הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה
7 ביוני 2014
אנו מציגים שיטה של הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.
ההליך המוצג כאן מציג שיטה קלה להכנת שומנים נתמכים ב-MICA על ידי שכבות המתאימות להדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון מחקרי מעקב אחר מולקולה בודדת. משטח ה-MICA מוכן על ידי פיצול סנדוויץ' של יריעת MICA בודדת המודבקת בין שקופית מיקרוסקופ הזכוכית להחלקת הכיסוי באמצעות דבק אופטי שחשף משטח נציץ טרי שטוח ודק במיוחד. על ידי הרכבת תא פלסטיק קטן העשוי מכוס בקבוקון של מיליליטר וחצי, נפח שלפוחיות השומנים הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית יכול להיות נמוך עד 30 מיקרוליטר.
כצעד ראשון, קח את הגיליון הרב-שכבתי של MICA כפי שהוא מגיע מהספק וחתוך אותו במספריים לחתיכות קטנות יותר. עלון לשניים או שלושה עלעלים דקים יותר באמצעות להב סכין טרי. כעת נקה את הכיסוי ישן ביסודיות.
זה כרוך בהצבת כיסוי של 0.17 מילימטר. ישן בצנצנת אימונים מזכוכית בכל כיסוי. לישון בחריץ נפרד ולסוניקט בחומר ניקוי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
שוטפים את הכיסוי. ישן 10 עד 20 פעמים עם מים מיני מפתח ולייבש בפן עם זרם אוויר או חנקן. קח שקופית זכוכית מיקרוסקופ ונקה אותה במקום.
טיפה קטנה של כ-15 מיקרוליטר של ahe אופטי בעל צמיגות נמוכה על פיצוץ המיקרוסקופ ועל הגלובוס בעבר. חותכים את העלון על קופסת אור UV למספר דקות. השתמש בסקוטש כדי לקלף כמה שכבות של נציץ.
השכבות הראשונות יהיו מקוטעות, אז עשו זאת עד שתראו את השכבות המחוברות לסקוטש. הקלטת אחידה ומלאה. מכסים את הקלטת.
יש להניח טיפה של דבק אופטי בעל צמיגות גבוהה על משטח מיכה. ודא שאין שם בועות אוויר. יש להניח בעדינות את השינה הנקייה על הטיפה הפוגענית.
השתמש בפינצטה כדי להקיש בעדינות על הכוס כדי לפזר את האה. שוב, רפאו דבק באור UV למשך מספר דקות. השתמש בסכין כדי לפצל את הכריך המורכב מזכוכית.
החליקו את MICA וכסו את מצב השינה. ברוב המקרים, רק שכבה דקה מאוד של MICA תישאר דבוקה לשינה הכיסוי. השתמש במיקרוסקופ חיתוך כדי לבדוק את משטח ה-MICA שלך על ידי ביצוע שריטה קטנה עם קצה מחט או פינצטה.
אתה יכול בקלות לומר אם המשטח הוא למעשה נציץ, כאשר המשטח נשרט באופן אחיד, כמו כאן או על הדבק האופטי, כמו כאן שבו המשטח זוהר. קח מבקבוקון זכוכית של מיליליטר וחצי, הסר את מיכל הגז והדביק את הפקק למשטח MICA בעזרת לק. תן לזה להתייבש כמה דקות.
עכשיו אתה יכול להכין ליפיד דו-שכבתי לתיקון שומנים שכבה אחר שכבה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כאן. טיפה של 30 מיקרוליטר של שלפוחיות שומנים מונחת בתא מכסה הבקבוקון ותדגור למשך 60 דקות לפני שטיפת המאגר שלך. לאחר הכביסה הדגימה מוכנה להדמיה.
במקרה זה, הוא מותקן במחזיק מדגם בהתאמה אישית. ניתן לצפות בקלות במולקולות בודדות על משטח MICA מוכן כזה. כאן אנו משווים A-D-O-P-C לפי שכבה הנתמכת על זכוכית ונציץ.
שימו לב שסוג התנועה שונה באופן מהותי בין שני המשטחים הללו. הנתיב של מולקולות בודדות בצבעים בפאנלים הימניים מראה בבירור שהתנהגות הדיפוזיה ב-MICA שונה מזו שבזכוכית. עם זאת, אין הבדל משמעותי באיכות ההדמיה.
האריגה הממוצעת של הפונקציה הישרה בחצי עוצמה מקסימלית עבור 20 כתמים כמעט זהה עבור שני המצעים, מה שמצביע על כך שמשטח ה-MICA חדיר במלואו על ידי אור מבלי להכניס סטיות אופטיות ניכרות. בסך הכל, MSDS מראה הבדל ברור בהתנהגות הדיפוזיה. עם זאת, עבור כל מקרה, ניתן להבחין בשתי אוכלוסיות של חלקיקים המתפזרים בקצב שונה.
שני מקדמי דיפוזיה שונים, מהיר ואיטי, חולצו מהזנה מעריכית כפולה להסתברות מצטברת של תזוזה ריבועית. עבור דו-שכבת DOPC זו, שני רכיבי הדיפוזיה מהירים יותר על פני השטח של MICA, החלקיקים הנעים לאט ב-MICA איטיים פי 10 עד 20 מהמהיר. אוכלוסייה איטית על זכוכית, לעומת זאת, קרובה להיות חסרת תנועה כאן.
הראינו שסוג המשטח הזה עשוי לעשות הבדל בהתנהגות הדיפוזיה של שכבות דו-שכבתיות של שומנים. לפיכך, יש להיזהר כאשר משווים תוצאות בין מחקרים על שכבות דו-שכבתיות הנתמכות על מצעים שונים כגון MICA ושכבות הדמיית זכוכית על MICA היא בדרך כלל די קשה בגלל הכנה מסובכת שהראינו עם זאת, דרך פשוטה אך יעילה להכנת משטחים באיכות כה גבוהה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת שכבות ליפידיות כפולות נתמכות על מיקה, המתאימות למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. הטכניקה משפרת את השימושיות של המיקה, שטיפולה מאתגר בדרך כלל, על ידי הבטחת שיקוע אחיד וצמצום השימוש בחומרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- מיקה היא חומר שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי.
- היא נעשה בה שימוש לעיתים רחוקות בדימות בשל קשיי טיפול.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה דורשות משטחים יציבים ומוכנים היטב.
- השיטה שואפת לפשט את תהליך ההכנה עבור חוקרים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה להכנת שכבות ליפידיות דו-שכבתיות נתמכות על מיקה.
- הס坨 של דימוי ברזולוציה גבוהה, כולל מחקרים של מעקב אחר מולקולות בודדות.
- הפחתת כמות השכיות הליפידיות הדרושות ליצירת השכבה הדו-שכבתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת משטח מיקה על ידי פיצול של סנדוויץ' מיקה.
- שימוש בדבק אופטי כדי לחשוף משטח מיקה שטוח.
- בניית תא פלסטיק קטן להחלת וזיקולות ליפידיות.
- חיתוך וניקוי של לוחות מיקה ליצירת שכבה כפולה (bilayer) אופטימלית.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת שימוש בכמות קטנה של עד 30 µL של וזיקולות ליפידיות.
- תוצאה של משטח מיקה שטוח ורענן המתאים לדימוי.
- משפרת את נוחות הטיפול במיקה בסביבת המעבדה.
- משפרת את איכות השכבות הליפידיות הכפולות עבור יישומים של מיקרוסקופיה.
מסקנות
- השיטה המוצגת מפשטת את הכנתם של שכבות ליפידיות כפולות הנתמכות על מיקה.
- היא פותחת אפשרויות חדשות לטכניקות דימות ברזולוציה גבוהה.
- חוקרים יכולים להשיג תוצאות טובות יותר תוך צמצום בכמות החומרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למשקיעים ומנהלים
דימות אופטי ברזולוציה גבוהה של שכבות ליפידים דו-שכבתיות נתמכות (SLBs) הוא קריטי למחקרים מכניסטיים של דינמיקה של ממברנות, אינטראקציות בין תרופה לממברנה ותיקוף ביופיזי של מטרות. שיטה זו מאפשרת הכנה הדירה של SLBs הנתמכות על מיקה, ובכך היא מתגברת על שונות של תשתיות ומסייעת להשוואה ישירה בין תהליכי עבודה אופטיים לאלו המבוססים על AFM. גישה זו תומכת באמון ניבוי בבדיקות ממברנה ומחזקת את הרצף התרגומי בין שלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מדויקת של מטרות ומסלולים הקשורים לממברנה באמצעות דימוי ברזולוציה גבוהה.
- מפחית שונות הנגרמת מהסובסטרט, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית אמינה במחקרי ממברנה.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של אינטראקציות בין תרופה לממברנה או בין פפטיד לממברנה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק תשתיות SLB סטנדרטיות הניתנות לשחזור עבור בדיקות דיפוזיה ובדיקות כמותיות של מולקולה בודדת.
- תומך בהשוואתיות בין בדיקות בפלטפורמות אופטיות ובפלטפורמות AFM על ידי הרמוניזציה של תכונות התשתית.
- ממזער את צריכת הריאגנטים, ובכך מאפשר פיתוח בדיקות בר-קנה מידה וכלכלי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- משפר את ההתאמה של מודלי קרומים in vitro עם נקודות קצה ביופיזיות ופרמקולוגיות.
- מאפשר המשכיות במדידות של תכונות קרומים משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של תרופיתים המכוונים לקרומים על ידי הפחתת עמימות ניסויית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו להכנת SLB נתמך על מיקה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין דימוי אופטי ברזולוציה גבוהה לבין אנליזה מבוססת AFM למחקר ממברנות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מכניסטי של תופעות הקשורות לממברנה.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות הניתנות לשחזור לסריקת תרכובות או פפטידים על SLBs.
- אנליטיקה: מאפשר הפקת מקדמי דיפוזיה וניתוח אוכלוסיות למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מתאימה מודלים של ממברנה in vitro לזרימות עבודה ביופיזיקליות ופרמקולוגיות המשך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול סטנדרטי להכנת תשתית לשימוש רב-פלטפורמי ובמספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ממברנה.
- ערך תפעולי: מייעל את הכנת הסובסטרט, משפר את השחזוריות ומפחית את צריכת החומרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת (go/no-go) תוכניות המכוונות לממברנה ותומך ביעילות הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים המקיימים אינטראקציה עם ממברנה לאורך כל שלבי הפיתוח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בטיפול במצעים וביישום דבק אופטי.
- נדרשת גישה לתשתית מיקרוסקופיה סטנדרטית ולציוד לפסילת UV.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת מצעים ולפרוטוקולי דימוי.
- ניתן להתאמה להרכבי ליפידים וסוגי וזיקולות שונים, כפי שנתמך בפרוטוקול.
- איכות פני השטח ועקביות ההכנה הן קריטיות לקבלת תוצאות כמותיות מהימנות.
