In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים טכניקות in vivo ו-in vitro לגידול נמטודות פתוגניות אנטרו. שיטת in vivo מושגת על ידי דגירה ראשונה של זחלי כוכב של עש השעווה הגדול יותר garia melanoma עם תרחיף צעיר או IJ זיהומי. לאחר מכן, הגופות הנגועות בנמטודות מועברות למלכודת לבנה שונה כדי שניתן יהיה לאסוף אותן.

שיטת התרבות במבחנה מתבצעת על ידי תיקון ראשון של צלחות אגר כבד, כליות או שומנים, והחיידקים הסימביוטיים הרצויים מפוספסים החוצה. לאחר מכן מתווסף מתלה IJ לצלחות והנמטודות מורשות להתפתח. לבסוף, מנת האגר מועברת למלכודת לבנה שונה לקטיף הנמטודות.

בסופו של דבר, טכניקות אלה מקימות בהצלחה תרביות EPN וגם מהוות בסיס לבדיקות ביולוגיות אחרות המשתמשות באורגניזמים אלה למחקר. ניתן להשתמש בשיטות inbivo ו-in vitro המוצגות במצגת זו לא רק למחקר עם נמטודות פתוגניות, אלא גם למגוון רחב של ניסויים שמטרתם להבין אינטראקציות ProCard ו-eary. מי שידגים את הנהלים יהיה ג'ון מקמולן, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.

כדי להתחיל בגידול in vivo של נמטודות פתוגניות של Entero, הפוך צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 100 על 15 מילימטר והניח שני דיסקים של נייר סינון במכסה הכלי ופזרו באופן שווה מיליליטר אחד של תרחיף הנוער או ה-IJ הזיהומי. על נייר המסנן, הוסף 10 אחרונים בזחלי כוכבים של עש השעווה הגדול יותר garia melanoma למנה כדי ליצור כ -100 עד 200 IJs pal lava. מכסים את המכסה בתחתית צלחת הפטרי ומסמנים אותו.

לאחר מכן הניחו את המנה בתוך שקית ניילון, אטמו אותה באופן רופף ודגרו בחושך בין 20 ל -25 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה עד חמישה ימים, הסר את הגופות עם סימני זיהום בנמטודות למלכודת לבנה שונה כדי לבצע את שיטת כליות הכבד לגידול חוץ גופי של נמטודות עם החיידקים שלהן. קוצצים את הכבד והכליות לחתיכות קטנות ומכניסים לבלנדר עם אגר נתרן כלורי, ותערובת של 300 מיליליטר מים עד שהבשר הופך לעיסה נוזלית, עיסה סמיכה או מחית.

מעבירים את התערובת לבקבוק מאייר ומשתמשים ב-200 מיליליטר מים כדי לשטוף את כלי הבלנדר. מזלפים את המדיום לתוך הבקבוק. חיטוי התערובת למשך 15 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס.

יוצקים כ -20 מיליליטר אגר לצלחות פטרי של חמישה או שישה סנטימטרים ומניחים לאגר להתמצק לפני אחסון הכלים בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כדי להכין נמטודות בשיטת אגר השומנים, יש לפספס את החיידקים הסימביוטיים הרצויים על צלחת אגר שומנים, ולדגור את הצלחות בחושך בין 20 ל-25 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. למחרת בכ-0.4 מיליליטר של תרחיף נמטודות מעוקר על פני השטח המורכב מביצים או צעירים זיהומיים, ודוגר על הצלחות בטמפרטורת החדר בחושך או באינקובטור ב-23 פלוס מינוס שלוש מעלות צלזיוס.

עקוב אחר התרביות מדי יום ליצירת IJs, שאמורה להתרחש בעוד כ-12 יום. ברגע שרואים את הנמטודות, זוחלות על דפנות המנה מתחת למכסה המנוע של זרימת למינה. קצרו אותם על ידי העברת תחתית המנה עם אגר למלכודת לבנה שונה.

כאשר ה-IJs יוצאים מהמלכודת הלבנה, אספו אותם והשתמשו במים מעוקרים כדי לשטוף את מתלה ה-IJ. כדי להסיר פסולת בינונית, אחסן את ה-IJs במים מזוקקים מעוקרים ב-10 מעלות צלזיוס בקור, או השתמש מיד באמצעות IJs במין הנמטודות הרצוי. הדביקו 10 עד 20 זחלי ג'לה או מספיק כדי לייצר את מספר הביצים הרצוי.

לאחר שלושה או ארבעה ימים, אספו את הגופות. מניחים כל גופה בנפרד לתוך צלחת פטרי עם תמיסת מלח או מאגר M nine. כדי לנתח גופה, השתמש במלקחיים עדינים כדי למשוך את הראש.

השתמש במחט דקה בצורת L כדי לאסוף לפחות 20 נקבות GRD עם ביצים ולהניח אותן בכוס שעון המכילה 10 מיליליטר של מאגר M nine. לאחר הכנת תמיסה מייננת על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במאגר M nine כדי לשטוף את הנקבות לפחות שלוש פעמים על ידי מילוי זכוכית השעון במאגר ושאיבת התמיסה בזהירות. לאחר מכן, הוסף מיד את התמיסה המייננת ואפשר לנקבות להישאר בתמיסה לא יותר מ -10 עד 15 דקות.

כדי להאיץ את תהליך ההתפוררות, השתמש במחט או באזמל כדי לחתוך את גופן הנשי. מוציאים את הביצים על ידי פיפטינג לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות. כדי להסיר עוד יותר רקמת נמטודה המחוברת לביצים, השתמש בהגדרת מהירות גבוהה כדי לסובב את הצינורות למשך 15 שניות.

לחלופין, פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים לאחר כדור הביצים בכ -18, 000 גרם למשך שתי דקות. הסר את התמיסה המייננת לפני השימוש במים מזוקקים סטריליים כדי לשטוף את הביצים פעמיים. צנטריפוגה בפעם האחרונה שלך ב 900 גרם למשך דקה אחת.

לאחר מכן השעו את הביצים ב -300 עד 500 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים והניחו אותן בצלחת פטרי סטרילית של שלושה סנטימטרים או מעוקרות. צפה בכוס. בדוק את הביצים במיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 30 עד 50 כדי לוודא שהן שלמות לפני העברתן לצלחת של חמישה סנטימטרים.

עם אגר כליות כבד. אחסן את הלוחות המסומנים זקופים בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. הביצה צריכה לבקוע למשך הלילה, להתבונן בכלים מעת לעת ולהשליך את כל הכלים המראים סימני זיהום פטרייתי או חיידקי.

ברגע שרואים IJs, נודדים במעלה הדופן של צלחת הפטרי, מסירים את המכסה ומעבירים את צלחת האגר למלכודת לבנה שונה. שיטת הגידול in vivo משתמשת בחרקים חיים כמארחים לצמיחה ורבייה של נמטודות. מוצג כאן תא זיהום עם הזחלים האחרונים של עש השעווה הגדול יותר garia Melan Ella.

איור זה מציג את שיטת הגידול במבחנה באמצעות צלחת אגר ליפידים עם שלבי נמטודה נקבה בוגרת. נוכחותן של טיפות שומנים באגר שכיחה מאוד, ובדרך כלל הן אינן מפריעות לצמיחת הנמטודות או להתבגרותן. באיור זה, נראים IJs זוחלים על צד לוחית כליה בכבד.

החיסרון של שיטה זו הוא שהיא נוטה לזיהום בחיידקים או פטריות בגלל האופי העשיר של המדיום הנראה כאן כצלחת כליות כבד עם נמטודות שטיינר במלכודת לבנה שונה לקצירת צאצאי IJs. במלכודת זו, שלבי ה-IJ של הנמטודות ינדדו למים, שם ניתן יהיה לקצור אותן לשימוש בניסויים או לאחסן אותן עד לצורך. לגידול נמטודות סימביוטיות APO, מומלץ לטחון את ה-IJs וה-LB ולפלח את התרחיף על מדיום NBTA כדי לאשר עוד יותר את היעדר הסימביאנט החיידקי.

על המשתמשים להיות מודעים לכך שדירוג של נמטודות פתוגניות ללא הסימבציה החיידקית שלהן לאורך דורות מרובים עשוי להיות בעל השלכות על הישרדות ורבייה של נמטודות לאורך זמן.