ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחדיר mRNA, המקודד חלבון פלואורסצנטי לביציות לאטאם של הסימפונות כדי לאפשר הדמיה פלואורסצנטית in vivo של עוברים מתפתחים. זה מושג על ידי גרימת השרצה ראשונה של אמפי איי בשלים, זכרים ונקבות על ידי הלם טמפרטורה של 24 שעות. לאחר הלם הטמפרטורה, הנקבות והזכרים מוכנסים לכוסות הטלה בודדות, מה שמאפשר איסוף של ביציות וזרע בהתאמה.

ברגע שהצייט מסודר בכלי מצופה פוליליזין, מחט מיקרו-הזרקה מוכנה במיוחד משמשת להזרקת תמיסה בתוך ליבת הצייט. השלב האחרון הוא הפריית הצייט עם טיפה אחת עד חמש טיפות זרע. בסופו של דבר סריקת לייזר של שני פוטונים.

מיקרוסקופיה משמשת כדי להראות את הביטוי בכל מקום של החלבונים הפלואורסצנטיים המיוצרים מהמיקרו mRNA המוזרק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבי מיקרו-הזרקה מכיוון שהמיומנויות הטכניות הנדרשות שאי אפשר לפרט ולכסות בדפוס. כדי להתחיל, הכינו את הכלים המצופים פוליליזין המשמשים לשיתוק הציטים במהלך ההזרקה.

עבור כל צלחת פטרי של תרבית תאים בגודל 35 מילימטר, מכסים את התחתית בתמיסת פוליליזין ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את תמיסת הפוליליזין לכלי אחר ושוב, דגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השליכו את התמיסה ותנו לצלחות הפטרי להתייבש הפוך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

כאשר הם יבשים יש לאחסן את הכלים המצופים עטופים בניילון נצמד בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. להכנת הכלים המצופים ארוס המשמשים לתרבית עוברים מוזרקים, הכינו מי ים מלאכותיים ומי אוסמוזה הפוכה. לאחר מכן, ממיסים ארוס לריכוז של 1% ב-SW מסונן שפכו במהירות את תמיסת הארוס החמה מצלחת פטרי אחת לאחרת כדי להבטיח ציפוי ארוס דק מאוד של המנה.

עוטפים את הכלים המצופים בניילון סרן ומאחסנים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. ראשית, הכינו את תערובת ההזרקה ב-RNA ובפנול מים ללא DNA. אדום צובע את התמיסה ומאפשר זיהוי של עוברים שהוזרקו בהצלחה.

לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת כדי לגלול את הגבישים ולשמור על קרח עד שמוכן לשימוש. כשהוא מוכן, טען פיפטה של 10 מיקרוליטר עם 0.5 מיקרוליטר מתערובת ההזרקה, והימנע מתחתית הצינור שבו כדורו הגבישים. מלא מחדש את מחט ההזרקה על ידי פיפטינג של טיפת ההזרקה של 0.5 מיקרוליטר.

מערבבים לתוך הפתח הגדול של המחט. הכן שתי מחטים למקרה שאחת תישבר במהלך ההזרקה. אחסן את המחטים בצנצנת עם מים בתחתית כדי למנוע אידוי של ההזרקה.

מערבבים ומניחים על ארבע מעלות צלזיוס. הניחו לתערובת ההזרקה לנוע לאט לקצה מחט ההזרקה למשך שעה אחת לפחות כדי למזער את יצירת הבועות. כדי להתחיל באיסוף ביציות וזרע, זכרים ונקבות עוברים שוק במערב למשך 24 שעות ולאחר מכן מועברים לכוסות בודדות שעה עד שעתיים לפני ההשרצה.

עם ההטלה, אסוף מיד זרע וציטים. הקפד לא להבהיל את המבוגרים במהלך האיסוף. תנועה נוספת יכולה להתפזר ומכאן לדלל גם את הזרע וגם את הציטים לאחר האיסוף.

שמור את הזרע על הקרח בשפופרת של 1.5 מיליליטר והעביר את הציטים ב-SW מסונן לצלחות פטרי שטופות מראש. העבירו 100 עד 500 ציטים לצלחת פטרי נוספת של 35 מילימטר כדי לבצע את הזריקות. לבסוף, דשן את שארית מצמד הציטים כבקרה על איכות הזרע והציט או לניסויים אחרים.

כדי להתחיל בהליך ההזרקה, התקן את המחט על המניפולטור המיקרו בזווית של 50 מעלות ביחס למישור האופקי תחת טווח חיתוך פלואורסצנטי עם 25 עיניים חיצוניות, העביר 30 ציטים לכלי מצופה פוליליזין וסינן SW כדי לסייע במעקב אחר ציטים מוזרקים. הפקידו אותם לאורך קו בצורה מסודרת. הזרקו תמיד מספרים קטנים כדי למזער את החשיפה.

הגיע הזמן לפוליליזין, הנוטה לעוות עוברים מתפתחים. השתמש בתאורת השדה הכהה כדי להפוך את הצייטים לשקופים ככל האפשר. לאחר מכן בעזרת כפתור התנועה הגס, קירבו את מחט ההזרקה לצייט בעזרת מלקחיים עדינים. חתך.

פתח את המחט ברמה שבה הקצה מתחיל להתעקל על ידי פעימה עם המזרק. ודא שתערובת ההזרקה האדומה זורמת מהמחט בהגדלה של פי 200. ועם כפתור התנועה העדין, הזז בעדינות את מחט ההזרקה בתוך ליבת הצייט.

אם מוכנס פעמיים באופן שטחי, התמיסה המוזרקת לא תישאר בתוך אתר ה-UO. אם יוכנס רחוק מדי, אתר ה-UO ייהרס. יש להזריק בפולס אחד עד שלוש.

אם המחט עדינה מספיק, הזריק זרימה רציפה בלחץ קבוע. ודא שנפח ההזרקה מתאים לחמישית עד שליש מהנפח של ביצית בודדת לאחר ההזרקה. משוך את המחט החוצה במהירות כדי למנוע דליפה.

ודא שהתמיסה המוזרקת נשארת בתוך הצייט וכי לאחר מספר שניות, התמיסה המוזרקת מתפשטת ברחבי הצייט. עברו לצייט הבא בתור. שמור כמה עוברים מוזרקים מכל סדרה כבקרות שליליות כדי להעריך את הקרינה ברקע בעת סריקה לעוברים מוזרקים מפרים את הביציות ברגע שהסדרה הוזרקה.

מכיוון שאיכות הביציות יורדת עם הזמן, יש להזריק ולהפרות ציטים תוך שעה. לאחר ההשרצה. בהתאם לריכוז הזרע, הוסף טיפה אחת עד חמש טיפות זרע ל-UY וסובב את הצלחת.

מעטפת ההפריה אמורה להתגלות על העוברים. לאחר כדקה, אפשר לעוברים להתנתק מהצלחת המצופה פוליליזין תוך הזרקת סדרה נוספת של ביציות. לאחר הניתוק, העבירו את העוברים לצלחת פטרי מצופה ארוס.

הסר את העוברים מהצלחת המצופה פוליליזין במידת האפשר. לפני שלב שני התאים. בשלב של שני תאים עד ארבעה תאים, בחר עוברים שהוזרקו בהצלחה בעזרת טווח חיתוך פלואורסצנטי.

עם מסנן DSR, הזרקה מוצלחת מסומנת על ידי מורפולוגיה רגילה המציגה אות פלואורסצנטי אדום שמקורו בפנול. שמור את העוברים וסונן SW בצלחות פטרי מצופות אגרוס ב-19 מעלות צלזיוס עד לשלב הרצוי להדמיה in vivo, תמונות מייצגות אלה של עוברי ברונכוס סטומה לנצ'יה לאטו צולמו לאחר הזרקת מיקרו של mRNAs וציפוי חלבונים פלואורסצנטיים. תמונה ראשונה זו מראה כי ניתן לזהות ביטוי של EGFP גרעיני המתקבל על ידי מיקרו-הזרקה של מבנה B-E-G-F-P H-2 בעוברים כבר בשלב 16 התאים.

עובר זה בשלב גסטרו הוא דוגמה לביטוי משותף בכל מקום של EGFP ממוקד דובדבן גרעיני וממברנה. האות הגרעיני נובע ממיקרו-הזרקה של מבנה דובדבן H שני BM בעוד שהפלואורסצנטיות בקרומי התא מתקבלת על ידי הזרקת מיקרו של מבנה קופסת EEG FP CAAX. חתך אופטי של עובר זה בשלב גסטרו מראה כיצד גרעינים וקווי מתאר של תאים מודגשים בהתאמה על ידי mCherry ממוקד גרעיני ו-EGFP הקשור לממברנה.

ההדגמה החזותית של טכניקת מיקרו-הזרקה זו תתמוך בחוקרים בהתפתחות האבולוציונית של קהילת הביולוגיה כדי לשפר את הקיימות ולפתח גישות חדשות להדמיה אינדיבידואלית, מניפולציה ספציפית לגנים ויציבות ב-afi, מודל חשוב להבנת אבולוציה של בעלי חיים.