Name: פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למדו הכנת פרוסות מוח אקוטיות בטמפרטורה פיזיולוגית ללא צורך בשינויים מיוחדים או הדחיית דם תוך-לבית. שיטה זו מפשטת את התהליך ומייצרת תוצאות איכותיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר בתרומה המשמעותית של ד"ר שיווי הואנג (האוניברסיטה הלאומית של אוסטרליה) באימות השיטה. יתר על כן, אנו רוצים להודות לגב' Kasia Pietrajtis על ההערות המועילות לגבי תאי גולגי ולמר ויטלי לרנר על נתוני הניסוי בקליפת המוח. עבודה זו נתמכה על ידי PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC ו-ISF.

כל הליכי הניסוי שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה בעברית ובועדת השימוש. 1. הכנת הפתרונות וכלים לחיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של פתרון פיסיולוגי סטנדרטי (SPS) המכיל את היונים שמתוארים בטבלה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות המכיל מלחים בשעה 10 פעמים את הריכוז הסופי מראש בבקבוק זכוכית אחסון מלא 1,000 מיליליטר של מים ללא יונים (מוליכות של 0.055 מייקרו-שני / סנטימטר). להוסיף מלח (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, וMgSO 4), ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פתרון SPS הסופי ביום של הניסוי. הוספה של פתרון המניות 100 מיליליטר ל -700 מיליליטר של מים מטוהרים, לפזר את גלוקוז (3.6 גר &#39;) וNaHCO 3 (ז 2.18) באמצעות סרגל מערבבים מגנטי ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן solutiבגז אותו עם 95% O 2/5% CO 2 ~ 20 דקות. אחרי זה, להוסיף 2 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הכלים הבאים (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספריים גדולים או כלי אחר לעריפת הראש, מספריים כירורגיות קטנים לפתיחת הגולגולת, מלקחיים טיפ נאה להרמת הגולגולת לחשוף את המוח, באזמל עם להב ללנתח את החלק הרצוי של המוח להיות פרוס ומרית קטנה לטיפול ב חלקי מוח גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, להכין חתיכות קטנות של נייר סינון להסרת נוזלי עודפים מהמוח, שתי צלחות פטרי קטנות למוח להיות גזורים בשתי זכוכית 500 מיליליטר כוסות לחממו מים המכילים מטוהרים וSPS, ודבק cyanoacrylate הדבקת המוח שלב חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מברשת קטנה לטיפול בפרוסות במהלך החיתוך ופיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחב להעברת פרוסות מאמבטית החיתוך לצ&#39;ה ההתאוששותmber. לחטא את הכלים כדי למנוע צמיחת חיידקים באמבטיות פרוסה החמה. יתר על כן, להשתמש בכפפות מעבדה נקיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חדר התאוששות הפרוסה שקוע כזה כפי שתואר על ידי גיב ו -15 אדוארדס. ברציפות בגז SPS בו עם 95% O 2/5% CO 2 ולשמור על 36 מעלות צלזיוס. ודא כי להמתה בגז אינו מביא לבועות קטנות שנלכדו באמבטיה שיכולה לגרום נזק לפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם ~ 300 מיליליטר של SPS 36 ° C על צלחת חימום עם בוחש מגנטי או באמבט מים. אם נעשה שימוש בצלחת חימום, לטפל כדי למנוע את הפתרון מהתחממות יתר, שעלול לגרום למשקעי יון. במקרה זה קורה, SPS חם וטרי במקום הקירור הישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא ~ 500 מיליליטר של מים מטוהרים לרתיחה תוך שימוש בקומקום חשמלי ו, בכוס, לשלב 300 מיליליטר שלו במים קרירים כדי לקבל מים מעט חמים יותר מטמפרטורת החיתוך. השתמש בזה חימם מים מטוהרים בעריפת הראש ולהשתמש במאהלרנינג של המים רתוחים מאוחר יותר לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של האמבטיה החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר על ידי הזרקת 0.1 מיליליטר של pentobarbital (60 מ&quot;ג / מיליליטר) intraperitoneally. אחרי כמה דקות לבדוק שבעלי החיים אינם מגיבים לצובט הבוהן או זנב חזק כדי לברר את חוסר התחושה. </li></ol> 2. ביתור המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכבר במהירות על ידי חיתוך הצוואר עם המספריים הגדולים ליד החלק האחורי של הגולגולת, ולתת לראש ליפול לתוך הכוס עם מים מטוהרים חיממו כדי לשטוף את הדם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את מגנום foramen בגולגולת מתחת לשרירי הצוואר והעור, אולי הסרת יותר של הצוואר עם המספריים הקטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העור בחלק העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל לראות בבירור את תפרי גולגולת על מנת להנחות את הפתיחה של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגולגולת הפתוחה על ידי החדרת הקצה התחתון של המספריים הקטנים דרך מגנום foramen ומייד להפוך אותם לכיווןהצד לרוחב. לחתוך בעדינות לאורך הקצה הלטרלי של העצם הקודקודית עד מיקום מאחורי העיניים ותפר frontoparietal; אז, פונה לכיוון מרכז הגולגולת וחצתה את קו האמצע לצד השני של הגולגולת האחר (ראה קו מקווקו ירוק באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים טיפ נאה, להרים את הגולגולת מפינת frontoparietal ולמשוך באלכסון אותו וsidewards לחשוף את המוח (ראה חץ מקווקו צהוב באיור 2 א). ודא כי הגולגולת אינה מחוברת לשום עצם או עור של הראש, כדי שהמוח יישאר במקום שבו הגולגולת היא הרימה. במקרה שהמוח נע בגולגולת, להשתמש במספריים הקטנים כדי להסיר את כל רקמת חיבור בין הגולגולת והמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המוח חשוף, לא מאפשר למוח להיות יבש. כך, בצע את השלבים הבאים תוך שמירה על הגולגולת והמוח בצלחת פטרי מלאה חימם, הומתו בגז SPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את חלק במוח המשמש לדוארxperiment משאר המוח באמצעות אזמל ומרית. במקרה של שימוש במוח הקטן, להתנתק מהמוח הקדמי על ידי חתך אחד דרך המוח התיכון וגשר המוח (קווים אדומים באיורים 2B-D) ולהעביר אותה לצלחת פטרי קטנה המכילה טרי, הומתו בגז SPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גזע המוח כדי ליצור בסיס ישר ורחב להדבקת המוח לחיתוך שלב שבו חותך את המוח הקטן במישור אופקי. בקצרה למקם המוח הקטן על פיסת נייר סינון רטובה כל כך שהצד שנחתך מהמוח הקדמי פונה כלפי מטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גזע המוח עם אזמל כדי ליצור את הבסיס (כפי שצוין בקו הכחול בתרשים 2B), ולהחזיר את המוח הקטן לSPS. כאשר מטוסים אחרים של חיתוך יש צורך, לקצץ את בלוק המוח הקטן בהתאם (קווים כחולים בתרשימים 2C &amp; D). </li></ol></li></ol> 3. חותך את המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שלב הגזירה על ידי בירור שהוא הייתר&quot;י, לפני יישום טיפה קטנה של דבק מגע באמצע השלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את בלוק המוח מSPS בעזרת מרית עם צד עד נכון, ולהסיר את נוזלי עודפים מהמוח באמצעות חתיכות קטנות של נייר סינון. ואז, בתנועה אחת, חלק את המוח מהמרית על טיפת הדבק על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את המוח מייבוש והדבק בריצה בצידי הרקמות, להחיל כמה טיפות של SPS עם פיפטה פסטר והנח את שלב החיתוך בתא החיתוך. יישר את בלוק המוח כך שהאזורים של עניין (למשל, קליפת מוח) מתמודדים עם הלהב ובכך יהיה כפוף לכמות מינימאלית של לחץ מכאני לפני שנחתכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל פרוסה על פי הוראות היצרן ואילו בגז כל הזמן SPS בתא החיתוך, כמו גם שמירה על הטמפרטורה ב34-37 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה של חדר החיתוך בטווח זה על ידי מילוי externתא אל של מבצעה עם חיממו מים מטוהרים והחלפת המים בכל פעם שהטמפרטורה יורדת נמוכה מדי. הערה: הפרמטרים החיתוך יש למצוא באופן ניסיוני עבור כל סוג של רקמה ותאי עצב שנבחנים. במקרה של מבצעה קמפדן SMZ 700 עם להבי קרמיקה ותאי Golgi המוח הקטן, להשתמש במשרעת תנודה 0.75 מ&quot;מ על 65 הרץ וקידום מהיר של 0.05 מ&quot;מ / שנייה; למשרעת נוירונים גרעיניים המוח הקטן יותר ותדירות (1 מ&quot;מ ו -90 הרץ, בהתאמה), ומהירות איטית יותר מראש (.01-0.02 מ&quot;מ / שנייה) מומלצים. עבור שני Golgi ונוירונים גרעיניים המוח הקטן, עובי פרוסה צריך להיות 300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך החיתוך, אינו מאפשר את הפרוסות לקפל על עצמם. למנוע את זה בעדינות על ידי תמיכתם במברשת רכה, רצוי לגעת בפרוסה רק באזורים שאינם בעלי עניין לניסוי. לטפל כדי למנוע את המברשת מלגעת בלהב vibratome; במיוחד במקרה של להבי הקרמיקה אפילו מגע, אורעלול לגרום נזק ללהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל פרוסה מתא החיתוך להתאוששות / מחזיק תא באמצעות פיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחבה, אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו פרוסות לנוח בחדר במשך שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. זה מאפשר פירוק של רקמות ותאים פגומים או למות ובכך גורם למשטח פרוסה נקי. במהלך השעה הראשונה, לשמור על הטמפרטורה של SPS בתא בטווח של 34-36 C °; להבטיח שהפרוסות אינן נוגעות בבועות אוויר שעלול לגרום נזק לפרוסות או לגרום להם לצוף. </li></ol> ניסוי 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, תן טמפרטורת חדר ההתאוששות להתקרר לRT (C ° 17-25). הערה: פעולה זו עשויה להאריך את משך הזמן שבמהלכו את הפרוסות ניתן להשתמש על ידי האטה של ​​הצמיחה של חיידקים, כמו גם חילוף חומרים בתאים. תקופה זו תלויה באזור במוח וסוג התא. לדוגמא, ניתן למצוא סוגים מסוימים של תאי Golgi להיות בריאים בפרוסות8 שעות לאחר החיתוך ואילו סוגים אחרים יימשכו רק 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 עברה מהחיתוך, להשתמש בפרוסות לניסויי אלקטרו שונים. </li></ol>

<ol><li>Skrede, K., Westgaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35, 589-593 (1971).</li>
<li>Aghajanian, G., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Gueritaud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+of+rat+ocular+motoneurons+recorded+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro.</a> Neuroscience. 24, 837-852 (1988).</li>
<li>Lipton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+best+of+brain+slices%3A+comparing+preparative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Making the best of brain slices: comparing preparative methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).</li>
<li>Richerson, G., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).</li>
<li>Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+inhibits+edema+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ascorbate inhibits edema in brain slices.</a> Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).</li>
<li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+techniques+applied+to+brain+slices.+In%3A+Patch-clamp+analysis%3A+advanced+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Springer%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques.</a> Springer. , 135-193 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type%E2%80%93specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
<li>Huang, S., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+temperature+during+brain+slicing+enhances+the+quality+of+acute+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).</li>
<li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principle+of+temperature-dependent+gating+in+cold-+and+heat-sensitive+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels.</a> Nature. 430, 748-754 (2004).</li>
<li>Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+currents+in+rat+thalamocortical+relay+neurones%3A+kinetic+properties+of+the+transient%2C+low-threshold+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current.</a> The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).</li>
<li>Gibb, A. J., Edward, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+cells+in+slice+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectrode+Techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from cells in slice tissues.</a> Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).</li>
<li>Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+Inhibitory+Input+to+the+Inferior+Olive+Decreases+Electrical+Coupling+and+Blocks+Subthreshold+Oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations.</a> Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).</li>
<li>Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+disappear+with+chilling+but+proliferate+excessively+upon+rewarming+of+mature+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus.</a> Neuroscience. 127, 69-80 (2004).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו מדגימים שיטה להכנת פרוסות מוח חריפות מעכברים בפיסיולוגיים במקום טמפרטורה קרה כקרח. הוכח 11 שאיכות פרוסות שהושגו בתנאים חמים היא מעולה כאשר בהשוואה לאלו שהוכנו בתנאים קרים, ובלבד שיש לו את להב מבצע רטט אנכי מינימאלי. חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית עשוי למנוע חפצים פיסיולוגיים הנגרמים על ידי הטמפרטורה הנמוכה, כגון אלה הקשורים לשינויים בתהליכי חילוף חומרים 17-19 שיכול להתבטא בסטיות של תא בודד, ...

מטרת השיטה המוצגת היא להשיג פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה עבור בניסויים במבחנה אלקטרו, במיוחד בעת שימוש במבוגרים או אפילו בעלי חיים ישנים. שיטת חיתוך המוח החריפה, כפי שתוארה על ידי Skrede ו1 Westgaard בשני משפטים אלגנטיים, הפכה לאחד מעמודי התווך של מחקר במדעי המוח מודרני ומועסקת בוריאציות אין ספור ברחבי העולם. האיכות של הפרוסות באו לידי ביטוי במספר של חיים נוירונים לכל פרוסה, פרק זמן שבמהלכו התאים ממשיך תכונות אלקטרו והצורניות שלהם, כמו גם בשלמות הרקמה. יתר על כן, משך הזמן המקסימאלי להקלטות יציבים תלוי באיכות של הפרוסות. כך, לאורך עשרות השנים, שיטת החיתוך המקורית פותחה עוד יותר על ידי קבוצות מחקר בודדות כדי לשפר את ההתאוששות פרוסה לאחר חיתוך 2-10, לעתים קרובות על ידי שינויים מורכבים של הרכב חיתוך oפתרונות התאוששות r (כגון הוספת ascorbate, thiourea או אפילו H 2 O 2), כמו גם מראש זלוף תוך לבו של בעל החיים עם פתרונות פיסיולוגיים מקוררים. כפי שהראה 11 לאחרונה, נראה טמפרטורה פיזיולוגית במהלך החיתוך להיות מועיל יותר מאשר קירור לבריאות עצבית; השיפור בולט ביותר בעבודה עם מבוגרים מכרסמים (2-8 חודש). הימנעות שינויי טמפרטורה דרמטיות מונעת חפצים בשל תהליכי טמפרטורה תלויה בתוך התאים, כגון קינטיקה פלסטיות 13 ויון-ערוצי 13,14. שינויים כאלה יכולים להשפיע על מתח קרום ואיתות סידן תוך תאי, סף ספייק, וספייק צורה. השיטה &quot;החמה&quot; פרוסה חריפה ההכנה שהוצגה כאן היא נוהל כללי לקבלת פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה מכל אזור במוח, כולל המוח הקטן, קליפת המוח וההיפוקמפוס, גזע המוח גרעיני 16 &lt;/ Sup&gt; כמו גם את הנורה חוש הריח, הן בחולדות ועכברים. יש לציין, הליך חיתוך הטמפרטורה הפיזיולוגי דורש כי להב החיתוך רוטט כמעט בצורה מושלמת בצורה אופקית, והוא ללא כל פגמים מבניים. הדיוק הזה לא יכול להיות בר-השגה עם מודלים מבצעה מבוגרים; במקרים כאלה, אנו ממליצים על ביצוע הכנת פרוסה בתנאים קר כקרח כנראית בטמפרטורה הנמוכה על מנת להפוך את הרקמה עמידה יותר בפני נזק מכאני, גם אם במחיר של סטיות מטבולים.

<table><tbody><tr><td>פנטוברביטל</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>ריכוז: 60 מ"ג/מ"ל במי מלח פיזיולוגיים.</td></tr><tr><td>מספריים גדולים&nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>ניתן להשתמש בכל מספריים גדולים או גיליוטינה עם קצוות חדים מספיק לעריפת ראש&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים&nbsp;</td><td>יוקרה רפואית</td><td>48,148</td><td>ניתן להשתמש בכל מספריים עם קצה עדין, בתנאי שלהבי המספריים אינם ארוכים מ- 1.5 & # 8211; 2 ס"מ</td></tr><tr><td>מלקחיים עם קצה עדין&nbsp;</td><td>אזמל FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>מרית קטנה&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>נייר</td><td></td><td></td> סינון <td>ניתן להשתמש בכל מותג מעבדה.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>כוסות זכוכית&nbsp;</td><td>שוט</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר&nbsp;</td><td>מותג עלי מייפל</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>דבק סופר&nbsp;</td><td>LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td>פורס</td><td>קמפדן</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>להב חיתוך קרמי</td><td>קמפדן</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>מחמם/בוחש</td><td></td><td></td> מגנטי <td>לחימום ה-SPS להליך</td></tr><tr><td>קומקום</td><td></td><td></td> חשמלי <td>לחימום מים לבקרת טמפרטורה</td></tr><tr><td>תא התאוששות פרוסות + יחידת חימום</td><td>וורנר מכשירים</td><td>&nbsp; BSC-HT +&nbsp; </td><td>ניתן להשתמש גם בדגמים ביתיים</td> של BSC-BUW.</tr><tr><td>מדחום</td><td></td><td></td><td>לניטור טמפרטורת SPS במהלך חיתוך וחיתוך</td></tr></tbody></table>

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה של פרוסות מוח חריפות. הליך זה הוא אלמנט קריטי עבור ניסויי תיקון- clamp אלקטרו שקובע במידה רבה את איכות תוצאות. הוכח כי השמטת צעד הקירור במהלך חיתוך הליך היא בהשגת פרוסות ותאים בריאים, במיוחד כאשר התמודדות עם מבנים מוחיים myelinated מאוד מבעלי חיים בוגרים. למרות שהמנגנון המדויק שבו טמפרטורה גבוהה תומכת בבריאות עצבית ניתן השקיעה רק על, זה מתקבל על הדעת כי, במידת האפשר, את הטמפרטורה שבה החיתוך מבוצע צריכה להיות קרובה למצבים פיסיולוגיים כדי למנוע חפצים הקשורים בטמפרטורה. יתרון חשוב נוסף של שיטה זו הוא הפשטות של ההליך ולכן זמן הכנה הקצר. בשיטה הוכיחה עכברים בוגרים משמשים אך את אותו ההליך יכול להיות מיושם עם עכברים צעירים כמו גם חולדות. כמו כן, CL התיקון הבאניסוי המגבר מתבצע על פרוסות המוח הקטן אופקיים, אלא גם באותו ההליך ניתן להשתמש במטוסים אחרים, כמו גם אזורים האחוריים אחרים של המוח.

פרוסות מוכנות באופן המתואר יכולות לשמש לניסויי אלקטרו וoptogenetic שונים. באיור 3 א ו3C, אנחנו מראים דוגמא מייצגת של חתך אופקי המוח הקטן ופרוסה בקליפת המוח מוח העטרה, בהתאמה, שנצפה תחת התערבות ההפרש (DIC) אופטיקה. בפרוסת המוח הקטן, מספר סוגים של תאי עצב של המוח קטן יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי צורת הגוף ומיקום הסלולרי שלהם, המאפשרים ממוקד קלטות אלקטרו. באיור 3 ו3D, דוגמא עקבות מהקלטות תיקון- clamp כל התא במצב מהדק נוכחי מתא פעיל באופן ספונטני ...

במאמר זה אנו מציגים שיטה להכנת פרוסות מוח חריפות בטמפרטורה פיזיולוגית, תוך שימוש בתמיסה פיזיולוגית קונבנציונלית ללא שינויים מיוחדים לחיתוך (כגון הוספת סוכרוז) וללא זלוף תוך קרדיאלי של החיה לפני הכנת הפרוסה.

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה. זה מושג על ידי חילוץ המוח מהחיה. השלב השני הוא לנתח את אזור העניין במוח ולהצמיד אותו לשלב החיתוך תוך שמירה על לחות עם תמיסת חיתוך.לאחר מכן, המוח שקוע בתמיסת חיתוך טמפרטורה פיזיולוגית. השלב האחרון הוא חיתוך ויומי של המוח. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוסות בניסויים אלקטרופיזיולוגיים שונים במבחנה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חיתוך קר כקרח, הוא שזה פשוט יותר ומניב תוצאות מעולות. בדרך כלל, מי שחדש בשיטה זו יתקשה מכיוון שהיא דורשת שכל השלבים יתבצעו בצורה חלקה ומהירה ללא עיכובים מיותרים. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהיינו צריכים להשיג פרוסות גרעיניות מוחיות באיכות גבוהה מחיות בוגרות.השיטה תודגם על ידי לה אנרי, סטודנט במעבדה שלנו לפני תחילת הליך זה. ודא שהכלי, הכלים והפתרונות מוכנים מראש. טבלה 1 מציגה את הרכב התמיסה הפיזיקלית הסטנדרטית או SPS שבה המוח ייחתך לאחר הכנת פתרון העבודה של SPS.על פי הפרוטוקול הכתוב, יש לאזן את התמיסה עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך 20 דקות, בעוד שיווי המשקל של ה-SPS מארגן את הכלים הנדרשים לחיתוך. איור זה מציג את סידורי הכלים המשמשים לחיתוך מוח ויכול לשמש כהתייחסות חזותית בעת הגדרת המפתח לזיהוי כל פריט כלול בפרוטוקול הכתוב. לאחר השלמת שיווי המשקל של תמיסת העבודה SPS,

slice-it-hot-acute-adult-brain-slicing-in-physiological-temperature

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

אנו מציגים שיטת הקלטה אופטית ויציבה לפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. המאמר מתאר מכתים צבע רגיש מתח והקלטה של אותות אופטיים באמצעות הכנה היפוקמאל הפרוסות המקובלת.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

למדו הכנת פרוסות מוח אקוטיות בטמפרטורה פיזיולוגית ללא צורך בשינויים מיוחדים או הדחיית דם תוך-לבית. שיטה זו מפשטת את התהליך ומייצרת תוצאות איכותיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

גלה סרטונים נוספים