יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את העיצוב מחדש של המערכת הליזוזומלית הסופית על ידי חיידקים תוך-תאיים באמצעות ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים כעוקבים. זה מושג על ידי זריעה ראשונה של תאי הילה במגלשה של שמונה בארות ודגירה שלהם למשך הלילה. השלב השני הוא להדביק את התאים בסלמונלה וטריקה.

לאחר מכן, תיוג מרדף דופק של תאים מארחים נגועים מבוצע על ידי דגירה עם ננו-חלקיקי זהב BSA Rumine. השלב האחרון הוא לצפות בשינויים במערכת האנדוזומלית של התא המארח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, כימות ההתפלגות התוך תאית של ננו-חלקיקים מתבצע באמצעות חבילת התוכנה MRS.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופי חיסוני, הוא ש-n תאים נגועים מנותחים בשיטה, יכולים לספק תובנה לגבי אורח החיים התוך-תאי של טריקה. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם על פתוגנים תוך-תאיים אחרים כגון מיני גאיה, אלה פרוליה או מיקובקטריום טוברקולוזיס. זה עשוי להיות מיושם גם על סוגי תאים מארחים אחרים כגון מיקרו פה, קווי תאים או תאים ראשוניים.

הסינתזה של ננו-חלקיקי זהב 10 ננומטר או NPS דורשת שני פתרונות פתרון A ותמיסה B.To הכנת תמיסה A, להוסיף שני מיליליטר של כלוריד זהב מימי 1% ל-160 מיליליטר מים של מילי Q. הכן את תמיסה B על ידי הוספת שמונה מיליליטר של 1% טריסודיום ציטראט דיהידרט, ו -160 מיקרוליטר של 1% חומצה טאנית ל -32 מיליליטר של מילי Q מים. מחממים תמיסות A ו-B ל-60 מעלות צלזיוס ואז מערבבים אותם תוך כדי ערבוב.

יש להקפיד על צבע כחול כהה מיד לאחר כרבע שעה. התמיסה צריכה להיות בצבע אדום בשלב זה. מחממים את התמיסה ל 95 מעלות צלזיוס.

שמור אותו על 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן קרר את התמיסה לטמפרטורת החדר. הכן את חתיכת הזהב לציפוי ותיוג על ידי הוספת 900 מיקרוליטר MPS זהב לצינור עינור של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב -15, 000 גרם למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-900 מיקרוליטר של מי MQ מעוקרים.

מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת BSA ומערבבים על מערבולת ב-800 סל"ד למשך 30 דקות. הסר עודפי BSA על ידי צנטריפוגה של התכשיר בחום של 15, 000 גרם למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הזהב BSA NPS ו-125 מיקרוליטר PBS.

הוסף 12.5 מיקרוליטר של ביקרבונט טוחנת אחת. תמיסת R domine n hydroxy CIN ester או NHS מוכנה ב-DMSO מיד לפני. השתמש ב-15 מיקרוליטר של תמיסת R DOMINE N-H-S-D-M-S-O עד 0.5 מיליליטר של מתלה BSA NP זהב.

דגרו את התגובה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך ערבוב ב-800 סל"ד והימנעות מחשיפה לאור. לאחר מכן, טהר את זהב BSA רומין NPS באמצעות דיאליזה נגד PBS בארבע מעלות צלזיוס עם חמישה שינויי חיץ לאורך תקופה של 36 עד 48 שעות לאחר הטיהור, ייצב את ה-NPS על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של B-S-A-P-B-S לכל מיליליטר אחד של זהב BSA RUMINE NPS כדי להסיר את צנטריפוגת BSA Rumine החופשית או המשוחררת ב-15, 000 GS למשך 16 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resus השעו את הגלולה בשני מיליגרם למיליליטר של B-S-A-P-B-S לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-520 ננומטר או OD 5 20.

אחסן את מוט הזהב BSA Domine NPS בארבע מעלות צלזיוס, הימנע מחשיפה לאור התאים לניסוי זה מבטאים לצמיתות חלבון פלואורסצנטי ירוק מתויג מנורת גליקופרוטאין ליזוזומלי GFP אחד ומתורבת ב-DMEM עם סרום עגל עוברי 10% ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני זרע התאים בצפיפות של 50, 000 לבאר במגלשה של שמונה בארות ודגירה למשך הלילה. החיידק לזיהום תאי הלה הוא הפתוגן האנושי במערכת העיכול, סלמונלה וטריקה. לשם השוואה, נעשה שימוש בשני זנים מוטנטיים.

כל שלושת הזנים מכילים פלסמיד לביטוי מכונן של GFP משופר והם מתורבתים במרק LB עם האנטיביוטיקה המתאימה לשמירה על הפלסמידים לכל זן. יש לחסן מושבה אחת של חיידקים בשלושה מיליליטר של מרק LB באנטיביוטיקה המתאימה ולגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתנאי טלטול לאוורור למחרת, יש לדלל כל תרבית מאחד עד 31 במרק LB טרי ולהמשיך לגדל במשך שלוש וחצי שעות.

כדי להתחיל בהליך זה, מדוד את ה-OD 600 של חיידקי תת-התרבות ודלל ל-OD 600 של 0.2. במיליליטר אחד של PBS, הוסף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי הלה בשקופית התא A 12 כדי להשיג ריבוי זיהום של 100. דגירה למשך 30 דקות בחממת התאים.

שטפו את תאי ההלה שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר חיידקים לא מופנמים. נקודת זמן זו מוגדרת כשעת אפס לאחר ההדבקה או שעת אפס פאי. מוסיפים לתאים 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין ושומרים למשך שעה.

אחרי שעה. החלף את המדיום במדיום הדמיה המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין. הוסף NPS רומין BSA זהב לתאי הלה כדי לקבל ריכוז סופי של OD 5 20 מתוך 0.1.

דגירה למשך שעה לאחר שעה. הסר את המדיום ושטוף שלוש פעמים עם PBS. לבסוף, הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין.

בשאר זמן הדגירה, הדמיה ברזולוציה גבוהה של התאים בנקודות זמן שונות מתבצעת באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית כגון סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופ דיסק מסתובב עם תא סביבה לחה הפעל את מערכת בקרת הטמפרטורה והמתן עד שהיא מתייצבת. מטב את הגדרות ההדמיה כגון סריקת ההגדלה, רזולוציית המהירות וגודל צעד Z. השתמש בהגדרות פליטת עירור מתאימות עבור GFP ו-NPS רומין BSA זהב בנקודות זמן מצוינות לאחר ההדבקה.

הרכיב את שקופית A 12 חדרים המכילה תאים נגועים על במת המיקרוסקופ והקלט תמונות כדי לנתח את התמונות ולחקור את העיצוב מחדש של המערכת האנדוזומלית על ידי סלמונלה תוך תאית. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות. פתח את הנתונים על-ידי לחיצה על פתח ובחירת הקובץ בסרגל הכלים אובייקטים של התצוגה העודפת.

לחץ על הסמל כדי להוסיף פריט משטח חדש. כדי לנתח אזור עניין או החזר על השקעה, בחר/י פלח אזור עניין בלבד ולאחר מכן לחץ/י על ״הבא״ כערוץ מקור. בחר ערוץ שלישי.

סמן את האפשרות החלקה כדי להגדיר את החלקות של האזור שנוצר. הגדר ערך באופן ידני או קבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. לסף.

בחר באפשרות העוצמה המוחלטת להתאמת הסף. בחר באפשרות הידנית והגדר ערך באזור התצוגה. תצוגה מקדימה של סף פני השטח מוצגת באפור.

לחץ על הבא בכרטיסייה מסווג משטחים. ניתן לסנן את המשטח המתקבל לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא מספר חורי V גדול מ-10 מסננים אחרים שניתן לכלול גם על ידי לחיצה על הוסף.

בדוגמה זו, מסנן ברירת המחדל משמש להשלמת יצירת פני השטח. לחץ על סיום ברשימת האובייקטים. בטל את סימון התיבה עבור נפח הפריט.

משטח חדש שנוצר מוצג כעת באזור התצוגה. באדום, ייצא את הנתונים הסטטיסטיים לקובץ Excel על-ידי לחיצה על שמור. ה-NPS הזהב שסונתז על ידי פרוטוקול זה היה בצורת כדור ובגודל של כ-10 ננומטר.

ציפוי BSA ותיוג rho domine לא השפיעו על המורפולוגיה או הגודל שלהם. לחקור שיפוץ של המערכת האנדוזומלית התאית המארחת על ידי סלמונלה תוך-תאית. תאי הלה נדבקו או נדבקו בסלמונלה מסוג בר או שני זנים מוטנטיים ודופק נרדף עם זהב 10 ננומטר.

מוט BSA דומין n אפונה בתאים לא נגועים, ה- NPS מופץ באופן אחיד באנדוזומים מאוחרים או ליזוזומים. לעומת זאת, ה-NPS בתאים נגועים בסלמונלה מסוג בר אורגן מחדש ברובו שמונה שעות לאחר ההדבקה. נוצרה רשת מיוצבת של חוטים או מסננים המושרים על ידי סלמונלה, ורוב ה-mps נמצאו מצטברים בתוך המבנים הצינוריים.

הזנים המוטנטיים הפגינו התנהגויות מובהקות שמונה שעות לאחר ההדבקה. הזן המוטנטי SSAV היה כלוא בתוך הסלמונלה המכילה VAE או SCV. אמנם לא נוצרו ניפויים, אך רוב ה-mps עדיין היו ממוקמים באנדוזומים מאוחרים חופשיים או בליזוזומים עבור ה-sif.

בריחת זן מוטנטי של סלמונלה לתוך הציטופלזמה התרחשה ולא נצפה קשר בין NPS לחיידקים. כאשר נבדקה נגישות המערכת הליזוזומלית הסופית בשלבים שונים של זיהום בסלמונלה, התוצאות מראות כי בכל המקרים, רוב ה-NPS המופנם הצטבר ב-SCV או ב-SIFs בעקבות הליך זה. בשיטות אחרות, ניתן לבצע העברת צוואר מיקרוסקופית.

זה עשוי לענות על שאלות נוספות כמו מבנה אולטרה או תאי ממברנה בחלק מתאי המארח הנגועים בננו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים. ניתן להשתמש בהם כדי לתייג תאי מארח ששונו על ידי סלמונלה תוך תאית.