Name: In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד שיטות גידול של נמטודות entomopathogenic בטכניקות in vivo ובמבחנה. השיטות כוללות שימוש בזחלי עש השעווה ומצעי אגר עם חיידקים סימביוטיים. שיטות אלו מאפשרות הקמת תרביות EPN ומחקר יעיל של אינטראקציות מזיקים-מארחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP

.1 בvivo גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים Symboitic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צלחת פטרי פלסטיק 100 x 15 מ&quot;מ ומניח את שני דיסקים של נייר סינון (90 מ&quot;מ) במכסה של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר באופן שווה 1 מ&quot;ל של ההשעיה IJ (קטינים מזהמים) מים (בריכוז של 1,000-2,000 IJ / מ&quot;ל) על נייר הסינון. הערה: IJS לא צריך להיות מעוקר לפני שטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 זחלי instar האחרונים של mellonella Galleria waxmoth הגדול יותר לצלחת. המטרה היא לספק כ 100-200 IJS / זחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את המכסה עם החלק התחתון של צלחת פטרי (איור 1) ולתייג את צלחת פטרי. להזכיר את המידע הבא: שם מין נמטודות (אם ידוע); לבודד קוד / ייעוד; מלכודת זיהום נקבעה מועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת, בתוך שקית פלסטיק אטומה באופן רופף (כדי לחסוך בלחות) ולשמור אותו בחושך בבית או בטמפרטורת חדר או באינקובטור בין 20-25 ° C. הגעה מנות יומית הערה: חושך מאפשר זיהום נמטודות, כפי שהוא מחקה תנאי זיהום טבעיים באדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3-5 ימים, להסיר את הגופות עם סימנים של זיהום נמטודות למלכודת לבנה שונה 7. הערה: אם הגופות להריח רקוב, זה עשוי להיות סימן לכך שculturing לא היה מוצלח ו / או לא היה זיהום. הגדר קאמרי זיהום חדש עם קבוצה חדשה של נמטודות וחרקים. </li></ol> .2 במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים סימביוטיים שלהם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבד כליות אגר שיטה 9,19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים כבד וכליות לחתיכות קטנות (2 סנטימטר 3 או קטן יותר) ומקום לבלנדר עם NaCl, אגר ו300 מ&quot;ל של מים ותערובת עד שהבשר הופך לעיסה נוזלית, דבק או פירה סמיך. לאחר מכן, להעביר את התערובת לבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את 200 מ&quot;ל הסופי של מים לספינת הבלנדר ולמזוג כל מדיה שנותרה לבקבוק Erlenmeyer. החיטוי במשך 15 דקות ב 121 C °. לאחר המעוקר לאפשר אגר להתקרר לגעת לפני המזיגה. הערה: Pipetting של מדיום אינו מומלץ משום שהמדיום הזה נוטה להיות נתחי בשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 20 מ&quot;ל של אגר על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6), בעוד יד ערבוב או מתערבל בקבוק Erlenmeyer בין מוזג לתקשורת הומוגני יותר. לאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך הערה: השתמש במרית מתכת מעוקרת להבה כדי לשבור את כל נתחים גדולים של בשר שפכו לתוך צלחת פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומנים אגר שיטת 9,19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום אגר שומנים על ידי ערבוב יחד מרק מזין, תמצית אגר ושמרים ויוצקים לערבב לתוך בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. הוסף מזוקק H 2 O וMgCl 2 • 6 שעות 2 O וחיטוי ל15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת עקרה של תערובת שמן וסירופ תירס תירס ומערבבים או מערבולת במרץ, ולעתים קרובות לפזר טיפות שמן באופן שווה. <br/&gt; הערה: לעקר שמן תירס וסירופ על ידי הצבת הנפח הדרוש בצולב מקשר UV. השמן לא מתמוסס לתוך הנוזל, אבל לוודא שהוא בטיפין זעירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 20 אגר מ&quot;ל על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6) ולאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak רצוי חיידקים סימביוטיים על הצלחת אגר שומנים ודגירת צלחות ב28 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעה. הערה: מורחים 100-200 μl של תת הלילה (12-16 לשעה) LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום אחרי, להוסיף כ 0.4 מ&quot;ל של השעיה משטח מעוקר נמטודות (ביצים או קטינים מזהמים) ודגירת צלחות בטמפרטורת חדר בחושך או בחממה ב22 ± 3 מעלות צלזיוס. הערה: אל תוסיף יותר מ 0.4 מ&quot;ל של ההשעיה נמטודות כפי שהוא יכול ליצור סביבת יתר על המידה רטובה שהיא שלילי לצמיחת נמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תרבויות יומי. תרבויות צריכה לייצר דור חדש של IJS בכ -12 ימים (איור 2).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחת תחתית עם אגר כאשר נמטודות נראית זחילה הצדדים של הצלחת (איור 3 א) למלכודת לבנה שונה (ראה אל אורוסקו et. 12) למסוק IJS (איור 3 ב). לבצע שלב זה תחת הזרימה למינרית להפחתת זיהום מכלי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף IJS מהמלכודת הלבנה שונה על הופעתה ולשטוף השעיה IJ כדי להסיר כל פסולת בינונית. חנות IJ במעוקר מים מזוקקים ב10 ° C (בחממה קרה בטמפרטורה או בחדר קר) או להשתמש באופן מיידי במידת הצורך. הערה: בהתאם למטרת המחקר, זרע הצלחות גם עם נמטודות-יישב הסימביונט או aposymbiotic. </li></ol></li></ol> .3 במבחנה הגידול של Aposymbiotic (הסימביונט-חינם) Entomopathogenic נמטודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק 10-20 G. זחלי mellonella עם IJS של מיני נמטודות הרצויות (ראה סעיף 1). אחרי 3 או 4 ימים (בשלב זה IJS צריך הבשיללמבוגרים דור הראשונים) לאסוף גופות. הערה: זמן לפדיון ומספר הנקבות הדרושות כדי להשיג מספר מספיק של ביצים משתנית בהתאם למינים. להדביק עוד G. mellonella זחלים במידת צורך ולהתחיל והניתוחים מוקדם ככל לאחר זיהום 48 שעות כדי להעריך אם הן נמצאות בשלב התפתחותי תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל גופה בנפרד בצלחת פטרי עם תמיסת מלח (חיץ M9 18). לנתח גווייה על ידי משיכת ראשו עם מלקחיים קצה קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 20 הרה להולדת (עם ביצים בפנים) נקבות עם מחט דקה (L-צורה רצוי) ולמקם אותם בזכוכית שעון המכילה 10 מ&quot;ל של חיץ M9 (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון axenizing על ידי בהתחשב את המרכיבים הבאים: 6.75 מ&quot;ל מים מזוקקים, 1.25 מ&quot;ל 5 N NaOH, ו2.25 מ&quot;ל פתרון אקונומיקה זמין מסחרי בדילול מלא להיפוכלוריט 3%. הערה: NaOH הוא פתרון כפפות, משקפי מגן בסיסי ואחרים מתאים מגןבגדים צריכים להיות משוחק. הערה: הכן פתרון axenizing טרי בכל פעם, כמו אקונומיקה מדרדרת באור. הכן כמה קבוצות של פתרון axenizing ולבצע עיקור המשטח וקציר של ביצים במשקפיים שעון מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את נקבות לפחות שלוש פעמים עם חיץ M9 מילוי זכוכית שעון עם פתרון חיץ ומתחנף חיץ עם טפטפת. ודא הנשים יישארו בזכוכית השעון. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף את פתרון axenizing ולאפשר את הנקבות להישאר בפתרון זה עבור לא יותר מ 10-15 דקות. שים לב לרקמות נמטודות מתחילות להתפורר תוך הביצים (שהם עמידים לפתרון axenizing) נותרו על כנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לשבש גוף נשי כדי לזרז את התהליך, על ידי חיתוכם עם מחט או אזמל (איור 4 ב, ג). הסר ביצים על ידי pipetting אותם לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, הימנעות הוספת כל רקמה שלא נמסה. הערה: שימוש כמ &#39;כל צינורות microcentrifuge ככל שיידרשו כדי לאסוף ביצים ולעבוד במהירות, כפי שהכדאיות של הביצים תקטן על פני תקופה ממושכת של חשיפה לפתרון axenizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות וורטקס ל15 שניות באמצעות &quot;הגדרת מהירות גבוהה&quot; כדי להסיר עוד נמטודות רקמות מחוברת לביצים. לחלופין, אם מערבולת אינה זמינה, pipet למעלה ולמטה כמה פעמים הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים גלולה על ידי צנטריפוגה בכ 18,000 גרם במשך 2 דקות. להגדיל את המהירות אם ביצים לא מספיק גלולה. הסר פתרון axenizing ולשטוף פעמיים על ידי מילוי צינור microcentrifuge עם מים מזוקקים סטריליים ו צנטריפוגות עוד פעם אחת ב900 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, resuspend ביצים ב300-500 μl של מים מזוקקים סטריליים ולמקם אותם בצלחת סטרילית 3 סנטימטר פטרי או כוס שעון מעוקרת. זכור כי ביצים נמצאות כעת מעוקר משטח, כך שיש להשתמש טפטפות סטרילי ו / או טיפים pippetter ומים כדי לשמור על ניקיון של הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לבחון ביצים תחת מיקרוסקופ לנתח (הגדלה 30-50X) כדי לאשר שהם שלמים (איור 4D) ולהעביר אותם לצלחת 5 סנטימטר עם אגר כבד כליות (ראה סעיף 2.1) הערה: אל תוסיף יותר מ -400 μl של ההשעיה הביצה על הצלחות כמו זה יגרום אגר מוגזם רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תווית עם מידע מתאים ולאחסן אותם זקופה בחושך ב28 ° C. בקיעה של ביצים צריכה להיות הלילה מאליו. הערה: מים עשויים להתעבות על המכסה של הצלחת אבל זה יתאדה לאחר 1 או 2 ימים. בשלב זה, למקם את הצלחת בשקית ניילון כדי לשמור על לחות של אגר ולהימנע מהייבוש שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב מנות מעת לעת ולבטל את כל מנות שמראות סימנים של פטרייה או זיהום חיידקים. ברגע שIJS נראה נודדים במעלה הקיר של צלחת פטרי, להסיר את המכסה ולהעביר את צלחת תחתית עם אגר למלכודת לבנה הותאם 12. שקול תנאים סטריליים בעת העברת המנה לmodifieמלכודת לבנה ד כדי למנוע זיהום של התקשורת החשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניטור הלבן המלכודות וIJ קציר בהתאם לצורך. הערה: נמטודות Aposymbiotic תמשיך לנדוד לתוך המים הלבנים המלכודת במשך ימים רבים ואפילו שבועות. </li></ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמה ממיני נמטודות תיארו כיום ידועים יש ספציפי למארח חרקים מסוים. לדוגמא, ס &#39; kushidai וס scarabaei אינו מאוד ארסי לזחלי lepidopteran, וצריך זחלים קשים כנפיים כגון...

נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8. במסמך זה אנו מציגים מבחר של in vivo ו במבחנת טכניקות שלעתים קרובות למימוש לגידול של EPN בתנאי מעבדה. אניn שיטות vivo להרהר מארח חרק לגידול של נמטודות. בדרך כלל, בשלבי בוסר של הזמנות חרקים שונות (כלומר פרפרים, Coleoptera, Diptera, וכו &#39;.) נחשבים מארחים מתאימים. בvivo שיטות נחשבות בדרך כלל לתחזוקה של תרבויות נמטודות במעבדה. שיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר בוחנים ייצור המוני של נמטודות. כמויות גדולות של מארחי חרקים עשויות להידרש לעניין זה דורש יותר זמן ועלויות נוספות הקשורות לגידול החרקים. יכולה גם להיות מתורבת נמטודות Entomopathogenic במבחנה בכמה כלי תקשורת. בהתאם למטרת המחקר, בשיטות מבחנה עשויה או לשקול ההתאגדות של החיידקים סימביוטיים בתקשורת. במצגת זו, אנו מתארים שתי שיטות נפוצות להפצת EPN. מרכיביה של התקשורת לספק מקור של חומרים מזינים לחיידק סימביוטיבמבחנה שיטות nd מקור סטרולים לנמטודות. מציעות את היתרון הגידול של EPN ללא מארח חרק. במקור, רבים מכלי התקשורת במבחנה פיתחו שמשו לכפל של EPN כאשר מארחי חרקים מתאימים אינם זמינים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, במבחנה שיטות גידול הפכו עובדים רבים במחקר שמטרתו להבין את הקשר בין mutualistic EPN והחיידקים סימביוטיים 17,19. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה&quot;ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">עבור In vivo זיהומים</td></tr><tr><td>100 x 15 צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון, 9 ס"מ דרגה 1 תאית</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>נייר סינון דרגה 1 מומלץ</td></tr><tr><td>מארחי חרקים</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Galleria mellonella הם מומלץ</td></tr><tr><td colspan="4">עבור אגר כבד-כליה (עבור 500 מ"ל)</td></tr><tr><td>60 x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>כבד בקר, 50 גרם</td><td>מתוצרת מקומית; אטליז או סופרמרקט</td><td></td><td>ניתן לאחסן את הנותרים קפואים ולהפשיר לשימוש עתידי</td></tr><tr><td>כליות בקר, 50 גרם</td><td>מתוצרת מקומית; אטליז או סופרמרקט</td><td></td><td>ניתן לאחסן את הנותרים קפואים ולהפשיר לשימוש</td></tr> <tr><td>עתידינתרן כלורי 2.5 גרם (0.5% ריכוז סופי)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>ניתן להשתמש בכל NaCl בדרגת מחקר</td></tr><tr><td>אגר, 7.5 גרם (1.5% אגר, ריכוז סופי)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>ניתן להשתמש בכל אגר בדרגת מדיה</td></tr><tr><td>500 מ"ל מזוקק H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">לאגר ליפיד (עבור 1 ליטר)</td></tr><tr><td>100 x 15 צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>מרק תזונתי, 8 גרם</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים, 5 גרם</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט 10 מ"ל (0.2 גרם/מ"ל)</td> <td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>שמן תירס, 4 מ"ל</td><td>כל מותג</td><td>ממקור מקומי; סופרמרקט</td><td>ניתן להשתמש</td></tr> <tr><td>בכל מותג של שמן תירססירופ תירס, 96 מ"ל מערבבים 7 מ"ל סירופ תירס ב-89 מ"ל H2O מחומם ומערבולת להומוגניות</td><td>Karo</td><td>ממקור מקומי; סופרמרקט</td><td></td></tr><tr><td>אגר, 15 גרם</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>ניתן להשתמש בכל אגר בדרגת מדיה</td></tr><tr><td>מזוקק H2O, 890 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ו במבחנה גידול של entomopathogenic נמטודות (steinernematidae וheterorhabditidae)

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה&quot;ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

שיטת גידול in vivo משתמשת חרקים חיים כמארחים לצמיחת נמטודות ורבייה. תאי דלקת הם שיטה יעילה לחשיפת IJS חרקים. זהו השלב היחיד במעגל החיים 'נמטודות שוקטורים בסימביוזת החיידקים ממארח ​​חרק אחד למשנהו. איור 1 מציג את להגדיר עבור תא זיהום, כמו גם את החומרים הדרושים לבניית תא זה. במבחנה שיטות גידול לאפשר EPN לגדול בלי מארח חרק, אלא גם מיושמים לגידול של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט). איור 2 מראה צלחת אגר שומנים עם שלבי נמטודות שונ...

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים טכניקות in vivo ו-in vitro לגידול נמטודות פתוגניות אנטרו. שיטת in vivo מושגת על ידי דגירה ראשונה של זחלי כוכב של עש השעווה הגדול יותר garia melanoma עם תרחיף צעיר או IJ זיהומי. לאחר מכן, הגופות הנגועות בנמטודות מועברות למלכודת לבנה שונה כדי שניתן יהיה לאסוף אותן.שיטת התרבות במבחנה מתבצעת על ידי תיקון ראשון של צלחות אגר כבד, כליות או שומנים, והחיידקים הסימביוטיים הרצויים מפוספסים החוצה. לאחר מכן מתווסף מתלה IJ לצלחות והנמטודות מורשות להתפתח. לבסוף, מנת האגר מועברת למלכודת לבנה שונה לקטיף הנמטודות.בסופו של דבר, טכניקות אלה מקימות בהצלחה תרביות EPN וגם מהוות בסיס לבדיקות ביולוגיות אחרות המשתמשות באורגניזמים אלה למחקר. ניתן להשתמש בשיטות inbivo ו-in vitro המוצגות במצגת זו לא רק למחקר עם נמטודות פתוגניות, אלא גם למגוון רחב של ניסויים שמטרתם להבין אינטראקציות ProCard ו-eary. מי שידגים את הנהלים יהיה ג'ון מקמולן, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.כדי להתחיל בגידול in vivo של נמטודות פתוגניות של Entero, הפוך צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 100 על 15 מילימטר והניח שני דיסקים של נייר סינון במכסה הכלי ופזרו באופן שווה מיליליטר אחד של תרחיף הנוער או ה-IJ הזיהומי. על נייר המסנן, הוסף 10 אחרונים בזחלי כוכבים של עש השעווה הגדול יותר garia melanoma למנה כדי ליצור כ -100 עד 200

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

אנו מציגים שתי שיטות לחקלאים להתרבות המונית של נמטודות אנטומופתוגניות כקוטלי חרקים ביולוגיים. השיטה הראשונה משתמשת בג'ל פוליאקרילאמיד כמצע גידול הנמטודות, בעוד שהשנייה משתמשת בצמר גפן מצופה פולימר כמצע הגידול. שתי השיטות מתבססות על התרבות נמטודות בתוך גופות חרקים.

רבייה מבוססת גידול בחיים של נמטודות אנטומופתוגניות

Decellularization זלוף היא שיטה חדשנית לייצור פיגומים כבד כל כך שומרת על הרכב תאי מטריקס של איברים ארכיטקטורה. בזאת, השיטה של ​​הכנת פיגומים איבר שלם באמצעות decellularization זלוף ואכלוס הבאים עם hepatocytes מתואר. שתלי כבד פונקציונליים להשתלה ניתן להפיק באמצעות טכניקה זו.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

הבנייה המלאה של מנהג, בזמן אמת, מערכת סריקה confocal הדמיה מתואר. מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם בקלות עבור מיקרוסקופיה וידאו שיעור microendoscopy, מאפשר מערך של הגיאומטריות הדמיה ויישומים אינם נגישים באמצעות תקן מערכות confocal מסחרי, בכל חלק של עלות.

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

למד שיטות גידול של נמטודות entomopathogenic בטכניקות in vivo ובמבחנה. השיטות כוללות שימוש בזחלי עש השעווה ומצעי אגר עם חיידקים סימביוטיים. שיטות אלו מאפשרות הקמת תרביות EPN ומחקר יעיל של אינטראקציות מזיקים-מארחים.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

גלה סרטונים נוספים