חזותי exocytosis ללא ממס של Neoformans קריפטוקוקוס מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין אקסוציטוזיס לא ליטי של קריפטוקוקוס נאופורמנס ממקרופאגים ראשוניים של נוירונים במח העצם. זה מושג על ידי ציפוי והדבקה ראשונים של מקרופאגים עצביים מופעלים בתאי פטרייה כדי לאפשר פגוציטוזיס והפנמה של קסאומין. השלב השני הוא הסרת תאי פטרייה חוץ-תאיים כדי להבטיח שכבה אחת ברורה של מקרופאגים נגועים ולא נגועים.

המקרופאגים הבאים מודגרים בתא מבוקר טמפרטורת פחמן דו חמצני ומתועדים במשך 24 שעות על מנת ללכוד מקרים של אקסוציטוזיס שאינו ליטי ואינטראקציות אחרות. השלב האחרון הוא ליצור סרט על ידי דחיסת כל הפריימים שנעשו בפרק זמן של 24 שעות. בסופו של דבר, הדמיית מקרופאגים עם מיקרוסקופ אור דיגיטלי משמשת להתבוננות במגוון סוגי האקסוציטוזיס הלא-ליטיים שמקרופאגים עוברים במהלך זיהום של 24 שעות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה של פתוגן מארח, כגון תזמון וכימות של אירועים תאיים ביום שלפני הניסוי, בחר מושבת מנהל עבודה בכיר אחת שגדלה על צלחת אגר סבארו וחסן 10 מיליליטר מרק סבארו. אפשר לתרבית לצמוח בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס, לרעוד במהירות של 250 סל"ד בעקבות המתת חסד של עכברים כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

עקר את כל הגוף עם 70% אלכוהול אתילי. הסר גם את עצם הירך וגם את השוקה והנח את העצמות בצמד סטרילי, מדיום נשר שונה או DMEM. לאחר מכן הסר עודפי רקמות ושרירים בעזרת מגבונים עדינים עד שהעצמות נקיות לחלוטין.

מניחים רק עצמות שלמות בצלחת פטרי המכילה 70% אלכוהול אתילי ודוגרים למשך שלוש דקות כדי להרוג מיקרואורגניזמים קשורים. מוציאים את העצמות ומניחים בכלי פטרי עם DMEM סטרילי. לאחר מכן, חותכים בזהירות את קצות העצמות.

החזק את העצם מעל צינור חרוטי MT 50 מיליליטר המונח על קרח, והשתמש במחט בגודל 25 כדי לשטוף בזהירות 10 מיליליטר DMEM קר דרך כל עצם. לאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התאים שנאסף בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 650 פעמים G.במהלך צנטריפוגה זו, הכינו וסננו את אמצעי ההזנה של מקרופאגים מח עצם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השעו מחדש את הפלטה המתקבלת עם 10 מיליליטר של אמצעי הזנה.

העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לשבש את גושי התאים ולהסיר פסולת גדולה. לאחר מכן צלחת מיליליטר אחד של תרחיף תאי המתח לתוך 10 מיליליטר של אמצעי הזנה, צלחות פטרי המוגדרות לשימוש בתרבית רקמות. אפשר לתאים להיצמד ל-37 מעלות צלזיוס עם 10% פחמן דו חמצני למשך שבעה ימים.

החלפת אמצעי ההזנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט יום לפני הניסוי. ניתוק מקרופאגים מהצלחת על ידי הסרת אמצעי הזנה והוספת חמישה מיליליטר של מגיב עדין להפשטת תאים לצלחת לאחר הדגירה של התאים למשך חמש עד 10 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הסר את המקרופאגים בעזרת פיפטינג עדין.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-650 פעמים G למשך 10 דקות לפני כיפוף הגלולה במיליליטר אחד של אמצעי הזנה. באמצעות דילול של 1 עד 20, חשב את ריכוז המקרופאגים על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לתוך ציטומטר המו באמצעות תחתית זכוכית של 14 מילימטר. צלחות פטרי מניחות ריכוז של אחד כפול 10 עד חמישית מקרופאגים ישירות לבאר הפנימית, המכילה מקסימום 200 מיקרוליטר.

הקפד לא לחרוג מנפח זה. אפשר לתאים להיצמד לצלחת פטרי הזכוכית על ידי הנחת הכלים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הוסף מיליליטר עד שניים של אמצעי הזנה בתוספת ליפופוליסכריד במיליגרם אחד למיליליטר ואינטרפרון גמא.

ב-500 יחידות למיליליטר, אפשר לתאים לדגור למשך הלילה ביום הניסוי. הסר מיליליטר אחד של תרבית תאי G מחוסנת לילה וחבר את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות של 420 פעמים G.To להסיר מדיה ומוצרי קריפטוקוק חוץ-תאיים, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מי מלח חוצץ פוספט או PBS ולאחר מכן צנטריפוגה כמו קודם. לאחר החייאה, השעיית כדור תאי השמרים במיליליטר אחד של PBS סטרילי וביצוע פיפטת דילול של 1 עד 100, 10 מיקרוליטר מהדילול לתוך ציטומטר המו וספירת התאים.

חשב את ריכוז תאי השמרים הדרושים לריבוי זיהום של אחד עד חמישה. הוסף את הנפח המחושב של תרחיף תאי קריפטוקוק למיליליטר אחד של אמצעי הזנה עם הנוגדן החד-שבטי, 18 B 7 בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את אמצעי ההזנה מצלחת הפטרי מזכוכית ושטוף את המקרופאגים פעם אחת עם PBS סטרילי. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של סמין אופסוניז ישירות לבאר, ולאחר מכן דגירה עם השמרים למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה המשותפת שנבדקה על ידי מיקרוסקופ שהמקרופאגים הפנימו c eForms כדי להיחשב לתאים קריפטוקוקליים מופנמים יש לראות בבירור בגבולות המקרופאג כפי שמצוין על ידי ראש החץ הגדול.

ראש החץ הקטן יותר מצביע על מקרופאג לא נגוע ללא תאים פטרייתיים. שטפו את צלחת הפטרי שלוש פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את כל הניאופורמנים החוץ-תאיים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד עד שניים של אמצעי הזנה ללא הנוגדן החד-שבטי כדי לבצע ניסויים אלה.

לפני הניסוי נדרש מיקרוסקופ המצויד בתא דגירה צמוד הכולל אספקת פחמן דו חמצני ויחידת חימום. מחממים את תא הדגירה למשך 30 דקות לפחות בחום של 37 מעלות צלזיוס. ודא שיחידת הפחמן הדו חמצני קוראת 5% בתחילת הניסוי.

הנח את צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית על משטח המיקרוסקופ, מכסה בפחמן דו חמצני דולק וסגור את כל הדלתות כדי להבטיח שלא יברח חום באמצעות המטרה פי 10 עם המיקרוסקופ בניגודיות פאזה, התמקד בשדה ברור של מקרופאגים נגועים, הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לצלם תמונה כל ארבע דקות למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הניסוי יגיע לסיומו ובסך הכל ייאספו 361 תמונות. ייצאו את התמונות האלה כקובצי JPEG בדחיסה של 5%.

באמצעות תוכנת image, J, ראה את התמונות כערימה ויזואלית בחמש פריימים לשנייה. הפריים הראשוני של הסרט מראה מקרופאגים רבים ברחבי השדה, כאשר חלקם לא נגועים וחלקם בעלי כמויות משתנות של תאים קריפטוקוקליים. ככל שהסרט מתקדם, התאים כולם mo וניתן לראות אותם נעים בשדה בסרט זה, ברור שתאי הקריפטוקוק נמצאים בגבולות של מקרופאג נגוע.

המקרופאג נסער וניתן לראות תא שמרים, אך בתוך אזור ה-FGA, תאים קריפטוקוקיים נמחקים במהירות לסביבה שמסביב. מקרופאג נגוע שני עובר אקסוציטוזיס לא ליטי ותאי שמרים נוספים משתחררים לחלל החוץ-תאי. התאים המארחים נשארים ברי קיימא לאחר אקסוציטוזיס קריפטוקוקלי, כפי שמעידה יכולתם להמשיך לנוע.

לעיתים, מקרופאגים יתקשרו באופן שמקל על העברת תאים קריפטוקוקיים בין תאים מארחים. תאי השמרים אינם חשופים לסביבה החוץ-תאית ותאי המארח נשארים ברי קיימא. בסרט זה, שני מקרופאגים נגועים יוצרים גשרים בין תאים בשתי הזדמנויות נפרדות כדי להעביר תאים קריפטוקוקליים ממקרופאג אחד למשנהו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ אור דיגיטלי כדי לדמיין מקרופאגים העוברים אקסוציטוזיס לא ליטי ואינטראקציות אחרות של פתוגן מארח.