Name: הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: למדו הכנת מיכה נתמכת שכבות ליפידים לרזולוציה גבוהה במיקרוסקופיה אופטית. השיטה מאפשרת שימוש ב-30 מיקרוליטר בלבד של וסיקולות ליפידים ומפשטת את הטיפול במיכה לצורך מעקב מולקולות בודדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

יש הסופרים לא תודות.

1. מיכה ושקופיות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מס &#39;1 וחצי (0.17 מ&quot;מ) coverslips למדף מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate במשך 30 דקות בחומר ניקוי 2% ב60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 20 פעמים עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות באמצעות מלקחיים ומכה יבש באמצעות אוויר או חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים גיליון נציץ לתוך 10 x 10 מ&quot;מ חתיכות מרובעות באמצעות מספריים או סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל חתיכה נציץ לתוך 2-3 עלונים דקים באמצעות סכין גילוח. הערה: שלב זה דורש שימוש בסכין חד. </li></ol> 2. עצרת מיכה וקאמרי הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית נקייה מיקרוסקופית זכוכית עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלון דבק נציץ לחתוך בשלב 1.6 לשקופית זכוכית באמצעות דבק אופטי. דבק צמיגות נמוך מומלץ לפזר טוב יותר את הירידה ומדביק את המיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות. הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm ואנרגיה המומלצת requIRED לריפוי מלא הוא 4.5 J / 2 סנטימטר. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את משטח נציץ נקי על ידי הסרת כמה השכבות הראשונות עם סקוטש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה קטנה (~ 20 מיקרומטר) של דבק אופטי על גבי המשטח נציץ. הערה: בשלב זה, דבק צמיגות גבוה עם רמת autofluorescence הנמוכה מומלץ. הניסיון שלנו הראה כי שימוש בשילוב של נמוך (שלב 2.2) ודבקי צמיגות גבוהים מגביר את היעילות באופן משמעותי מפיצול נציץ (שלב 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות coverslip נוקה לאחרונה על הירידה של דבק, הימנעות בועות אוויר, בואו נתפשר על דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות. הערה: לאחר שלב זה, את הכריך של שקופיות זכוכית, נציץ וcoverslip ניתן לאחסן לתקופה ארוכה יחסי של זמן (עד מספר שבועות). להמשיך לשלב הבא ממש לפני הכנת SLB בפועל, כדי לוודא שהמשטח נציץ הוא טרי. הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm והאנרגיה המומלצת הנדרשת לריפוי מלא הוא 4.5J/cm 2. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין exacto, בעדינות לרדת מאופני coverslip משקופיות זכוכית הצד כפי שמוצג בסרטון. ברוב המקרים, שכבה דקה ושטוחה של נציץ תישאר מחוברת לcoverslip. מיכה מצורף לשקופית זכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר (חוזר מצעד 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות פני השטח על ידי עין בלתי מזוינת או תחת מיקרוסקופ לנתח, על מנת לוודא כי שכבה נציץ עדיין דבוקה לcoverslip ולא הוסרה לחלוטין במהלך הפיצול בשלב 2.8. מה שהופך את שריטה קטנה עם מלקחיים או לנתח מחט יעזור להבחין בין הדבק שבו יש עקביות שונה במובחן מיציץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את אטם גומי ממיליליטר בקבוקון כובע 1.5 ולהדביק את הכובע הפוך אל פני השטח באמצעות אופטידבק או לק, ולרפא עם מנורת UV, או שאוויר יבש 10 דקות, בהתאמה. הערה: אם המדגם הוא מוכן לבו זמנית אופטי (TIRFM או confocal) עם ההדמיה AFM, מיליליטר בקבוקון כובע 1.5 עשוי להיות קטן מדי כדי לעלות על ראש AFM על הבמה מיקרוסקופ. במקרה זה, הכובע עשוי להיות מוחלף על ידי כל O-טבעת פלסטיק בקוטר גדול יותר, מתאימה לראש AFM גובר. במקרה כאשר הניסוי דורש הסרת המכסה מבלי לפגוע במשטח נציץ, גריז סיליקון יכול לשמש במקום דבק או לק. </li></ol> 3. גיבוש נתמך יפידים bilayer (SLB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פתרון יפוזום מוכן טרי לתוך תא עם משטח. ההיקף המינימאלי הנדרש להיווצרות SLB הוא ~ 30 μl. הערה: לפרטים נוספים על יפוזום והיווצרות SLB, עיין בפרוטוקולים שפורסמו, כגון כגון התיק ואח&#39; 2014 15.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם היווצרות SLB באמצעות פרוטוקול רצוי. במהלך דגירה והדמיה, החדר יכול להיות ממוקם בחום לחסום או במה מיקרוסקופ מחוממת כדי לשמור דרושה כדי לשמור על השומנים בשימוש מעל לטמפרטורת ההתכה שלהם טמפרטורה. </li></ol>

<ol><li>Giocondi, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topography+of+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+analysis+of+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li>
<li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li>
<li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li>
<li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li>
<li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li>
<li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li>
<li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+supported+lipid+bilayer+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+a+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li>
<li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li>
<li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li>
<li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+supported+lipid+bilayers%3A+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li>
<li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li>
<li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence%2Fatomic+force+microscopy+studies+of+DPPC%2FdPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li>
<li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li>
<li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li>
<li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת משטחים נציץ חלקים ודקים לתצהיר bilayer שומנים והדמיה ברזולוציה גבוהה. הטכניקה דורשת מיומנויות ידניות מינימליות, מוגבלות בעיקר לפירוק זהיר של כריך הזכוכית נציץ זכוכית (שלב 2.8), שהוא קריטי לקבלת משטח נציץ באיכות גבוהה. בדיקה של נציץ ביקע טרי נדרשה תמיד, בשלב זה, שכן הוא מאפשר ליציץ להתנתק מהדבק האופטי ללא ביקוע, והשאירה את האזורים חשופים של דבק אופטי. שעלול לגרום לתצהיר לא רצוי של bilayer בדבק במקום במיקה. המשטח נציץ הוכן באמצעות השיטה המתוארת היא עם כמה...

המטרה הכללית של הפרוטוקול הנוכחי היא להראות שיטה להכנת משטחים נציץ להדמיה ברזולוציה גבוהה של שומנים בדם bilayers נציץ נתמך (SLBs) באמצעות מיקרוסקופ אופטי סך הקרינה ההשתקפות פנימית (TIRFM) או confocal, אשר יכול גם להיות משולב עם כוח אטומי מיקרוסקופ (AFM). SLBs הוא מודל המשמש באופן נרחב למחקרים רבים של אשכולות שומנים בדם, הפרדה פאזות, דינמיקה של מרכיבי bilayer או האינטראקציות שלהם עם פפטידים, חלבונים או תרכובות אחרות 1-5. מצעים שונים עשויים לשמש להיווצרות SLB (כלומר זכוכית, נציץ, דו תחמוצת הצורן, פולימרים), בהתאם לאופי של המחקר 4,6-8. מחקרי קרום אופייניים להסתמך על שיטות הדמיה המבוססת על מיקרוסקופיה, כגון TIRFM וAFM. לפיכך, להדמית TIRFM, משטח זכוכית הוא בחירה אופיינית בגלל הזכוכית היא שקופה. הכנת הזכוכית היא קלה יחסית, ואיכות התוצאות היא בעיקרנקבע על ידי פני השטח יסודיים ניקוי לפני התצהיר של שלפוחית ​​שומנים. AFM בשל הרזולוציה הגבוהה הצירית דורש משטחים נציץ. מיכה הוא מינרל סיליקט, עם קרוב ל מחשוף בסיס מושלם. לפיכך, נציץ ביקע הטרי הוא שטוח אטומי, המאפשר תצפית של הפרשי גובה קרום אפילו בקנה המידה תת ננומטר 9. מחקרי דיפוזיה תוך שימוש בשיטות כגון מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS), אחת מולקולת מעקב (SMT), והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) הראו עם זאת, כי דינמיקת הקרום השומני תלויה במידה רבה בסוג של משטח עליו הם מופקדים, לפיה זכוכית ותציץ יכול לתת תוצאות שונות באופן נרחב 10,11. הבדלים אלה כוללים לא רק את מקדמי דיפוזיה של בדיקות הקרום, אלא גם את זיהוי של אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים לשדר עם תעריפים שונים, ואולי גם מעבר בין מדינות שונות. כך,ההשוואה הישירה של תוצאות שהושגו תוך שימוש בטכניקות TIRFM וAFM היא לעתים קרובות בעייתית, אלא אם כן אותו המשטח (במקרה נציץ זה) משמש. אמנם יש כמה מחקרים שבם ההדמיה bilayer TIRFM וAFM נערכה על אותו המשטח נציץ 12,13, נציץ ומשמש רק לעתים נדירות למיקרוסקופיה אופטית, בעיקר בגלל בעיות טיפול. הכנה נציץ דורשת חיתוך ביד לעלונים דקים, אשר לאחר מכן מודבקים על coverslip באמצעות דבק אופטי 12. שיטת אולם זה דורשת קצת תרגול כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. יתר על כן, המשטחים שהושגו הם לעתים קרובות גליים ועבים, מה שהופך אותם קשה לשימוש עם מרחק עבודה נמוך, עדשות צמצם מספריות גבוהות. משטחי מיכה מוכנים כפי שתואר בפרוטוקול זה הם דקים מאוד (~ 220 מיקרומטר, כולל עובי coverslip של 170 מיקרומטר) ושטוח מאוד, הימנעות &quot;גלי&quot;, שהוא קריטי להדמיה ברזולוציה גבוהה מוצלחת. הם יכולים לשמשעבור setups TIRFM או confocal. יתר על כן, ניתן להעביר את אותו הדגימות לAFM, ואפילו צילמו בו זמנית עם TIRFM / confocal ו AFM. שילוב של שתי טכניקות אלו מאפשרת קשר ישיר של דיפוזיה התנהגות עם מבנה קרום bilayer 14. מכיוון שמשטחים נציץ הם ביקע טריים, שהם נקיים ואינם דורשים זמן רב, בצורה גרועה לשחזור, והליכי ניקוי שעלול להיות מסוכנים (פרוטוקולי ניקוי זכוכית בדרך כלל כוללים כימיקלים כגון פתרון Piranha, חומצה גופרתית, נתרן / אשלגן הידרוקסידי). הרכבה של חדר קטן, גם תואר בפרוטוקול, מפחית את עוצמת הקול של שלפוחית ​​הנדרשת להיווצרות bilayer יעילה פחות מ50 μl. לבסוף, את כל התהליך של הרכבה משטח הוא לא זמן רב (הכנה לוקחת פחות מ 30 דקות), ואינה דורשת רמה גבוהה של מיומנות ידנית, כפי שעושה מחשוף נציץ קונבנציונלי והדבקה.

<table><tbody><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 מ"מ - No H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (חומר ניקוי)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-1 Grade</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>דבק אופטי (גבוה צמיגות)</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>דבק אופטי (צמיגות נמוכה)</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>מנורת UV</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>המנורה הוגדרה ל-100% הספק</td></tr></tbody></table>

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

bilayers שומנים נתמך (SLBs) נמצא בשימוש נרחב כמודל ללימוד תכונות קרום (הפרדת פאזות, אשכולות, דינמיקה) והאינטראקציה שלה עם תרכובות אחרות, כגון תרופות או פפטידים. עם זאת מאפייני SLB שונים בהתאם לתמיכה בשימוש. טכניקות המשמשות בדרך כלל להדמית SLB ומדידות הן מיקרוסקופיה הקרינה מולקולה בודדת, FCS ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). מכיוון שרוב מחקרי הדמיה אופטיים מתבצעים על תמיכת זכוכית, תוך AFM דורש משטח שטוח מאוד (בדרך כלל נציץ), תוצאות של טכניקות אלה לא ניתן להשוות באופן ישיר, שכן המאפיינים של הטעינה והחלקות של חומרים אלו משפיעים במידה רבה דיפוזיה. למרבה הצער, ברמה הגבוהה של מיומנות ידנית הנדרשת לחיתוך והדבקת פרוסות דקות של נציץ לשקופית הזכוכית מציגה משוכת לשימוש השגרתי של נציץ להכנת SLB. למרות שזה יהיה שיטת הבחירה, נציץ והכין כזהמשטחים לעתים קרובות בסופו של דבר להיות לא אחיד (גלי) וקשה לתמונה, במיוחד עם מרחק עבודה קטן, עדשות צמצם מספריות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לשחזור להכנת משטחים נציץ דקים ושטוחים לתצהיר שלפוחית ​​שומנים בדם והכנת SLB. בנוסף, קאמרי המותאם אישית שלנו דורש כמויות קטנות מאוד של שלפוחית ​​להיווצרות SLB. התוצאות הכוללות ההליך בייצור יעיל, פשוט וזול של משטחי bilayer שומנים באיכות גבוהה, כי הם ישירות דומים לאלה המשמשים במחקרי AFM.

דיפוזיה ההתנהגות של בדיקות שומנים בדם ניאון בSLBs היא שונה בהתאם למצע. TIRFM בשילוב עם טכניקת SMT הוא שיטה יקר המאפשר הדמית תנועות חלקיקים וחילוץ מקדמי דיפוזיה שלהם. אותות מולקולה אחת של בדיקה Sphingomyelin-ATTO647N לשדר בdOPC bilayer (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) נתמך על זכוכית ואציץ מוצגים במצורפת דמות אנימציה. המשטח נציץ נערך על פי הפרוטוקול שהוצג כאן. כדי להעריך עיוותים אופטיות, רוחב מלא במחצית המרבית (FWHM) נמדד ובממוצע לכל פונקצית 20 נקודת התפשטות (כוחו...

אנו מציגים שיטה של ​​הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

ההליך המוצג כאן מציג שיטה קלה להכנת שומנים נתמכים ב-MICA על ידי שכבות המתאימות להדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון מחקרי מעקב אחר מולקולה בודדת. משטח ה-MICA מוכן על ידי פיצול סנדוויץ' של יריעת MICA בודדת המודבקת בין שקופית מיקרוסקופ הזכוכית להחלקת הכיסוי באמצעות דבק אופטי שחשף משטח נציץ טרי שטוח ודק במיוחד. על ידי הרכבת תא פלסטיק קטן העשוי מכוס בקבוקון של מיליליטר וחצי, נפח שלפוחיות השומנים הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית יכול להיות נמוך עד 30 מיקרוליטר.כצעד ראשון, קח את הגיליון הרב-שכבתי של MICA כפי שהוא מגיע מהספק וחתוך אותו במספריים לחתיכות קטנות יותר. עלון לשניים או שלושה עלעלים דקים יותר באמצעות להב סכין טרי. כעת נקה את הכיסוי ישן ביסודיות.זה כרוך בהצבת כיסוי של 0.17 מילימטר. ישן בצנצנת אימונים מזכוכית בכל כיסוי. לישון בחריץ נפרד ולסוניקט בחומר ניקוי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.שוטפים את הכיסוי. ישן 10 עד 20 פעמים עם מים מיני מפתח ולייבש בפן עם זרם אוויר או חנקן. קח שקופית זכוכית מיקרוסקופ ונקה אותה במקום.טיפה קטנה של כ-15 מיקרוליטר של ahe אופטי בעל צמיגות נמוכה על פיצוץ המיקרוסקופ ועל הגלובוס בעבר. חותכים את העלון על קופסת אור UV למספר דקות. השתמש בסקוטש כדי לקלף כמה שכבות של נציץ.השכבות הראשונות יהיו מקוטעות, אז עשו זאת עד שתראו את השכבות המחוברות לסקוטש. הקלטת אחידה ומלא

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לחקירת ארגון ספטין על שכבה דו-שכבתית ליפידית הנתמכת בזכוכית במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת.

בדיקת דו-שכבתית ליפידית נתמכת מישורית: טכניקת מבחנה מבוססת מיקרוסקופיה לחקר הרכבת ספטין על חיקויי קרום ביולוגי

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית ​​שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונים.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למדו הכנת מיכה נתמכת שכבות ליפידים לרזולוציה גבוהה במיקרוסקופיה אופטית. השיטה מאפשרת שימוש ב-30 מיקרוליטר בלבד של וסיקולות ליפידים ומפשטת את הטיפול במיכה לצורך מעקב מולקולות בודדות.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

גלה סרטונים נוספים