Name: רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: חקור דינמיקת נתרן בדנדריטים ובקוצים של נוירונים פירמידתיים בCA1 בהיפוקמפוס של עכבר, באמצעות דימות רב-פוטון בשילוב עם שחרור מיקודי של גלוטמט בתיווך UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הגרמנית למדע (DFG, Ro2327 / 6-1) לCRR המחברים מבקשים להודות ס Durry וג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה, ומ &#39;Dübbert (אלקטרוניקה מעבדה, הזואולוגי מכון , האוניברסיטה של ​​קלן, גרמניה) לעזרה ביישום בקר תא Pockels ומתג HF.

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
<li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+Na%2B+signals+in+spines+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li>
<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
<li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li>
<li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Roy.+Soc.+B-Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li>
<li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li>
<li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mismatch+between+the+Na%2B+flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li>
<li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na%2B+influx+between+axon+and+soma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li>
<li>Denk, W., Piston, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenk%2C+W+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).</li>
<li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Ca%282%2B%29+and+Na%28%2B%29+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li>
<li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK+pump+current+and+%5BNa%5D%28i%29+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+Local+%5BNa%5D%28i%29+depletion+and+Na+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li>
<li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li>
<li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mobility+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li>
<li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li>
<li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm%3A+photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li>
<li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikolenko%2C+V+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22">Cold Spring Harbor protocols</a>. , 1132-1141 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים. המחברים קיבלו תמיכה כספית המאפשרת פרסום גישה פתוח על ידי ראפ אופטו (ודל, גרמניה), אשר מייצר מכשיר המשמש במאמר זה וידאו. החברה לא הייתה מעורבת בניסויים ולא בטיפול בנתונים ולא בכתיבת כתב היד.

המחקר הנוכחי מראה כי SBFI הוא גם מתאים לשני פוטונים הדמיה של עוברי נתרן תאיים בתאים סלולריים קטנים. יש לה להיות כל הזמן לזכור, עם זאת, כי היעילות הקוונטית של SBFI היא נמוכים למדי 15 ויחסי שינויים בריכוז הנתרן הם די קטנים עם פעילות פיזיולוגית. לפיכך, מדידה ברזולוציה גבוהה של עוברי Na + בתהליכי קנס היא משימה יחסית משעממת, וbinning או מיצוע של מספר ניסויים שתידרש כדי להשיג אותות משביעות רצון. בנוסף, קינטיקה של עוברי נתרן היא איטית באופן מפתיע, מה שהופך את החובה להקליט לתקופות זמן ממושכות. תצפית זו מקבילה לאלה במחקרים קודמים, שבו ריקבון monoexponential של עוברי נתרן בדנדריטים עצביים ובהאסטרוציטים התאפיינו בקבועי זמן דעיכה גדולים בטווח של 10 שניות בטמפרטורת חדר 1,2,6. נראה ארעיים נתרן ובכך להפעיל שיתוף זמן הרבה יותר איטיurse וקבועי זמן דעיכה הרבה יותר גדולים בהשוואה לארעית סידן 16. מניח בצד חסרונות אלה, הדמיה נתרן מוכיחה להיות כלי רב ערך לחקירת תכונות פיסיולוגיות של תחומי משנה עצביים. לדוגמא, הדמיה נתרן יכולה לשמש כדי לעקוב אחר פעילות הסינפטית מעוררת באו בסמוך לסינפסות פעילה. בגלל נתרן הוא בעצם לא נאגר 8,17, ארעיים נתרן מושרה פעילותם באופן ליניארי הקשורים למגוון רחב של שחרור גלוטמט הסינפטי או אקסוגני מיושם גלוטמט. הם מכאן מייצגים אינדיקטורים ישירים ובלתי משוחד של פעילות glutamatergic עצבית. יתר על כן, צבעי מחוון נתרן תערוכה של ד K הגבוה (ד K של SBFI הוא בטווח של 25 1 מ&quot;מ). אפילו בריכוזי הצבע תאיים גבוהים יחסית המשמשים להשגת בהירות מספקת (בדרך כלל 0.5-1 מ&quot;מ), ד הגבוה K של לרמוז כי הצבעים עצמם אינם פועלים כמאגרים ליםגנות. כתוצאה מכך, הם לא לעוות כמובן משרעת ולא זמן של עוברי נתרן, שהוא תמיד דאגה כאשר צבעי סידן רגיש הם הציגו לתוך התאים 18. מכאן ניתן להניח כי האותות שאותרו מייצגים מידה טובה של השינויים &quot;האמיתיים&quot; בנתרן תאיים. כמובן הזמן האיטי שלהם ואז משתמע כי המהירות לדיפוזיה תאית לנתרן בתאי עצב היא הרבה יותר קטנה מאשר להניח 19 בעבר. דרישה קריטית עבור הביצוע המוצלח של ניסויים העוסקים במאפיינים של מסלולי הולכה וזרם נתרן הסינפטי מעוררים לתוך עמוד השדרה ודנדריטים היא האינדוקציה של הפעלה מהירה ומקומית מאוד של מבני postsynaptic. ניתן להשיג זאת על ידי יישום מהיר והמקומי של אגוניסטים גלוטמט או מונוסודיום בסביבה הישירה של עמוד השדרה או דנדריט ידי photolysis הבזק של תרכובות כלוב. photolysis פלאש עושה dama לא מכאניge הרקמות, ללא תשלום של חפצי תנועה ומבוסס היטב לחקירה של שאלות קשורות (למשל איתות סידן מקומית). הקוטר של נקודת משחררות הרפרוף היה 1.5 מיקרומטר בxy-המטוס. קרוב משחרר רפרוף לאותות נתרן דנדריט הקוצני מושרה בשני הקוצים ודנדריט ההורה. ואילו האותות נטו להיות הגדול ביותר בעמוד השדרה הקרוב ביותר למקום משחררות הרפרוף, אמפליטודות בדנדריט ההורה וקוצים רחוקים היו עדיין די דומות לאלו בסביבה ישירה של נקודת משחררות הרפרוף. משחרר רפרוף בוצע עבור 300 אלפיות השניים שבמהלכה זרמים פנימה גדלו במשרעת. גלוטמט שברחה מכלוב ייתכן שמתפזר ברקמות במהלך אותה תקופת הזמן, הפעלה מרוחקת יותר ממקום משחררות הרפרוף ionotropic קולטני גלוטמט וזרם נתרן באזורים וקוצים הדנדריטים. בעיה מהותית שמתרחשת בעת שימוש בליזר UV לphotolysis של תרכובות כלוב מנוהלות באמצעות פתרון ים התאהוא &#39;סינון פנימי &quot;. בגלל קצב הספיגה הגבוה של הכלוב, אור UV מוחלש מאוד לאורך הדרך מהמטרה לאתר הגירוי 20,21. דרך אפשרית על מנת להימנע ממצב זה היא זלוף המקומי עם הכלוב, כי היא מוגבלת רק לאתר הגירוי, אשר יתר על כן מקטין את הכמות של תרכובת בכלוב זקוקה למינימום. בהשוואה למשחררות רפרוף בתיווך לייזר סריקת UV, שני פוטונים כמעט אינפרא אדום 22 משחררות רפרוף הוא מרחבית מדויקת יותר, בעיקר בגלל הדיוק של הגירוי מוגבר בציר z. מצד השני, בשל החתך הקטן של כלובים נפוצים לאורכי גל ארוכים יותר כפי שהיא מתבצעת עם שני פוטונים עירור, או ריכוז גבוה של המתחם בכלוב או גבוה מאוד, יש צורך בעוצמות אור פוטנציאל phototoxic. כמו כן, משחררות רפרוף שני פוטונים מחייבים השקעה גבוהה בהרבה בציוד; בין השאר, לייזר נוסף IR בתוספת הרכיבים האופטיים הנדרשים, יש צורך. SBFI ומשרד התשתיות הלאומי-גלוטמט שניהם להתרגש בטווח אורכי הגל הזהה. זה עלול להוביל לתלות הדדית לא מכוונת של לייזר UV משחררות רפרוף וSBFI או לייזר ההדמיה IR ומשרד התשתיות הלאומי, גלוטמט, וכתוצאה מכך הלבנת SBFI על ידי הבזק משחררות הרפרוף ו / או משחררות רפרוף רציפה של גלוטמט על ידי קרן IR. עם זאת, כפי שמוצג באיור 6 ג, לא פלאש UV על ידי עצמו ולא ההדמיה פוטון הרב נגרם שפעות גומלין כזה בתנאי הניסוי שלנו. מערכות UV-פלאש דומים לזה שתואר כאן משמשות באופן שיגרתי בהרבה מעבדות אחרות ויכולות בקלות יחסית להיות משולבת בתוך כל מיקרוסקופ הדמיה רב פוטון הקיים. הוא מציע יתרון שקרן הלייזר לphotolysis ניתן למקם באופן חופשי בשדה הראייה. בנוסף, המערכת מאפשרת מיקום מחדש מהיר ואוטומטי של קרן הלייזר ואת שחרורו נפח, בהתאמה, בשדה הראייה במהלך ניסוי. Ouשינוי r מפשט ומשפר את המיקום מדויק של נקודת משחררות הרפרוף, כך שהמסגרות של תוכנת ההדמיה יכולות לשמש כדי להתאים מסגרות הדמיה ומשחררות רפרוף congruently. יחדיו, כל תא תיקון מהדק והדמיה נתרן רב פוטון בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף UV-induced אור של גלוטמט, מאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. וכך זה יכול לשמש כדי לנתח את המאפיינים של שידור סינפטי מעורר ושל אותות נתרן postsynaptic בתאי עצב ברקמה שלמה.

שיפורים שנעשה לאחרונה בטכניקות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופיה רב הפוטון אפשרו המחקר של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, טכניקות אלה נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי לנתח אותות הקשורים לפעילות חשמליות בתאי עצב, כמו גם אותות סידן במקביל בתאי subcellular קטנים, כלומר בדנדריטים קנס וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה, את המאפיינים שלו הם במידה רבה לא נחקרו. ניתן לנתח אותות אלה על ידי שני פוטונים הדמיה של נתרן תאיים ([Na +] i) המאפשרת המדידה של [Na +] אני ארעיים לתקופה ממושכת בלי הלבנת צבע משמעותית או צילום נזק 1,2 on-line. להדמיה של [Na +] i </תת&gt;, צבעי מחוון כימי רק כמה זמינים, למשל קורונה הירוקה לאסנטה נתרן הירוק 3,4. הבדיקה הניאון הנפוצה ביותר עבור Na + הדמיה היא isophthalate benzofuran (SBFI) מחייב נתרן. זה ratiometric, צבע UV-נרגש דומה לפורע-2 צבע סידן רגיש הידוע וכבר מועסק הדמיה Na + קונבנציונלית בסוגי תאים רבים (לדוגמא 5,6). ישנן אפשרויות שונות של מרגש הצבע ואיסוף הקרינה שלה. אם רזולוציה גבוהה זמנית (כלומר קצב פריימים גבוה הדמיה) נדרשת בשילוב עם מידע מרחבי, SBFI יכול להיות נרגש עם מנורת קשת קסנון או דיודה מכשיר בהספק גבוה פולטות אור (LED) ובפליטה שלה זוהתה עם תשלום במהירות גבוה מכשיר -coupled 7,8 (CCD) מצלמה. לרזולוציה מרחבית מקסימלי עמוקה ברקמה, מיקרוסקופיה סריקת לייזר רב פוטון היא שיטת הבחירה 9. Efficie הקוונטים הנמוך יחסיתncy של SBFI מחייב ריכוזים גבוהים יחסית צבע (0.5-2 מ&quot;מ), וטעינה ישירה של צורת קרום בלתי חדיר של SBFI באמצעות חדה פיפטה microelectrode 10 או תיקון 1. באמצעות SBFI, עבודה קודמת שבוצעה בחתכי רקמה חריפים של ההיפוקמפוס המכרסמים הראתה ארעיים נתרן הקשורים לפעילות בדנדריטים ועמוד שדרה של נוירונים הפירמידה CA1 שנגרמים בעיקר על ידי זרם של נתרן דרך ionotropic NMDA הקולטני 1,2. לצורך המחקר של המאפיינים של אותות נתרן מקומיים כגון בפירוט רב יותר, הפעלה ספציפית של קולטנים postsynaptic על ידי יישום של אגוניסטים לקולטן היא שיטה גם מתאימה-בחירה. כדי לחקות פעילות presynaptic ושחרור משדר, יישום צריך להיות קצר יחסית וממוקד כדי לאפשר גירוי מקומי. זה, עם זאת, מוכיח להיות די מאתגר ברקמה שלמה. יישום לחץ מקומי של אגוניסטים לקולטן באמצעות פיפטה דקה שקצהו מאפשר ap מאוד מוקדיקפול, אבל מארח את הסיכון הפוטנציאלי להפקת תנועה של המבנה של עניין (למשל כמו דנדריט או קוצים הדנדריטים), ובכך מעכב את ההדמיה ברזולוציה גבוהה. התאמתו של iontophoresis של חומרי נוירו פעיל תלויה בתכונות חשמליות שלהם ואמפליטודות נוכחית גבוהה עלולה לייצר חפצים סלולריים, כמו גם. אחת דרכים לעקוף מכשולים אלה היא התעסוקה של תרכובות המופעלת תמונה וphotolysis הבזק שלהם. בעיקרון, שני עקרונות שונים המשמשים לצילום הפעלה של חומרים בכלוב: I) רחב בתחום הבזק photolysis 11 וII) משחררות רפרוף מוקד העסקת מודולים סריקה בשילוב עם לייזרים 12. בעוד photolysis הבזק רחב בתחום משמש להפעלת אזורים גדולים יותר של עניין, למשל כל תא, משחררות רפרוף מוקד מועסק כדי לעורר באופן ספציפי תאים סלולריים קטנים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים הליך לכל תא תיקון מהדק ורב-pההדמיה hoton נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף מושרה UV-האור של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה.

<table><tbody><tr><td>נימי בורוסיליקט-זכוכית</td><td>הילגנברג</td><td>1405059</td><td>75 x 2 מ"מ, עובי דופן 0.3 מ"מ</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC מצלמה תואמת</td></tr><tr><td>Deconvolution תוכנה</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר סיבים אופטיים</td><td>אוקיינוס אופטיקה</td><td>USB 4000</td><td>ספקטרומטר סיבים אופטיים מיניאטוריים</td></tr><tr><td>צינורות סינון</td>פילטר צנטריפוגלי <td>VWR</td><td></td><td>, 0.2 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>אולימפוס אירופה</td><td>Flowview גרסה 5.0c, בקר כוח קרן IR Tiempo</td><td></td></tr><tr><td></td> בקרת <td>עוצמת קרן לייזר מובנית בהתאמה אישית + מעבר מהיר לאפס ב-flyback באמצעות לייזר</td><td></td> אינפרא אדום תא פוקלס ספקטרה פיזיקה לייזר מתכוונן Ti:Sa מאי-טאי fs (710 - 990 ננומטר);<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> זהירות</td></tr><tr><td>צג כוח IR</td><td>בהתאמה אישית</td> מיקרומניפולטור Burleigh <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ/מערכת הדמיה</td><td>אולימפוס אירופה</td><td>BX51WI/FV300</td><td>שניהם, המיקרוסקופ ומערכות ההדמיה שונו מאוד</td></tr><tr><td>גלגל מסנן ND</td><td>ניופורט</td><td>50Q04AV.2</td><td>סיליקה התמזגה UV, צפיפות אופטית 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>מטרה</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק</td><td>תיקון HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>Narishige</td><td>דגם PP-830</td><td></td></tr><tr><td>מערכת פליטת תרופות פנאומטית</td><td>NPI אלקטרוני</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>תא Pockels</td><td>קונאופטיקה</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, משמש כמתג מהיר ולכוונון כוח</td></tr><tr><td>תא Pockels דרייבר</td><td>קונאופטיקה</td><td>M302-RM</td><td>מגבר דיפרנציאלי במתח גבוה</td></tr><tr><td>תריס</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF 2 להבי BeCu</td></tr><tr><td>מצופים בקר תריס</td> בהתאמה אישית דרייבר תריס <td>בנוי</td><td></td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td>Vincent</td><td>Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>פורס/ויברטום</td><td>תרמו מדעי</td><td>מיקרום HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת פתיחת</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + לייזר UV של NetCam</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw לייזר DPSSL, 355 ננומטר; 10 מגה-וואט; זהירות</td></tr><tr><td>מערכת סריקת לייזר UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>מערכת סריקה גלוונומטרית</td></tr><tr><td><חזקה>שם תרכובת</חזקה></td><td><חזקה>חברה</חזקה></td><td><חזקה>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות/ תיאור</חזק</td></tr><tr><td>>CNQX</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C-127</td><td>אנטגוניסט לקולטן AMPA; זהירות</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>אלפא Aesar</td><td>J64210</td><td>אנטגוניסט לקולטן NMDA; זהירות</td></tr><tr><td>SBFI K+ מלח</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>מעכב תעלות Na+ תלויות מתח; זהירות</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>גלוטמט בכלוב המשתחרר עם הימנעות מ-UV</td></tr></tbody></table>

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך uv של גלוטמט בca1 פירמידת נוירונים

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון אפשר הניתוח של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אותות סידן הקשורים לפעילות בתאי subcellular קטנים כגון דנדריטים וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן postsynaptic, את המאפיינים שלו הם הבינו רק באופן שולי. כאן, אנו מתארים שיטה לתיקון מהדק בשילוב כל תא והדמיה נתרן רב פוטון בתחומים מיקרו סלולריים של נוירונים מרכזיים. יתר על כן, אנו מציגים הליך הותאם לאולטרה סגול (UV) משחררות רפרוף מושרה -light של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. לשם כך, כל תא הקלטות בוצעו ביחידת משנה Cornu Ammonis 1 (CA1) נוירונים פירמידה בחתכי רקמה חריפים שלההיפוקמפוס עכבר. נוירונים היו מלאים בSBFI צבע פלואורסצנטי נתרן רגיש באמצעות התיקון-פיפטה, ועירור רב פוטונים של SBFI אפשר להדמיה של דנדריטים וקוצים סמוכים. להקים משחררות רפרוף מוקד מושרה UV, מספר פרמטרים ובכלל זה עוצמת אור, עוצמת קול מושפע מקורה משחררות רפרוף UV, מיצוב של הקרן, כמו גם ריכוז של המתחם בכלוב נבדקו ומותאמים. התוצאות שלנו מראות כי זלוף המקומי עם גלוטמט בכלוב (משרד התשתיות הלאומי-גלוטמט) ותוצאת UV-משחררות רפרוף המוקד שלה בזרמים פנימה וארעיים נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה. כמובן זמן והמשרעת של שני זרמים פנימה ואותות נתרן לתאם עם משך דופק משחררות הרפרוף. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים חסומים בנוכחות חוסמי לionotropic קולטני גלוטמט, הוכחה כי הם מתווכים על ידי זרם נתרן למרות שמסלול זה. לסיכום, השיטה שלנו מספקת כלי אמין לחקירה של אותות נתרן תאיים הנגרמים על ידי הפעלת קולט מוקדי ברקמת המוח שלמה.

במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים הליך למיקרוסקופיה רב פוטון של דינמיקת נתרן סלולרית עם SBFI צבע פלואורסצנטי נתרן תלוי בנוירונים הפירמידה CA1 של פרוסות רקמה בהיפוקמפוס עכבר חריף. יתר על כן, אנו מראים כיצד לשלב טכניקת הדמיה זו עם משחררות רפרוף מבוססות לייזר לסריקת של תרכובות נוירו פעיל (לדוגמא גלוטמט בכלוב) ו מדויק מיקוד למייקרו תחומים סלולריים. נוירונים טעינה עם SBFI באמצעות התיקון-פיפטה אפשרו להדמיה של כל התא כולל דנדריטים קנס וקוצים סמוכים על ידי העסקת עירור רב פוטונים (איור 6 א ', ב', ד 'ואיור 7 א). <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> איור 6 אותות נתרן וזרמים סינפטיים הנגרמים על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב. () מקסיםתמונת הקרנת אל של נוירון פירמידלי CA1 עמוס SBFI באמצעות פיפטה התיקון (PP). התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת B. LP מציין את המיקום וכיוון של פיפטה לזלוף המקומי של גלוטמט בכלוב. הקרנת המרבית הספק גבוה של ערימה של חלקים אופטיים של דנדריט עם קוצים הדנדריטים סמוכים (B). הערימות של חלקים אופטיים עברו z-יישור וdeconvolution. הצלב האדום מציין את אזור היעד של קרן משחררות הרפרוף. הקו המקווקו הכתום משרטט את האזור של עניין שממנו פליטת הקרינה נרשמה. התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת ד (ג) משמאל: אות נתרן (בשורה העליונה) וסומטי פנימה (בשורה תחתונה) נוכחית הנגרם על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב (שצוין על ידי הבזק צהוב). הקו האדום מייצג את נתוני הניסוי בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300אלפיות שני) חסומים ההדמיה של הקרינה SBFI ימנית:. ללא מראש זלוף עם גלוטמט בכלוב, אותו UV-הבזק לא עוררו שינוי בפליטת SBFI, ולא זרם פנימה (ד ') משמאל:. כוח תמונה גבוהה של דנדריט וסמוך קוצים כפי שמסומן בB. צד, את אותה תמונה עם ערכים אפורים הפוכים. קווים מקווקווים מציינים את האזורים של עניין שבו פליטת הקרינה נרשמה. הצלב האדום מציין את הלוקליזציה של קרן משחררות הרפרוף ימני:. ארעיים נתרן הנגרם על ידי UV-flash photolysis של גלוטמט בכלוב. עקבות כחולה: אותות נתרן בדנדריט; עקבות אדומות: ממוצע תגובה משלושה קוצים סמוכים למקום משחררות הרפרוף; עקבות ירוקות: ממוצע תגובה משלושה קוצים רחוקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר זלוף המקומי עם כלובגלוטמט, החלת UV-הבזק קרוב לדנדריט הביאה לירידה זמנית בפליטת הקרינה של SBFI, המשקפת עלייה בריכוז הנתרן התוך התאי (איור 6 ג, ד ואיור 7). במקביל, זרם פנימה נרשם בסומה (איור 6C ואיור 7). הגדלת משך הזמן של פלאש UV הביאה הגדלת אמפליטודות של שני עוררו פנימה זרמים ואותות נתרן (מידע לא מוצג), מצביעה על כך שהמערכת הייתה גם בטווח הדינמי שלה וכי תגובות לא משחררות רפרוף ולא סלולריות היו רוויות. יישום של UV-flash של משך זהה או יותר לפרוסות אשר לא היה מראש perfused עם גלוטמט בכלוב, מעולם לא עורר שינויים בקרינת SBFI ולא זרמים פנימה, מצביע על כך שהאותות הללו הם תוצאה של משחררות הרפרוף של גלוטמט (איור 6 ג). יתר על כן, תוצאות אלו מראות כי אין תלות הדדית של מרכיבי imaging- ומשחררות רפרוף הוא ציינה under תנאי הניסוי שלנו. אותות נתרן גם ניתן היו לזהות בקוצים הדנדריטים (איור 6 ד). למרות שאנו לא ננסה להשיג גירוי של עמוד השדרה אחת בלבד עם משחררות רפרוף גלוטמט, אמפליטודות שיא נטו להיות מעט גבוה יותר בעמוד שדרה קרובה למקום משחררות הרפרוף, ואילו עמוד השדרה רחוקה הראתה כמעט זהים הקרינה שינויים כדנדריט ההורה (איור 6 ד). לבסוף, למדנו המסלול לזרם נתרן לתוך דנדריטים וקוצים בתגובה למשחררות רפרוף של גלוטמט. לשם כך, אנו מועסקים CNQX וAPV, אשר הם חוסמי בררניים לקולטניים גלוטמט נתרן חדיר, ionotropic של AMPA- וNMDA-תת סוג, בהתאמה. התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים הנגרם על ידי גלוטמט והזרמים סומטיים שהושרו הושמטו בנוכחות של חוסמי אלה (איור 7). על כביסה מהחוסמים, האותות חזרו. זה מדגים thaמשחררות רפרוף t של גלוטמט מפעיל קולטני גלוטמט ionotropic על נוירונים הפירמידה CA1, אשר מתווכים הזרם של נתרן לדנדריטים ועמוד שדרה, וכתוצאה מכך ארעיים נתרן תאיים וזרמים פנימה. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> איור 7 פרופיל תרופתי של אותות נתרן עוררו וזרמים פנימה. נוירון פירמידלי CA1 מלא SBFI עם פיפטה התיקון (PP) (א) מצורף לסומה (ב ') משמאל:. חולף נתרן ונוכחי סומטי הנגרם על ידי צילום הפעלה של גלוטמט בכלוב בדנדריט וקוצים מצורפים מרכז:. זלוף עם חוסמי הקולטן לגלוטמט ionotropic CNQX וAPV מעכבים שתי אות נתרן והזרם פנימה הנגרם על ידי משחרר רפרוף ימני:. עם כביסה מהחוסמים, האותות משוחזרים. Represen הקו האדוםts של נתונים הניסיוניים בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300 אלפיות השנייה) חסום ההדמיה של הקרינה SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעורר ולנתח דינמיקת נתרן בתאים תאיים קטנים, כגון עמודי שדרה ודנדריטים של נוירונים מרכזיים ברקמה השלמה. זה מושג על ידי הכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה של עכבר, העמסת נוירון פירמידלי עם הצבע הפלואורסצנטי הרגיש לנתרן SBFI דרך פיפטת תיקון, והדמיה של המורפולוגיה התאית באמצעות עירור רב פוטונים. השלבים הבאים הם לבחור דנדריט קוצני לניסוי ולהזריק פולי תרכובת המופעלת באור כגון גלוטמט בכלוב קרוב לדנדריט זה.לאחר מכן מוחל הבזק UV על גלוטמט פולי ללא שימוש באמצעות לייזר UV שהוצב במדויק כדי למקד לנפח קטן קרוב לדנדריט הנבחר. השלב האחרון הוא לעקוב אחר השינויים הנובעים בפלואורסצנטיות SBFI בדנדריט, ולעקוב אחר השינויים הנובעים בנתרן בקוצים הסמוכים. זרמי הממברנה הנלווים נרשמים גם הם.בסופו של דבר, שימוש בכלים פרמקולוגיים מתאימים כגון חוסמי קולטנים יאפשר לחקור את המנגנונים המייצרים את אותות הנתרן התוך תאיים המעוררים. שיטה זו מספקת כלי אמין לחקירת אותות נתרן תוך תאיים בתאים תאיים קטנים וברקמת מוח שלמה. כאן אנו משלבים מהדק תיקון תא שלם והדמיית נתרן רב-פוטונית עם הליך שונה לפירוק המושרה על ידי אור UV.עם מאפשר לנו לנטר תגובות תאיות על יישומים מדויקים ומוקדיים של תרכובות נוירואקטיביות. ההליך יודגם על ידי קארל KA ועל ידי קאן קליינהנס, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל בדיסקציה של הרקמה, הנח מיד את המוח בצלחת פטרי עם דיסקציה קרה כקרח, נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה או CSF ונתח חצי כדור על ידי ביצוע חתך סגיטלי לאורך קו האמצע.בצע חיתוך שני בכיוון הרצוי כמשטח חוסם. לאחר מכן חבר את זה לשלב החיתוך של ויברם עם דבק סופר. לאחר הוצאת תא החיתוך ואלמנט הקירור של הוויברם מהמקפיא, הנח את שלב החיתוך עם חלק המוח בתא.לאחר מכן הכניסו את אלמנט הקירור לתא וטבלו את הרקמה בדיסקציה קרה כקרח A CSF. לאחר מכן חותכים בעובי 250 מיקרומטר. פרוסות פרה-סגיטליות של ההיפוקמפוס עם ויומיום.ודא שנוזלי CS מבעבעים בכל עת. לאחר החיתוך, שמור את הרקמה על רשת בכוס עם CSF רגיל ודגירה בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שמור את הרקמה בטמפרטורת החדר.ניסוי זה אמור להתבצע בסביבה חשוכה, אך מוצג כאן בתנאי אור עמום למטרות צילום. כדי להכין חומרה תחילה, הפעל את רכיבי מערכת הרב-פוטונים והתאם את יישור קרן הלייזר האינפרא אדום כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן התאם את אורך הגל של הלייזר הרב-פוטוני ואת עוצמת הקרן על ידי שינוי ההגדרות של תא ה-pcal ומכפילי הצילום.לאחר מכן, הפעל וכייל את מערכת הפתיחה על ידי הנחת שקופית דגימה פלואורסצנטית מתחת לעדשת האובייקטיב. התחל את שגרת הכיול של תוכנת בקרת יחידת השחרור. הגדר את לייזר ה-UV למספר נקודות בטווח הסריקה שלו בזמן שהפלואורסצנציה נלכדת במצלמת CCD על ידי לחיצה על נקודת לייזר ה-UV.בכל נקודה, התאם את המיקום של מראות הסריקה הגלווניות כך שיתאימו לקואורדינטה מסוימת בתוכנה. המיקום המדויק של נקודת הביטול מושג על ידי ייבוא תמונה של מערכת ההדמיה באמצעות חיבור רשת בין מחשבי ההדמיה וההדמיה. שימוש בתוכנת תפיסת מסך קרא באופן רציף את המסגרות של תוכנת ההדמיה והתאם את ההדמיה.ובמסגרות כלוב שבוצעו, ייצא בהתאמה כל פריים עשירי מתוכנת ההדמיה כתמונת ייחוס ליחידת הפלאש כדי להבטיח התאמה נכונה במהלך כל הניסוי. לאחר מכן, הפעל את רכיבי האלקטרופיזיולוגיה של המיקרו-מניפולטורים ואת מכשיר יישום הלחץ להעברת התרכובת הכלואה לאזור היעד. משוך פיפטות לתיקון תא שלם מהדק ושפע מקומי באמצעות נימי זכוכית בורו סיליקט מלוטשים באש.לאחר מכן הניחו את הפרוסה באמבט הניסיוני וכדי לתקן אותה עם רשת, הניחו את האמבטיה בשלב המיקרוסקופ וחדרו את הפרוסה לצמיתות עם CSF. התחל את הידוק תיקון התא השלם על ידי העמסת פיפטת התיקון בתמיסה תוך-תאית או ICS המכילה SBFI ולאחר מכן טען את פיפטת הזלוף המקומית בתרכובת כלואה. חבר את הפיפטות למניפולטורים המיקרו המתאימים והנח את אלקטרודת הייחוס באמבטיה.בחר תא פירמידלי CA אחד עם סומה הממוקמת 30 עד 70 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה כדי להבטיח מורפולוגיה שלמה של תאים כמו גם פיזור נמוך והנחתה של הקרן המתפרקת. התקרב לתא זה עם פיפטת תיקון המשתמשת במיקרוסקופ וידאו IR DIC. יש לשאוב בעדינות עד לקבלת חותם ג'יגה.פיצוי על קיבולת מהירה. לאחר מכן שוברים את הממברנה ופותחים את התא כדי לקבל תצורת תאים. לבסוף, הערך את כדאיות התא במצב מהדק נוכחי.הזרקו זרם דה-פולריזציה ובדקו אם יש פעילות זינוק כתוצאה מכך לביצוע הדמיה וגירוי. ראשית, הוסף טטרו DOIND ל-CSF כדי למנוע הפעלה של תעלות נתרן מגודרות מתח ויצירת פוטנציאל פעולה. דמיין מורפולוגיה תאית באמצעות עירור רב פוטונים וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות SBFI.בחר דנדריט קוצני לניסוי. התקרב לתמונות ברזולוציה גבוהה יותר ומקם תיבת קליפ סביב הדנדריט. לאחר מכן הניחו את הפיפטה עם התרכובת הכלואה ליד הדנדריט.מקם את הפיפטה כדי לאפשר זלוף מקומי יעיל של הדנדריט לבחירתך. כוונן את הלייזר הפותח כדי למקם את נקודת הפתיחה קרוב למבנה העניין. לאחר מכן, הגדר אזורי עניין על הדנדריט שנבחר ועל הקוצים הסמוכים באמצעות תוכנת הדמיה.התקרב לאזור העניין והזריק את התרכובת הכלואה למשך מספר שניות עם תיקון התחלה בלחץ נמוך, מהדק והקלטות פלואורסצנטיות באמצעות אות ההדק. במהלך השפע המקומי של התרכובת הכלואה, קרן העירור מעומעמת לחלוטין כדי למנוע הלבנה. לאחר מכן, הפסק את השפע המקומי של התרכובת הכלואה.לאחר מכן הגדל את העוצמה של שני לייזר הפוטונים כדי לאפשר עירור יעיל של SBFI ולהפעיל הבזק UV כדי לאתחל בכלוב שינויים בקרינה SBFI כמו גם זרם סומטי להמשיך להפסיק את ההקלטה לאחר שהפלואורסצנציה SBFI התאוששה בחזרה לקו הבסיס. כדי לקבל מורפולוגיה רשום ערימת XY, Z של אזור תיבת הקליפ שהוגדרה עבור המדידות שבוצעו. ודא שערימה זו נדגמה יתר על המידה מרחבית כדי לאפשר דה-קונבולוציה אופטימלית של התמונה וכדי לשפר את איכות התמונה והרזולוציה.העמסת נוירונים עם SBFI דרך פיפטת התיקון אפשרה הדמיה של התא כולו, כולל דנדריטים עדינים ועמודי שדרה סמוכים על ידי שימוש בעירור רב פוטונים לאחר זלוף מקומי עם גלוטמט בכלוב. הפעלת הבזק UV קרוב לדנדריט הביאה לירידה חולפת בפליטת הפלואורסצנט של SBFI המשקפת עלייה בריכוז הנתרן התוך תאי. במקביל, נרשם זרם פנימה ביישום SOMA של הבזק UV על פרוסות, שלא הוחדרו מראש עם גלוטמט בכלוב.מעולם לא עורר שינויים בפלואורסצנטיות SBFI או בזרמים פנימה המצביעים על כך שאותות אלה נובעים מפירוק הגלוטמט. משרעות השיא היו מעט גבוהות יותר בקוצים הקרובים לנקודת הפתיחה, בעוד שדפוסים לקוצים נוספים דמו לדנדריט האב. המסלול לזרימת נתרן לדנדריטים ולקוצים בתגובה לפירוק גלוטמט נחקר באמצעות חוסמים סלקטיביים עבור קולטני הגלוטמט היונוטרופיים החדירים לנתרן, אותות נתרן תוך-תאיים המושרים על ידי גלוטמט, והזרמים הסומטיים שנוצרו הושמטו בנוכחות חוסמים אלה.עם שטיפת החוסמים, האותות מתקבלים מחדש, ומדגימים כי פירוק גלוטמט מפעיל קולטני גלוטמט ציטוטרופיים על נוירונים פירמידליים וכתוצאה מכך נתרן חולף תוך תאי וזרמים פנימה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור את העוצמה הנמוכה ביותר האפשרית עבור לייזר האינפרא אדום כדי למזער כל נזק לתכשיר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השלבים הקריטיים של הגישה הניסיונית שלנו לחקר איתות נתרן בשרידי מיקרו תאים לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של פעילות מעוררת אותות יונים תוך תאיים ברקמה השלמה, הנקייה מחפצי תנועה כפי שהוצגו בטכניקות אחרות.

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca2+ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca2+ חריגה בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

חקור דינמיקת נתרן בדנדריטים ובקוצים של נוירונים פירמידתיים בCA1 בהיפוקמפוס של עכבר, באמצעות דימות רב-פוטון בשילוב עם שחרור מיקודי של גלוטמט בתיווך UV.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

גלה סרטונים נוספים