Name: בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: למד בידוד ותרבות תאי אפיתל שפיר אנושיים ללא מוצרים מהחי, תואם cGMP ליישומים קליניים. השיטה מאפשרת שימוש בניסויים קליניים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכה כספית מתוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות של ממשלת ויקטוריה.

הערה: Placentae יש לאסוף מהריונות בריאים סינגלטון, עם העדפה לניתוחים קיסריים אלקטיביים טווח. בכתב, הסכמה מדעת יש לתת לאיסוף השליה שלהם. ועדת האתיקה במחקר האנושית הרלוונטית שלך צריך אישור כל האיסוף ושימוש ברקמות אנושיות. 1. בידוד של תאי אפיתל amnion <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השליה על גבי משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי ברמה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הנקס סטרילי תמיסת מלח מאוזן (HBSS), לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר ממשטח השליה והקרומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השליה ממוקמת עם חבל הטבור כלפי מעלה, באופן מכאני להפריד את הקצה החיצוני של קרומי amnion וסיסיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנפרד, להפשיט ידני קרום amnion מן הקרום סיסית השליה, עובד מסביב לקצה של הקרום, לכיוון חבל הטבור. הערה: careful כדי להסיר כל חתיכות של זיהום קרום סיסית מamnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים סטרילי, לחתוך את קרום amnion כ -2 סנטימטרים מהבסיס של חבל הטבור ומניחים במכל אטום 500 מיליליטר המכיל 250 מיליליטר HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות על ידי טלטול בקבוק האטומה המכיל קרום amnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את קרום amnion מהמכלים המיוחד לאיסוף באמצעות מלקחיים סטרילית, והמקום לתוך צלחת פטרי 15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קרום amnion לחתיכות כ -5 סנטימטרים (כאשר החזיקו במאונך עם מלקחיים), השלכת חלקים דמו או קרועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום במכל אטום 500 מ&quot;ל ולשטוף עם 250 מיליליטר HBSS כ 3-5 פעמים או עד שקרום amnion הופך שקוף ללא דם מזהם. הערה: כל דם נוכחי עלולים להפחית את היעילות של האנזימטית לעכל פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל החתיכות של קרום amnion לתוך מיכל המכיל 50 מיליליטר של האנזימטית לעכל פתרון, מקפידלמזער שריד של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חתיכות amnion בהאנזימטית לעכל פתרון באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה כדי להסיר כל דם שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion מהאנזימטית לעכל פתרון ומקום במכל סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של האנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לקרום amnion ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בחדר חם עם (עיכול ראשון) טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום. הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף להאנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לחתיכות קרום amnion דגירה 60 דקות באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס עם (עיכול שני) טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את suspensi התאמהשלב 1.14 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1 מיליליטר לקבל השעיה תא בודדת. הערה: בשלב זה ניתן להשאיר תאים על קרח עד תאים מהתקציר השני הם באותו השלב של עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום. הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא משלב 1.18 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם p מיליליטר 1ipette לקבל השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת תאים משני המעכלים או לחלופין לשמור מעכלים תא מופרד עד לאחר ספירת תאים. הערה: זה מונע ערבוב של תאי כדאיות פוטנציאל נמוכים עם תאי כדאיות גבוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת HBSS לנפח סופי של 10-20 מ&quot;ל ולבצע ספירת תאים באמצעות trypan הכחול כדי למדוד את הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הפנוטיפ תאי אפיתל על ידי cytometry זרימה. איפור קוקטיילים נוגדן מתאימים באמצעות אנטי EpCAM-PE (1: 2 דילול) אנטי-CD90-PeCy5 (1: 250) ואנטי-CD105-APC (1: 100) בHBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend משנה של תאים מאחד או שניהם מעכלים בקוקטייל של הנוגדנים בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcytometry זרימה, כתם 1 x 10 6 תאים עם קוקטיילים נוגדן המכילים פקדי isotype (למשל. שליטה PE אלוטיפ 1 IgG + אנטי CD90-PeCy5 + אנטי-CD105-APC). שמור ~ 1 x 10 6 תאים בלא כתם לcytometer זרימת הגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בנוגדןקוקטיילים על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי 3x בHBSS וגלול ב5-10,000,000 תאים לכל מיליליטר לזרימה cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע cytometry זרימה ותוצאות פתק. טוהר בודד התאים (אחוז EpCAM החיובית וCD90 / CD105 תאים שליליים) צפוי להיות 90-95% ו- &lt;1% בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בצד מספר מתאים של תאים לבדיקת קריטריוני בקרת איכות או שחרור מתאימים כפי שנקבע על ידי יישום סופי. הערה: זה יכול לכלול מחלה / הקרנה נגיפית, או בטיחות אחרת או קריטריונים ביולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים הנותרים, לעקוב אחר פרוטוקול ההקפאה, או לחלופין להציב ישירות לתוך התרבות (ישירה לצעד תרבות 3.6). </li></ol> 2. Cryopreservation של hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות זרימת cytometry נתונים או ספירה ידנית עם הדרת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא גלולשל בין 1-10 מיליון תאים למ&quot;ל בתקשורת הקפאה ללא מוצר מן החי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח מתאים של תאים לתוך צלוחיות הקפאה-טבעתי O ומקום לתוך מנגנון הקפאת קצב מבוקר שבי הקירור מתרחש בכ 1 ° C / min עד -80 ° C מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 3. הפשרה ותרבות של Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקוני הקפאה מחנקן נוזלי ומניח על קרח. הערה: להעברה בלבד - להמשיך במהירות לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את ההקפאה במהירות הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס עד שרק חתיכה קטנה (~ 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) של הקרח נשאר. הערה: חשוב שפתרון התא אינו לחמם כדי להפחית את ההשפעות הרעילות של DMSO בתקשורת ההקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תקשורת הקפאה של פי 10 ב( ~ 4 ° C) סרום ללא מדיה קרה, הוסיף טיפה חכמה בגודל מתאיםצינור ד או מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend במדיום סרום ללא, לריכוז של כ 1 מיליון תאים לכל מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה. לאחר הפשרה-כדאיות צפויה תהיה 5-10% פחות מכדאיות מראש הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת על כלי פלסטיק סטנדרטיים תא שטופל תרבות, או לחלופין להשתמש בסוג אני קולגן למשטחי תרבות מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפוי קולגן אני סוג לעקוב אחר הפרוטוקול להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חומצת סוג מסיס אני קולגן משליית אדם (קולגן 15 מ&quot;ג עם 25 מיליליטר מים deionized ו 50 חומצה אצטית קרחונית μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות כוס עם Parafilm ומערבבים באופן מתון על 37 מעלות צלזיוס עד גדילי קולגן הם מומסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון קולגן סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות 01:10 קולגן המסוננים במים ללא יונים. המניה מדוללת זה conce עובדפתרון ntration למשטחי פלסטיק ציפוי וקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסטיק מעיל קולגן, משטחי זכוכית וקרום לשעה 2 ב RT על 37 מעלות צלזיוס, או O / N ב 2-8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הנוזלים עודפים מהמשטח המצופה, ולאפשר לו להתייבש O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים סטריליים תרבות רקמות כיתה או HBSS לפני החדרת תאים ובינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולאפשר התקשרות להתרחש עבור 72-96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התקשרות, לשנות תקשורת על ידי aspirating בזהירות והחלפה עם נפח מתאים של מדיום סרום ללא כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר באמצעות הפרוטוקול להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאי תקשורת לשאוב ולשטוף עם נפח 1x של HBSS סטרילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח 1x של האנזימטית לעכל פתרון דגירה של 5-15 דקות, או עד שתאים הם נצפו ניתוק ממשטח תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף האנזימטית לעכל תמיסה המכילה תאים, הבטחת ceLLS מנותקים ממשטח תרבית תאים על ידי pipetting האנזימטית שוב ושוב לעכל פתרון כנגד משטח תרבית תאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בנפח מתאים של HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1ml לקבל השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני סרום ללא לריכוז של כ 1 מיליון תאים / מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולהמשיך בשיטות סטנדרטי culturing. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+SV+%22Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22">Stem Cells and Regenerative Medicine</a>. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+placental+membranes%3A+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li>
<li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li>
<li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).</li>
<li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li>
<li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li>
<li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li>
<li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li>
<li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li>
<li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li>
<li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li>
<li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631(2012).</li>
<li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533(2012).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763(2012).</li>
<li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li>
<li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li>
<li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+A+%22Newborn+Stem+Cells%3A+Identity%2C+Function%2C+and+Clinical+Potential%22">Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיכול להשפיע באופן משמעותי בהצלחתה של מתודולוגיה זו. אחסון של השליה או amnion עד 3 שעות לפני הבידוד של hAECs עשוי להיות רצוי למטרות לוגיסטיים או תזמון, אולם מומלץ שרקמת מעובד בהקדם האפשרי. אם רקמה היא להיות מאוחסנת, מומלץ כי אחסון להתבצע הבא לנתיחה ושטיפה של קרום amnion. ניתן לאחסן amnion באנטיביוטיקת HBSS סטרילית המכילה על 4 מעלות צלזיוס, אולם כדאיות תא יכולות יפחתו עם זמן אחסון ממושך. אנחנו, ואחרים מצאנו השתנות בתשואת תא ואת הכדאיות, וכדי למזער את ההשתנ...

תאים המופקים ממקורות סביב הלידה, כגון השליה, שליה קרומים, חבל טבור ומי שפיר שמשכו את תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי של תאים לרפואת רגנרטיבית 1,2. הסיבה לעניין זה היא כי סוגים אלה תא כל יש מידה מסוימת של גמישות ויכולת המערכת החיסונית 3, תכונות שהן יסוד ליישומים הטיפוליים הפוטנציאל שלהם. hAECs היא אוכלוסייה הטרוגנית אפיתל שניתן להפיק מקרום amnion טווח או מראש טווח 4, מתן מקור פוטנציאלי בשפע של חומר תאי משובי. התכונות שהופכות את hAECs מושך כטיפול תאי כוללות multipotency שלהם, immunogenicity הנמוך, ותכונות אנטי דלקתיות. hAECs כבר מצא להיות multipotent ביותר הן במבחנה in vivo, מסוגלים להבדיל לשושלות mesodermal (cardiomyocytes, myocytes, osteocytes, adipocytes), שושלות endodermal (תאי לבלב, תאים כבד, תאי ריאה) ושושלות ectodermal (שיער, עור, תאים עצביים והאסטרוציטים) 5-10. מרגיע, למרות hAECs multipotency שלהם אינו מופיע לשני גידולי טופס או לקדם התפתחות גידול in vivo. יתר על כן, hAECs גם חיסון חסוי, המבטא רמות נמוכות של II אנטיגנים המעמד אנושיים לויקוציטים (HLAs) 8. נכס זה צפוי עומד בבסיס היכולת שלהם כדי להתחמק מדחייה חיסונית לאחר השתלה אלוגנאית וxenogenic, כפי שהודגם במחקרים בקופים חיסוניים מוסמכים, ארנבות, שרקנים, חולדות, וחזירים 11-13. hAECs להציג המערכת החיסונית חזקה ונכסים לדיכוי המערכת החיסונית ובכך להציע יתרונות מעשיים משמעותיים עבור יישומים קליניים פוטנציאליים בטיפול מחלה אוטואימונית. הם האמינו hAECs להפעיל פונקציות המערכת החיסונית בשתי מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. בדואר של המנגנונים הציעו, הוא באמצעות ההפרשה של המערכת החיסונית גורמי 14. יישומים הנוכחיים של hAECs במודלים של בעלי החיים מחלה פרה-קליניים כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלת כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. חוקרים הראו עניין בשימוש hAECs לטיפול בדלקת מוח שבץ-פוסט בשל המאפיינים הייחודיים שלהם. יש ראיות לכך hAECs יכול לחצות את מחסום דם המוח שבו הם יכולים נקלטים, לשרוד עד 60 יום, להתמיין לתאי עצב, להקטין את הדלקת ולקדם את ההתחדשות של רקמות פגועות של מערכת עצבים מרכזיות במודלים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות 15. hAECs מציע את היכולת לכוון ולהפוך מסלולי פתולוגי מרובים שתורמים להתפתחות וההתקדמות של טרשת נפוצה. לדוגמא, נובע ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים מציע כי hAECs הם מאוד מדכא את מערכת חיסון ועלול לגרום לסובלנות חיסונית פריפריה ולהפוך תגובות דלקתיות מתמשכות. hAECs גם הוכח יש את היכולת להתמיין לתאים עצביים in vivo ולשפר neuroregeneration אנדוגני באמצעות ההפרשה של מגוון רחב של גורמי neurotrophic 16. תאי אפיתל אדם וamnion המכרסם כבר הוכיחו היעילות הטיפולית שלהם לטיפול במחלות כבד במודלים של בעלי חיים. במודל פחמן טטרא אינדוקציה נזק של מחלת כבד, השתלה להוביל hAEC לengraftment של hAECs קיימא בכבד, מלווה באפופטוזיס hepatocyte מופחת, וירידה בדלקת ופיברוזיס 17 בכבד. יכול להיות מגורה hAECs לגורמי לבלב הביעו כוללים מובילי אינסולין וגלוקוז. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל לhAECs לשחזר את רמות הגלוקוז בדם בעכברים סוכרתיים 18. בעכברים שקבלhAECs, שתי רמות הסוכר בדם ומשקל הגוף של בעלי החיים ירד לרמות נורמליות לאחר הזרקה של תאים. מחקרים אלה מציגים טיעון חזק לשימוש בhAECs לטיפול בסוכרת. יש לי hAECs תפקיד מוכח במניעה ובתיקון של פגיעת ריאות חריפה וכרונית ניסיונית בשני מבוגרים ודגמי יילודי 19. מחקרים אלה מצאו כי hAECs להבחין במבחנה לתאי האפיתל ריאות פונקציונליות להביע חלבונים הקשורים ריאה מרובים, כוללים סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR), ערוץ היון שעובר מוטציה בחולים עם סיסטיק פיברוזיס 20. בנוסף, כאשר hAECs מועברים למבוגר הפצועה וריאות של ילוד, שהם מפעילים השפעות המתקן שלהם באמצעות האפנון של תאים חיסוניים מארח, צמצום גיוס לויקוציטים ריאה, כוללים נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים מסוג 21-23. בהתחשב בשפע שלהם,שיא בטיחות, ויישומים קליניים מוכחים למחלות מרובות, ניסויים קליניים באמצעות hAECs הוא בלתי נמנע. במטרה להאיץ את התרגום של טיפולי hAEC לקליניים-ניסויים, שפיתחנו שיטות לבודד, cryopreserve וhAECs התרבות באופן מתאים לניסויים קליניים, באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP) . פרוטוקול זה אנו מבוססים פרוטוקול שפורסם בעבר שאנחנו משתמשים בהצלחה לבודד hAECs באמצעות ריאגנטים מן החי 6. אנחנו שיניתי את הפרוטוקול המקורי כדי להחליף מוצרים המופקים מבעלי חיים עם ריאגנטים ללא מוצר מן החי, ואופטימיזציה שלאחר מכן בוצעה כדי לייעל את תשואת תא, כדאיות וטוהר. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול שעומד בתקנים רגולטוריים לתא ייצור לניסויים קליניים בבני אדם.

<table><tbody><tr><td>ערכת</td><td></td><td></td><td></td>איסוף</tr><tr><td>מגש הפשטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>ליברטי חבישת מלקחיים, מחודד 13 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מספריים - חד / קהה ישר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>כפפות לטקס סטריליות&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ביגוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגן ביגוד מגן (שמלה)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>שמלות בידוד</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>כפפות לטקס סטריליות&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מסכת פנים לשימוש כללי</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>נעליים מכסה</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>מדיה וריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הנקס' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>ללא סידן או מגנזיום</td></tr><tr><td>TrypZean (ממקור מן החי; טריפסין רקומביננטי חופשי)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה&nbsp; 1 גרם/50 מ"ל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כחול טריפן</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype שליטה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>חומרים</td><td></td><td></td><td></td>מתכלים</tr><tr><td>50 מ"ל פיפטה מדורגת</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה מדורגת</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה מדורגת</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרות בז</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל BD</td><td>/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 15 ס"מ</td><td>קורנינג</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסנני m</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m מסננים</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל קצות פיפטה פישרברנד</td><td></td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l טיפים לפיפטה</td><td>פישרברנד</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל מזרק</td><td>BD/רפואי</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>מרית פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סירת שקילה מפלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני קריו</td><td>Nunc</td><td>ציוד</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 377267 <tr><td>מר פרוסטי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ארון</td><td></td><td></td><td></td> ביולוגי</tr></tbody></table>

בידוד, cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

תאי אפיתל מי שפיר אנושיים (hAECs) שמקורם בקרומי מי שפיר מונחים או מוקדמים משכו תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי לתאים לרפואה רגנרטיבית. הסיבה לעניין זה היא עדויות לכך שלתאים אלה יש יכולת התמיינות רב-פוטנטית גבוהה, אימונוגניות נמוכה ותפקודים אנטי דלקתיים. תכונות אלה הניעו חוקרים לחקור את הפוטנציאל של hAECs לשמש לטיפול במגוון מחלות והפרעות במחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים בהצלחה רבה.
hAECs מצאו יישום נרחב לטיפול במגוון מחלות והפרעות. יישומים קליניים פוטנציאליים של hAECs כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלות כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. התקדמות מניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים לניסויים קליניים דורשת סטנדרט גבוה יותר של בקרת איכות ובטיחות למוצרי טיפול תאי. משיקולי בטיחות ובקרת איכות, עדיף שפרוטוקולי בידוד תאים ישתמשו בריאגנטים נטולי מוצרים מן החי. 
פיתחנו פרוטוקולים המאפשרים לחוקרים לבודד, לשמר בהקפאה ולתרבית hAECs באמצעות ריאגנטים נטולי מוצרים מן החי. היתרון בשיטה זו הוא שניתן לבודד, לאפיין, לשמר בהקפאה ולתרבת תאים אלה ללא סיכון של העברת פתוגנים בעלי חיים שעלולים להזיק לבני אדם, תוך שמירה על תפוקת תאים מתאימה, כדאיות ופוטנציאל גדילה. עבור חוקרים העוברים ממחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים לניסויים קליניים, מתודולוגיות אלה יאיצו מאוד את האישור הרגולטורי, יפחיתו סיכונים וישפרו את איכות אוכלוסיית התאים הטיפוליים שלהם.

כאשר הליך זה ואחריו בצורה נכונה, תשואה ממוצעת של 120 מ'hAECs צריכה להיות צפויה, עם מגוון טיפוסי של 80-160,000,000 תאים. מתשואות אלה, ניתן לצפות כדאיות ממוצעת של 83 ± 4%. הגידול בתשואה הממוצעת והכדאיות נמוכה במקצת בשיטה הקלינית יכולים להיות בגלל פעילות טריפסין גבוהה מהמוצר המופק מבעלי החיים, ואולי גם בשל היעדרם של חלבונים בסרום. יש לי hAECs המבודד פרופיל פני תא ממוצע של תאים חיוביים EpCAM 92% עם &lt;תאים חיוביים סמן mesenchymal 1% CD90, CD105. סמנים אלה נבחרו בשל ייחודם ל24,25...

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אפיתל מי שפיר אנושיים (hAECs) באמצעות ריאגנטים ללא מוצרים מן החי בהתאם להנחיות הנוכחיות של תנאי ייצור נאותים (cGMP).

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את אוכלוסיית תאי האפיתל מקרום מי שפיר אנושי. זה מושג על ידי הפשטת קרום מי השפיר מקרום הקוריון והשליה בשלב השני. קרום מי השפיר נשטף מכל עקבות הדם ולאחר מכן מתעכל בתמיסת אנזים טריפסין ללא מוצרים מן החי.בשלב האחרון, מסננים את תמיסת הרקמה כדי לאסוף את תאי האפיתל המבודדים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את טוהר אוכלוסיית תאי האפיתל של מי השפיר על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא אינה דורשת חשיפה של תאים למוצרים מן החי, כלומר תאים אלה שימושיים לניסויים קליניים.כדי לבודד את תאי האפיתל של מי השפיר מתחילים בהנחת השליה על משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי מסוג 2. לאחר מכן השתמש ב-HBSS סטרילי כדי לשטוף כמה שיותר דם משטח השליה. לאחר מכן, מקם את השליה כך שחבל הטבור וקרומי השליה פונים כלפי מעלה והפשיט ידנית את קרום מי השפיר מקרום הקוריון של השליה הפועלת סביב קצה הממברנה לכיוון חבל הטבור.הקפד להסיר את כל חתיכות קרום הקוריון המזהם ממי השפיר, ולאחר מכן השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את קרום מי השפיר כשני סנטימטרים מבסיס חבל הטבור ולהניח את הממברנה בכלי קיבול של 500 מיליליטר המכיל 250 מיליליטר HBSS לאטום את המיכל ולנער אותו היטב כדי לשטוף את הרקמה, ולאחר מכן השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הממברנה לצלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר. כעת, חותכים את הממברנה לחתיכות אנכיות באורך חמישה סנטימטרים ושוטפים את החלקים שלוש עד חמש פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה עד שהממברנה הופכת שקופה ללא דם מזהם. לאחר הסרת כל הדם, העבירו את חתיכות הרקמה ל-50 מיליליטר של תמיסת עיכול אנזימטית, קחו קר כדי למזער את ההעברה של כל HBSS ודגרו את רקמת מי השפיר בחדר חם ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה כדי להסיר את כל הדם שנותר לאחר 15 דקות, גררו כל חתיכה לאורך השפה הפנימית של המיכל כדי לנקז את תמיסת העיכול הישנה והוסיפו את החלקים ל 100 מיליליטר תמיסת עיכול אנזימטית טרייה.לאחר עיכול של שעה באותם תנאים, העבירו את הממברנות למיכל חדש של תמיסת Enzymatic Digest. הקפדה על ניקוז הרקמות כפי שהודגם זה עתה וערבוב עדין של הממברנות למשך 60 דקות אחרונות לאחר העיכול השני. מסננים את תרחיף התאים דרך מסנן של 70 מיקרומטר, ולאחר מכן סובבו את תמיסת התא למשך 10 דקות ב-1000 Gs וטמפרטורת החדר, השעו בעדינות את הגלולה בארבעה מיליליטר של מעכב אנזים על בסיס פולי סויה כדי ליצור תרחיף תא בודד, ולאחר מכן הוסיפו HBSS לתאים לנפח סופי של 10 עד 20 מיליליטר.קבע את מספר התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללה של טריאם כחול, ולאחר מכן להקפיא את תאי האפיתל המבודדים של מי השפיר. ראשית, כופפו אותם במשך חמש דקות בחום של 700 גבינות וטמפרטורת החדר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בפעם אחת 10 מתוך 6 עד 10 פעמים 10 מהתאים השביעיים למיליליטר באמצעי שימור הקפאה ללא מוצרים מן החי ופיפטה נפח מתאים של תאים לבקבוקוני שימור קריו טבעתיים.לבסוף הכניסו את הבקבוקונים למנגנון הקפאה בקצב מבוקר שבו מתרחש קירור בטמפרטורה של כ-1 מעלות צלזיוס לדקה עד להשגת מינוס 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הרבה מדיה ללא מוצרים מן החי מתפקדת כראוי. עם זאת, ריכוז ה-DMSO האופטימלי הוא כ-5 עד 10%בדרך כלל, הכדאיות הצפויה לאחר ההפשרה היא 5 עד 10% פחות מהכדאיות לפני השימור בהקפאה ויכולה להיות גדולה משמעותית עבור המשתמש חסר הניסיון.ניתן לבצע תרבית תאים עם תאי אפיתל מי שפיר אנושיים כדי לאפשר אפיון או התמיינות של התאים לניתוח נוסף במורד הזרם כשהם שומרים על פנוטיפ האפיתל שלהם במצע תרבית חופשי בסרום. בנוסף לתכונות חיסוניות ואנטי דלקתיות, תאי אפיתל מי שפיר אנושיים הוכחו כרב עוצמתיים ביותר, במבחנה וב-vivo, ומתמיינים לשושלות תאים המייצגות את שלוש שכבות הנבט העיקריות לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לבצע ניסויים קליניים במצבים כמו מחלת ריאות ומחלת השתל נגד המארח.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאז ג'יימס תומסון ואח' פיתח טכניקה בשנת 1998 לבודד ולגדל הס בתרבות, הקפאת תאים לשימוש מאוחר יותר, מפשיר והרחבת תאים ממלאי קפוא הפכו נהלים חשוב לבצע בתרבות הס שגרה התא. מכיוון שתאי הס רגישים מאוד הלחצים של מקפיא הפשרה, טיפול מיוחד חייב לנקוט. כאן אנו וידגים עבור מפשיר במהירות תאים הס ממניות חנקן נוזלי, ציפוי אותם על תאים עובריים של עכבר מזין, ולאט לאט הקפאת אותם לצורך אחסון לטווח ארוך.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול לבדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים המשתמש במדיום תרבית משומש, המונע ביופסיה של עוברים ומאפשר זיהוי כרומוזום פלואידי באמצעות NGS. המאמר הנוכחי מציג את ההליך המפורט, כולל הכנת מדיום תרבית, הגברה של גנום שלם (WGA), הכנת ספריית ריצוף הדור הבא (NGS) וניתוח נתונים.

בדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים טרום השרשה באמצעות מדיום תרבית משומש: איסוף דגימות וניתוח פלואידיות כרומוזומליות

כאן אנו מתארים את הבידוד, ההגברה וההתמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE) בממשק האוויר-נוזלי ופרוטוקול ביו-בנקאי המאפשר להקפיא בהצלחה ולאחר מכן להפשיר HNE מוגבר. הפרוטוקול מנתח תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ממוינים ותיקון הפרשת כלוריד הקשור ל-CFTR בטיפולי אפנון שונים.

תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים: ביובנקינג בהקשר של רפואה מדויקת

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימור קריוגני יעיל של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים.

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל חלב אנושיים ראשוניים (HMECs) מכמויות קטנות של רקמת חלב. פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים הן ליישומים מעבדתיים והן ליישומים קליניים.

בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

למד בידוד ותרבות תאי אפיתל שפיר אנושיים ללא מוצרים מהחי, תואם cGMP ליישומים קליניים. השיטה מאפשרת שימוש בניסויים קליניים ברפואה רגנרטיבית.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

גלה סרטונים נוספים