המינון המינימלי הקטלני (MLD) גורם 10תמותת 0% מבודד קליני של ס ' סרוטיפ pneumoniae E1585 1, המקביל ל 4x10 5 CFU / 50 μl. ריאות נאספו 24 שעות אחרי אתגר ומאוחסנות במשמר חומצות גרעין עד מיצוי RNA וסינתזת cDNA בוצעו. זמן אמת PCR בוצע (ראה רשימת פריימר בטבלה 1) וכימות יחסי נעשה על פי שיטת ΔCt באמצעות רמות ACTB mRNA לנורמליזציה. תוצאות מוצגות כגידול של פי בהשוואה לקבוצה שטופל מלוחה כחציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P &lt;0.05) מחושבים על פי מבחן Mann-Whitney. <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> איור ניתוח .3 של נויטרופילים polymorphonuclear (PMN) גיוס ברקמות של ריאות ודרך הנשימה לאחר SLIT. שמונה לעכברי BALB / ג 10 שבועות (n = 4) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי תוואי תת לשוני בהרדמה. 2 שעות מאוחר יותר עכברים היו תיגר על ידי מסלול אף עם MLD של ס ' סרוטיפ pneumoniae 1 E1585. 24 שעות אחרי האתגר, BAL בוצעה וריאות עובדו לניתוח FACS. PMN זוהו כתאי Ly6G גבוהים / CD11b הגבוה / CD11c שליליים ומבוסס על פרופיל FCS-SSC. תוצאות באות לידי ביטוי כאחוז מPMN ביחס של מספרים סלולריים הכולל בBAL או ריאות. ברים מייצגים חציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P &lt;0.05) מחושבים על פי כיוון אחד מבחן Mann-Whitney. <img alt="איור 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> SLIT איור 4 עם flagellin מגן עכברים נגד דלקת ריאות דלקת ריאות חריפות. ס ' סרוטיפ pneumoniae 1 E1585. ההישרדות הוערכה על בסיס יומי. עקומות Kaplan-Meier הושוו על פי יומן דרגה מבחן (Mantel-Cox). כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P &lt;0.05) .Results הם נציג של 2 ניסויים בלתי תלויים. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody align="center"><tr><td> שם </td><td> רצף 5'-3 " </td><td> אורך מוצר PCR (נ"ב) </td></tr><tr><td> MB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> MB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> MIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> MIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> רשימת טבלה 1 פריימר משמשת לניתוח PCR בזמן אמת. רצפי פריימר ספציפיים המשמשים לניתוח qPCR. קדימה לאחור פריימרים לACTB עכבר, Cccl20, Cxcl1, Il6, Tnfa וCxcl1 מוצגים כרצפים '5'-3 ואורך המוצר צפוי מצויינים בזוגות בסיסים (bp).

העבודה הנוכחית ממחישה את הנוחות של שימוש באימונותרפיה תת-לשונית כדי להגביר את התגובה החיסונית המולדת בריאות ולהעניק הגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית חריפה בעכבר.

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש באימונותרפיה תת לשונית כדי להגביר את התגובה החיסונית המולדת בריאות ולהרגיע את ההגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית קטלנית. בעכבר, השלב הראשון מורכב ממתן תמיסה עם דגל החומר החיסוני לתוך הרירית התת-לשונית של עכבר מורדם. לאחר מכן, תרחיף המכיל מינון קטלני של זן גנטי של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מוזרק על ידי שורש תוך-אף לעכברים מורדמים שטופלו בעבר בקו שטוח או במי מלח כביקורת.Broncho bilar lage מבוצע כדי לנתח תת-אוכלוסייה החודרת לדרכי הנשימה ורקמת הריאה מעובדת כדי להשיג תרחיף תא בודד לאפיון פנוטיפי של אוכלוסיית התאים. על ידי ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית, ניתן לעבד בלוטות לימפה מנדיבולריות אביזר כמו גם רקמה תת לשונית לביצוע ציטומטריית זרימה או ניתוח אחר במורד הזרם. אוכלוסיות תאים חודרות לדרכי הנשימה.ניתן לזהות ריאות, או רירית תת לשונית על ידי פנוטיפ חיסוני וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית ניתן לנתח הפעלה חיסונית ברקמות שונות לאחר אימונותרפיה תת לשונית גם על ידי לימוד פרופיל השעתוק על ידי PCR בזמן אמת. ברוכים הבאים למעבדה לחקר חיסונים במחלקה לביוטכנולוגיה, אנו מקצים את בית הספר לרפואה, אוניברסיטת U.אחד האינטרסים העיקריים של המעבדה שלנו הוא לייצר אסטרטגיות חדשות להתערבות חיסונית נגד זיהומים בדרכי הנשימה. הנתיב הבין-אף שימש בהצלחה להעברת חומרים ממריצים חיסוניים לטיפול או מניעה של זיהום ריאות או תיאולוגיה שונה.הראינו כי ניתן להשתמש ביעילות במתן תוך-אף, המרכיב של ג'ל חיידקי לשבירת זיהום ריאות מתמשך הנגרם על ידי עכברי STO. למרות שהשורש התוך-אף דורש בדרך כלל מינון נמוך של החומר הטיפולי וגורם לתגובה חזקה בדרכי הנשימה, יש לו כמה חסרונות כמו האפשרות לרעילות של מערכת העצבים המרכזית ושיתוק פאסיה הקשור לספיגת תרכובות חיסוניות על פני עצבי האורטוריה. לפיכך, הקמנו מודל של אימונותרפיה UAL כחלופה להשראת חסינות מגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית.אימונותרפיה תת לשונית מציעה אלטרנטיבה בטוחה יותר בהשוואה להתקנה תוך-אף. זה לא פולשני, לא כואב ופשוט. אמנם הוא עשוי לדרוש מינונים גבוהים יותר של חומר טיפולי, אבל ניתן להשתמש בו כדי לספק NA או מוצרים פרמצבטיים כדי לווסת בסופו של דבר את התגובה החיסונית לאורך הזמן.כעת נראה לך כיצד לבצע מתן תת לשוני בעכברים באמצעות חנופה כחומר טיפולי. סובין, אימונותרפיה עם חנופה יכולה בסופו של דבר להגן על עכברים מפני אתגר תוך-אף קטלני עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס על ידי הפעלת תגובה חיסונית מולדת לריאות. כמו כן, נתייחס לאפיון אורך, תגובה מולדת במהלך זיהום ולאחר אימונותרפיה תת לשונית באמצעות גיאומטריה זורמת ו-PCR בזמן אמת.לבסוף, נראה לך כיצד לאסוף בלוטות לימפה מקומיות ורקמות תת לשוניות להמשך ניתוח. לאחר הכנת התמיסה של החומר הממריץ לבדיקה, יש להרדים את בעלי החיים על ידי מתן 200 מיקרוליטר של תמיסת Ketamine OSI על ידי Interperitoneal Injection Pet התמיסה המכילה את הממריץ החיסוני בנפח מרבי של 10 מיקרוליטר. לאחר מכן קח את העכבר ביד שמאל והחזק אותו באמצעות האגודל והאצבע המורה ביד החופשית.הניחו בעדינות את המלקחיים הסגורים מתחת ללשון והחזיקו אותו במקומו. בעזרת האצבע האמצעית והקמיצה, קחו את הפיפט והניחו את התמיסה על רצפת הפה והצד הגבי של הלשון. הסר את המלקחיים ואפשר לפה לנוח במשך שלוש עד חמש דקות לפני שתחזיר אותו לכלוב.המאפיינים העיקריים של טכניקה זו הם הנפח הכולל המשמש לטיפול בבעלי החיים וההרדמה. גודלם הקטן של עכברי חלל הפה מגביל את הנפח המרבי שניתן להחיל על היחס התת לשוני ל -10 מיקרוליטר. לאחר שהחלטתם על המינון, עליכם להתאים את ריכוז הדגימה לנפח המרבי הזה.נפחים גדולים יותר עלולים לגרום לבליעה או שאיפה לא רצויה של התמיסה. הרדמה חיונית כדי למנוע בליעה ולאפשר חדירת החומרים דרך האפיתל. אנו ממליצים לך לא להשתמש בשאיפה להרדמה מכיוון שהעכברים יתעוררו מוקדם מדי.שימו לב שחלק מחומרי ההרדמה הניתנים להזרקה עלולים לגרום לרוק בעכברים. אם זה קורה, השתמש בפיסת התאמה קטנה או נייר כדי לחסל את הרוק המוגזם לפני מריחת התמיסה עם החומר הטיפולי, יש להתאים את מינון החומר הטיפולי כדי למקסם את השפעתו ומומלץ מאוד לבדוק מספר מנות. אם השתמשת בעבר בתרכובת שלך על ידי שורש תוך-אף, מינון גבוה פי 5 עד 10 יהיה נקודת התחלה טובה לבדיקה.בדוק את החומר הטיפולי שלך לפי השורש התת-לשוני. שימו לב שהספיגה דרך האפיתל תוגבל על ידי גודל המולקולה להפשיר כמות של מלאי עבודה שהוכן בעבר של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס של צנטריפוגה ידועה של מספר CFU חיידקי למשך חמש דקות ב-2, 500 Gs ולהשליך את ה-supernat Suspend במיליליטר אחד של מלח וצנטריפוגה. שוב, השליכו את הסופרנטנט ואז נוחו.השעו את הגלולה בנפח המתאים של מי מלח סטריליים כדי לקבל תרחיף של ארבע פעמים 10 לחמשת ה-CFU ב-50 מיקרוליטר, התואם את מינון החיידקים המינימלי של הסרוטיפ החלקיקי המשמש הגורם לתמותה של 100% בנורה C.עכברים לוקחים 50 מיקרוליטר מהתרחיף החיידקי ומחדירים בזהירות את הנפח הכולל לנחיריים של עכבר שהורדם בעבר. החזק את העכבר זקוף למשך שתי דקות ותן לו לנוח במצב הגב למשך שתי דקות נוספות. לאחר האתגר, אישר את מספרי ה-CFU בתרחיף החיידקים על ידי ביצוע דילול סדרתי פי עשרה של התרחיף וצלחת אותם על הדם.צלחת אגר דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות עם ריר CO2 של 5%. ניתן להבחין בין מושבות של אתנו על ידי הירוק האופייני לחיידקי אלפא המוליטיים. ספרו יחידות יוצרות מושבה ורשמו את השימוש במינון האתגר.לאחר המתת חסד של החיה, פתח את חלל בית החזה עד הצוואר. בצע חתך לאורך הרגליים הקדמיות כדי לחשוף את קנה הנשימה והאזור התת לשוני. זהה את בלוטות הלימפה של הלסת התחתונה.אלה מופיעים בדרך כלל כמבנים בצורת אליפסה לבנה היושבים מעל בלוטות הרוק. בעזרת מלקחיים עקומת הקצה העדין, משוך בעדינות את הרקמה התת-לשונית כלפי מעלה וחשוף את הצד הגבי של רצפת הפה. קח את בלוטות הלימפה של הלסת התחתונה על ידי משיכה בעדינות כלפי מעלה עם מלקחיים בקצה הדק של הליבה כדי לשחרר אותן מהרקמה.הנח אותם בצינור המכיל C-R-P-M-I או תמיסת שימור חומצות גרעין בהתאם לנוהל במורד הזרם. זה יבוצע מאוחר יותר. כעת זהה את בלוטות הלימפה הקטנות יותר הממוקמות עמוק יותר משני צידי הגרון והוציא אותן.אלה בלוטות הלימפה האביזריות של הלסת התחתונה. פתחו את חלל בית החזה כדי לחשוף את הריאה ולהסיר את בלוטת התימוס. חותכים את הבינה התחתונה CVA ומסירים את עודפי הדם עם רקמה סופגת כדי לבצע את שטיפת הסמפונות.ראשית, חשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן בצע חתך קטן בעזרת אזמל והכנס קצה דק. העבר פפה מלא בעבר במיליליטר אחד של PBS ללא סידן מגנזיום בתוספת מילי-מולרי EDA החדירו בזהירות ושאבו את הנפח הכולל לפחות שלוש פעמים.לאחר מכן שאפו והעבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. לחלחל את הריאות על ידי הזרקת חמישה מיליליטר PBS ללא סידן מגנזיום בתוספת מילי-מולרית EDTA לחדר הימני של הלב כדי לחסל את כל תאי הדם האדומים ותאי החיסון הנמצאים בכלי הדם של הריאות. אם הזלוף בוצע כהלכה, צבע הריאות ישתנה מוורוד ללבן.הסר את הלב, קח את הריאות החדרניות והנח אותן בתמיסה משמרת מדיום או חומצת גרעין מלאה בהתאם לניתוח במורד הזרם שיש לבצע. אם ברצונך לנתח את אוכלוסיית התאים ברירית התת לשונית, בודד את ראש החיה והסר את בלוטות הרוק והצמד רקמות רכות. יש לבצע חתך בכל צד של הפה עד להגעה למפרק הלסת התחתונה ולהפריד את הלסת התחתונה יחד עם הלשון ורצפת הפה.בעזרת זוג מלקחיים קהים של שן חולדה, משוך את הלשון כלפי מעלה ובצע חתך במקום שבו בסיס הלשון פוגש את רצפת הפה. אזור זה מהווה את הרירית התת-לשונית. גזור והסר את הלשון באמצעות אגרוף ביופסיה, מלקחיים ומספריים.גזרו את רקמת הרירית התת-לשונית והניחו אותה בצינור נקי. מעבירים את הריאות לצלחת של 24 בארות ומתכוונים אליהן עם מספריים נקיים. הוסף מיליליטר אחד של מצע עיכול מעלה ומטה מספר פעמים ודגירה ב-37 מעלות ו-5% CO2 למשך 40 דקות לאחר הדגירה.צנחו שוב למעלה ולמטה כדי לוודא שרוב התאים השתחררו מהרקמה. העבירו את תרחיף התאים על מסננת תאים של 40 מיקרו רשת ונשטפו עם חמישה מיליליטר PBAs. צנטריפוגה EDTA של חמש מילי-מולרית ב-2,500 GS חמש דקות.ראוס משהה תאים בפקס EDTA של מיליליטר אחד המורכב מ-PBS ללא סידן, מגנזיום, EDTA מילי-מולרי אחד וסרום בואינג עוברי 1%. קח QU ובצע דילול כפול של התאים עם טריפ וכחול וספירת תאים משהה את התאים לריכוזים של פי שניים פי 10 לשבעת התאים למיליליטר והוסף 50 מיקרוליטר לשפופרת. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים כפולה לכל צינור לניתוח פנוטיפי חיסוני.דגרו במשך 30 דקות על קרח בחושך לאחר שטיפה שלוש פעמים עם עובדות. EDTA משהה את התאים ב-200 מיקרוליטר של עובדות EDTA ומנתח בציטומטר ניתן להשתמש באותו הליך כדי לנתח את אוכלוסיית התאים ברקמה תת לשונית באמצעות אמצעי עיכול המכילים מרחב זה. קולגנאז ו-DS אימונותרפיה תת-לשונית אחת באמצעות קו שטוח מטוהר, אגוניסט של TLR 5 ו-LC 4 גרמו לעלייה משמעותית ברמות ה-mRNA של כימוקינים וציטוקינים המעורבים בגיוס נויטרופילים בריאות.זה נצפה גם במהלך ההדבקה. גיוס PMN לריאות אושר על ידי ציטומטריית זרימה. טיפול תת לשוני עם חמישה אגוניסטים TLR נמצא בקורלציה עם הישרדות מוגברת של בעלי החיים והגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית.הראינו כי אימונותרפיה תת-לשונית היא אמצעי יעיל להשראת הגנה בקווים מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית פולשנית PNE. זה הושג על ידי התקנה תת-לשונית של lain, חייט חמישה אגוניסטים שאינו מיוצר על ידי דלקת ריאות היסטו. התקנה תת לשונית של ויסות מוגבר של הכימוקין C Xcl L אחד בקווים, כמו גם חדירת נויטרופילים.סוג של תאים החיוניים לחיסול אימונותרפיה תת-לשונית של פנאומוקוק עם אגוניסטים של TLR יכול לשמש לטיפול בזיהומים לבד או בשילוב עם טיפולים עדכניים כמו טיפול אנטיביוטי על מנת למנוע התפשטות חיידקים והתפתחות צורות חמורות של זיהום. ניתן להשתמש בשורש תת לשוני גם למתן חיסון והוא הוכח כיעיל להשראת חסינות רירית כמו גם חסינות הגנה מערכתית. אסטרטגיה זו מעניינת במיוחד במקרה של זיהומים בדרכי הנשימה ובמיוחד עבור דלקת ריאות אחיה מכיוון שהיא יכולה לא רק למנוע את המחלה הבסיסית, אלא גם קולוניזציה אסאלית החוסמת את החיידקים בספורט הכניסה.בסך הכל, אנו מאמינים כי המסלול התת-לשוני הוא אלטרנטיבה אטרקטיבית לפיתוח אסטרטגיות חדשות לטיפול או מניעה של זיהומים בדרכי הנשימה. אנו ממליצים לך לנסות טכניקה זו.

sublingual-immunotherapy-as-an-alternative-to-induce-protection

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.

Intralymphatic חיסוני וחיסון בעכברים

intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT) של חומרים כימיים היא שיטה מצוינת, לא פולשנית ללימוד מחלות בדרכי הנשימה, כמו גם שיטה להחדרת חומרים כימיים טיפוליים ישירות לתוך הריאות. זוהי שיטה מהירה ושחזור ביותר אשר מתאימה לניסויים פרה-קליניים.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

אנו מפרטים כאן את המתודולוגיה שננקטה כדי להשוות את יעילות ההגנה והתגובה החיסונית של הריאות הנגרמת על ידי חיסון תוך-אף ותת עורי עם BCG במודל עכבר. התוצאות שלנו מראות את היתרונות של חיסון ריאתי ומצביעות על תפקיד לתגובה בתיווך IL17 בהגנה הנגרמת על ידי חיסון.

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

ניסיוני נהלי מיצוי הבאים של רקמות הלימפה כדי לבדוק את הפעלת תא דנדריטי הלימפה מתוארים לאחר טיפול nanomaterial immunostimulating.

Immunostimulatory הסוכן הערכה: הלימפה רקמות החילוץ, הזרקת תא דנדריטי תלויי-נתיב ההפעלה

המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

מאמר זה מתאר ומדגים את ניהול החיסונים התוך-אנלתיים ואת איסוף החלב מארנבים מניקים (Oryctolagus cuniculus) כאמצעי להערכת חסינות הרירית במודל מתאים מבחינה תרגומית של חיסון אימהי.

חיסון תוך-כלי ואוסף חלב במחקרים על חיסון אימהי בארנבים הלבנים של ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus)

במחקר זה, טכניקת החדרה אנדוטרכיאלית לא פולשנית הוכחה כמפתחת ALI בעכברים באמצעות לרינגוסקופ בסיסי להבטחת העברת LPS מדויקת לריאות. ה-LPS מושתל דרך צינור אנדוטרכיאלי באמצעות לרינגוסקופ. גודל הפגיעה בריאתיות מוערך במספר נקודות זמן.

מתן לא פולשני של ליפופוליסכריד באנדוטרכיה כדי לגרום לפגיעה ריאתית חריפה אצל מכרסמים

למד כיצד אימונותרפיה תת לשונית מגבירה את התגובה החיסונית המולדת בריאות ומספקת הגנה מפני דלקת ריאות pneumococcal קטלנית בעכברים. שיטה זו מציעה חלופה בטוחה יותר להנחתה תוך אףיתית.

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

גלה סרטונים נוספים