Name: לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למדו שיטת דימוי חי לטווח ארוך של אקספלנטים שבלוליים מעכברי דיווח פלואורסצנטיים. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועות מורפוגנטיות ושינויי ביטוי גנים לאורך חמישה ימים בפרקי זמן של 30 דקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודה לך וילי שמש לקבלת סיוע טכני וד&quot;ר קריס Gellynck על הערות מועילות ושלושה מבקרים האנונימיים על העצה הבונה. עבודה זו מומנה על ידי יוזמת התחדשות השמיעה Sunnybrook

רקמת העכבר הייתה שנקטפו מן Sox2 EGFP -reporter עכברי 12 נשמרו ומורדמים בבהתאם להחלטת מועצה קנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. 1. Culturing עוברי Cochleae <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) על ידי ערבוב 8.89 מיליליטר של DMEM, 1 מיליליטר של סרום שור העובר (FBS), של 100x תוספת N2 100 μl, ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ציפרופלוקסצין. תוספת מלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) על ידי ערבוב 495 מיליליטר HBSS עם 5 מיליליטר של HEPES 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מנות תרבות תחתית זכוכית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימה למינרית, resuspend 200 מצע תמצית קרום במרתף μl ב 5 מיליליטר DMEM. הכן מנות תרבות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ&quot;מ עם 10 בארות מ&quot;מ. פיפטה מצע / DMEM 150 μl למרכזו של כל כוס תחתית צלחת. ניתן להשתמש בכלים אלה לאחר דגירה 40 דקות, או יכולים לאחסן בCO 2 </sub&gt; חממה ב 35 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפחות. הערה: זכוכית תחתית מנות משמשות מהסיבות הבאות: כדי להבטיח כי הבסיס של המנה הוא שקוף ומתאים להדמיה, כדי ליצור גם במרכז הצלחת, המאפשרת explants להתיישב באזור הממוקם בקלות ובסופו של דבר כך שלאחר ניסוי המדגם יכול להיות מעובד לimmunostaining וניתוח שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תחנת העבודה וכלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הספסל הנקי הזרימה למינרית, ולרסס למטה עם 70% EtOH ליצור מרחב עבודה נקי. משרים מלקחיים, כפות, וצלחת שחורה 184 אלסטומר סיליקון (תערובת של אלסטומר 184 סיליקון (10 חלקים), סוכן ריפוי (חלק 1) ואבקת פחם (2.5 גר &#39;)) בEtOH 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחנת העבודה נקייה, עוברי קציר לצורך הניסוי. איסוף עובר מההריון המתאים בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע איבר חיצוני או גלוי שידגיםפעילות וכתב לבחון את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניאון. לאסוף את העוברים שתערוכת פעילות עיתונאית בקרח HBSS הקר בתוספת HEPES 1% כמו אלה הם הנושא של הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עצמות זמניות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, תוך שימוש במקור אור מגניב ומלקחיים בסדר, לאסוף את ראשי הגורים. דואג לקליפ בחוליות הצוואר ומתחת ללסת כדי למנוע נזק לעצמות הזמניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את הגולגולת. הסר את המוח, לקצץ את החלק הקדמי של הראש, ולהעביר את הגולגולת האחורית לHBSS קרח הטרי הקר בתוספת HEPES% 1 בצלחת נקייה. לנתח בזהירות העצמות הזמניות צורת הבוטן מקפידים לשמור על מערכת שיווי המשקל בטקט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השבלול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העצמות הזמניות לצלחת מצופה אלסטומר סיליקון השחור בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES, להצמיד אזור שיווי המשקל של העצם. הכנס סיכות חרקים בזווית אלכסונית כדי לייצב את העצם הטמפורלית וליצור מקום למלקחיים. נעיצה היא צעד מכריע בתהליך כאילו העצם הטמפורלית מותר לנוע יותר מדי קשה מאוד למסוק שבלול בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הסחוס המקיף את שבלול האוזן. הכנס שן אחד המלקחיים לתוך הסחוס בקצה החיצוני של הבסיס של השבלול וקליפ חור בסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ דש בצד, להכניס את שן של המלקחיים ובעדינות להפריד את הגג של הצינור מהסחוס. קליפ אופקי לרוחב החלק העליון ואלכסון, והרימו בזהירות מהחלק הקדמי של הקפסולה. הכנס שיניים של המלקחיים בין הסחוס שנותר ואת הצינור בעדינות קליפ מהחלק האחרון. משטח הפסגה של השבלול נחשף עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, לתפוס את האזור שבו הגג של הצינור עומד באפיתל השבלול ולפתוח את צינור השבלול. לקלף בעדינות מהגג, זמירהבעת צורך, עד להסרה מוחלטת. חתוך את כל חלקים של קרום שנותר בצד המדיאלי של הצינור. נקה את הצינור של רקמת mesenchymal עודפת ולנתק את הצינור ממערכת שיווי המשקל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות explants: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח explant, משטח עד לומינל, במרכז צלחת תרבות תחתית זכוכית מצופה מצע, בזהירות לצייר את כל הנוזלים ולהשאיר למשך שתי דקות. להוסיף 150 μl בתוספת DMEM הירידה מבחינת לexplant, נזהר שלא להפריע לו. צריך explant לצוף חופשי, למקם מחדש עם מלקחיים, אבל דואג שexplant ישקע לתחתית הצלחת, כך שהוא יכול לצרף המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צלחות זכוכית תחתונה בצלחת פטרי בקוטר 12 סנטימטר עמוקה, עם מנה קטנה של מים סטריליים כדי לשמור על לחות. שים התרבויות לC חממת 35 ° לילה על מנת שexplant לצרף את המצע ולשטח. </li></ol></li></ol> 2. לגור מתאר לעצמיing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימות explant. השתמש במיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי להעריך את מצבו של כל שבלול explanted. לבחור רק explants בי הצינור שלם ומחובר לכוס מבסיס לקודקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החממה ב 35 ° C עם 5% CO 2 לרקמת שבלול התרבות. שים תרבויות למיקרוסקופ החממה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את DMEM בתוספת ולהחליף עם לפחות 500 μl תקשורת טרי. עבור הדמיה עד 6 ימים, 1-1.5 מיליליטר הוא טוב יותר. במקרים בהם explants הם מחוברים באופן רופף, פיפטה טבעת של תקשורת סביב הקצה של המנה. נוזל נוסף זה יגרום &quot;תא humidified &#39;זעיר מבלי להפריע explant בזמן שהוא ממשיך לצרף למטריצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, שימוש צירים צלחת מכסה כדי לפתוח את המכסים ואילו במנה נשאר בשלה ראוי במיקרוסקופ אם ריאגנטים צריכים להיות מוחלפים בהפסקות בין אוספי תמונות. כיסויי צלחת צירים לאפשר המכסים להיותנפתח מבלי להפריע דוגמאות או הסרת המנות מההגדרות שלהם. זה שומר את המיקום המדויק שלהם ללוכדים תמונה שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הכלים מזכוכית תחתונה המכילים דגימות מתאימות לבעל צלחת מדגם. מיקרוסקופ בדוגמא זו יש פלטפורמה מסתובבת שמחזיקה שמונה מנות מדגם 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מכסה המנוע הזרימה למינרית להחליף את מכסי פלסטיק עם מכסי זכוכית והכנס את המנות לבעל צלחת מדגם. הנח את בעל צלחת מדגם בתוך מטפל חממה שלא לעקור את explants מהחלק התחתון של המנה או להפריע לתקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שגרת ההדמיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ, מנורת UV ומצלמה ופתח את תוכנת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הדגימות, לאסוף אזור הדמיה, מטוס של מוקד ולהתאים זמני חשיפה לכל מנה ברצף. בחר המטוס של מוקד תלוי לא רק במבט של explant בעת ההתחלה, אבל אלכך בהתחשב באופן שבו הרקמה תעבור וכמה זמן כמובן הזמן ירוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר ערימת Z שבמרכזו מישור המוקד הנבחר בערוץ הקרינה. הגדר את התדירות ואורך הדגימה לצורך הניסוי. תדירות הדגימה תהיה מוגבלת על ידי הזמן שנדרש כדי לאסוף תמונות, כך זה צריך להיקבע לאחר בחירת שדות מבט והגדרת ערימת Z. במקרה זה דגימה מתקיימת בכל 30 דקות על פני חמישה ימים. משך הניסוי יכול להיות עד 14 יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור סרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הזמן לשגות לפתוח את קבצי תמונה. במקרה זה תוכנת Metamorph שנפתחה נקודות איסוף רציפות משמשת. פריים אחר פריים לבחור את מישור המוקד הטוב ביותר להצגת אוכלוסיית התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונות אלה לקובץ .avi, או לייצא אותם כמונטאז &#39;כדי ליצור סט של תמונות שניתן לפתוח ונותחו בתוכנת עיבוד תמונה או להמרה לפורמה מרובהTS באמצעות תוכנת עיבוד וידאו. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li>
<li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auditory+sensory+epithelium%3A+the+instrument+of+sound+perception%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li>
<li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li>
<li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+for+canonical+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li>
<li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+%3A+the+official+journal+of+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+of+America%2C+Microbeam+Analysis+Society%2C+Microscopical+Society+of+Canada%22%5BJournal%5D)">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6(2013).</li>
<li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li>
<li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li>
<li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly%28dimethylsiloxane%29+microwells+and+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+sterility%22%5BJournal%5D)">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li>
<li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

ישנן מספר נקודות טכניות לשקול בעת תרבויות הוקמו ובהקמת מיקרוסקופ הזמן לשגות במטרה להדמיה לטווח ארוך. אנו משתמשים במטריצת קרום במרתף כמצע לculturing explants שבלול, אבל המצע צריך להיות מותאם לסוג התא. לדוגמא, לתרבויות עצביות תמונה, זה יכול להיות טוב יותר כדי לספק ציפוי פיברונקטין. צריכה להיות גם נבחרו טמפרטורת דגירה ובהרכב גז בהתאם לסוג רקמה. בחירת גיל explant חשובה. אנחנו מתחילים בE13 בבית המוקדם, כי על E12 כיוון...

השבלול של היונקים הוא איבר מורכב הורה מאוד. בעכבר, בין הופעתה של האוזן הפנימית הפרימיטיבית משלפוחית ​​otic ביום E11 והשלמת התכנית התפתחותית בשלבי לידה מוקדמים, גלים רבים של איתות תא ושינויים מתואמים בביטוי גנים יתקיימו. פועל מבסיס לקודקוד צינור השבלול הוא הצליל זיהוי האפיתל חושית, או איבר של קורטי. פיתוח של האיבר של קורטי נשלט להפליא כך שעד סוף הפיתוח, זה יהיה מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים, שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים וביניהם חמש שורות של תאי תומכים (שתי שורות של תאי עמוד, שלוש שורות של התאים &#39;Deiters) 1. סטייה מתוצאות סדר המדויקת הזה בירידה בשמיעה, heighlighting חשיבות studye הצטברו בראשית ודפוסים של epithemlium החושי 2. בתרבית במבחנה של coch העכבר העוברילאה היא כלי חיוני בחקר המנגנונים של התפתחות של האיבר של קורטי. טכניקה זו הוקמה בשנת 1974 ובמשך 40 השנים האחרונות, נעשתה שימוש כדי להבהיר רבים מהמנגנונים שבאמצעותם האפיתל החושית מצוינת והאיבר של הקורט הוקמו 3. השבלול הוא איבר מורכב עם תהליכים התפתחותיים דינמיים; מניפולציה עשויה להימשך עוד כשבעה ימים כדי להגשים 1. לדוגמא, בעת הוספת מעכבי 3β GSK לתרבות explant שבלול בE13, תקופת הדגירה האופטימלית להתבונן השפעה חזקה של המתחם היא שישה ימים 4. הדמיה חיה של שבלול הפיתוח מאפשרת חקירת שינויים במורפולוגיה של האיבר של קורטי, שינויים בביטוי גנים, מעקב נודד, מתרבים או למות תאים, וזה מאפשר התבוננות בזמן אמת של התוצאות של סוכני תרופות ושיבוש האיתות מסלולים. עד עכשיו, לחיות הדמיה של השבלולבעיקר שבוצע באמצעות מיקרוסקופ confocal לאזורים קטנים תמונה של האיבר של קורטי על פני תקופות זמן קצרות 5-8, אבל טכניקה זו יש מגבלות בשל כדאיות explant. בהדמיה של ההשפעות של מניפולציות לטווח ארוך יותר על תהליכים ההתפתחותיים איטיים, סביבת ההדמיה היא קריטית. בדרך כלל מערכת הדמיה חיה confocal משתמשת קופסא פלסטיק humidified שיושב על המיקרוסקופ. חום ולחות יכולים לברוח דרך הפערים בתיבה דוגרות במפגש שולחן מיקרוסקופ, דרך חלונות הגישה, דרך פתחי צירים ודרך הפערים סביב חלקים שונים של microscope- כגון אובייקטיבי או מקור האור. זה לא אופטימלי לשמירת explants הבריא יותר מימים או שלוש. אנו מגדירים &quot;מיקרוסקופ חממה &#39;כמיקרוסקופ הפוכה אטומה בתוך CO 2 באינקובטור סטנדרטי, ולא חממה שנבנתה סביב מיקרוסקופ. לשעבר מיקרוסקופ החממהנוטה החיים של הניסוי כזה שלא הדמיה על שניים או שלושה ימים, ניתן הדמיה דגימות לתקופה של עד שבועיים. מיקרוסקופ חממה מספק סביבה מצוינת לצמיחה והתמיינות של תאים, עם הפרעה מינימאלית לexplant תרבויות ותנאים סטנדרטיים מבוקר. במחקרים שיתקיימו במשך ימים רבים זה מקובל לפנות לדגימות הדמיה על בסיס יומי על ידי הוצאתם מהחממה ונשא אותם למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בעוד גישה זו יכולה לעבוד, הסרת המנות מהחממה גורמת ללחץ על רקמת הפיתוח רגישה. שינויים בחומציות של מדיום התרבית ותנודות טמפרטורה בשל ההסרה מן החממה יכולים לגרום להתפתחות תת אופטימלית ורקמות בריאים. הדמיה באותו האזור באותו מישור המוקד ובאותו כיוון בכל נקודת זמן היא מאוד מאתגרת. על ידי שימוש במערכת אוטומטית בתוך חממה, ניתן לשמור על בריאותרקמה, כדי לאסוף תמונות הנמצאות בנקודתי זמן ולהבטיח כי אותו האזור שנתפס בכל מסגרת. בשנים האחרונות כמה חממות רקמת מיקרוסקופ משולבות פותחו, אלה היו שימושיים לא רק בפרקטיקה קלינית 9 אלא גם בתאי גזע וסרטן מחקר 10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה לחיות לטווח הארוך של explants שבלול עכבר העוברי. אנו משתמשים במערכת מיקרוסקופיה אוטומטית בתוך חממת CO 2 סטנדרטית שיש לו את היכולת ללכוד תמונות של דגימות מרובות בנקודות זמן מוגדר. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ הפוך להגדיר בתוך חממה. דגימות ממוקמות בבמה מסתובבת המאפשרת הדמיה של דגימות מרובות בכל נקודת זמן. תאורה, לכידת תמונה, והסיבוב של הבמה נשלטות על ידי מערכת אוטומטית המופעלת באמצעות תוכנת Metamorph. על ידי הגדרה שגרתית הדמיה באמצעות תוכנת ההפעלה אנו יכולים להגדיר ניסוי כדי לרוץ עד TWשבועות o עם התערבות אנושית מינימאלית. בדוגמא זו אנו משתמשים הן שדה הקרינה בהירים להציג צמיחה בקנה מידה גדולה וסידור מחדש של השבלול, ובאופן ספציפי, באזור prosensory. בניסוי זה, cochleae יהיה גזור מעכברי כתב Sox2 EGFP ביום עוברי E13. תרבויות במבחנה תוקמנה ולאחר מכן צילם במשך חמישה ימים.

<table><tbody><tr><td>מדיה נשר שונה של Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>מותגים מרובים מייצרים</td></tr><tr><td>תמצית קרום מרתף זו&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td>מטריגל. מוצרים דומים חלופיים זמינים מספקים אחרים. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|חוץ-תאי+מטריקה+חלבונים+ECMs+ו+התקשרות+גורמים%28מדעי החיים%29|מטריג'ל + מרתף + ממברנה + מטריקס + %28מדעי החיים %29</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>מספר מותגים מייצרים את זה http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage = 15& השלמה אוטומטית=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>מותגים מרובים מייצרים את זה http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& השלמה אוטומטית =</td></tr> <tr><td>100 x N2 תוספת</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>מותגים מרובים מייצרים את זה http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage = 15& autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>מותגים מרובים מייצרים את תמיסת > http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA<המלח</td></tr><tr><td>המאוזנת של האנק</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>מספר מותגים מייצרים זאת. יש לחדש לפני השימוש. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11254-20</td><td>מספר גודל 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&nbsp;</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10080-05</td><td>גודל 1 מ"מ&nbsp; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118</td></tr><tr><td>סיכות חרקים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26001-35</td><td>חייבים להיות נירוסטה http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 מ"מ כלי פלסטיק</td><td>קורנינג / פלקון</td><td>351006</td><td>מותגים מרובים מייצרים</td></tr><tr><td>פחם</td><td>זה סיגמא אולדריץ'</td><td>05105-250G</td><td>מספר מותגים מייצרים פריטים דומים http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>184 אלסטומר סיליקון</td><td>Dow/Corning&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; ערכת אלסטומר סיליקון 184</td><td>המנות מתוצרת בית מספר שבועות מראש.&nbsp; אלסטומר סיליקון יכול להיות מכל ספק.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td></tr>כלי <tr><td>תחתית מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>מידות המנה נקבעות על פי המפרט של מערכת ההדמיה.&nbsp; קוטר 35 מ"מ, 10 מ"מ היטב, כיסוי מספר 0 מתאים לאולימפוס Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&nbsp; דגם סטמי 2000. מותגים מרובים מייצרים פריטים דומים http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>מקור אור קר</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>מותגים מרובים מייצרים פריטים דומים http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>מיקרו-מערכות Leica</td><td>צור קשר עם Leica microsystems Leica</td><td>M165-FC. מותגים רבים מייצרים פריטים דומים http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr> <tr><td>Incubator מיקרוסקופ + תוכנת הדמיה</td><td>אולימפוס</td><td>צור קשר עם אולימפוס</td><td>מיקרוקופה הפוכה אטומה בתוך חממת CO2. מיקרוסקופ חממה Vivaview FL עם תוכנת הדמיה Metamorpoh. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0</td></tr><tr><td>ספסל נקי</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>מותגים מרובים מייצרים פריטים דומים http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>מותגים מרובים מייצרים פריטים דומים http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>קולט אדים Laminar Flow</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>מותגים מרובים מייצרים פריטים דומים http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של explants שבלול העכבר

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

כאן אנו מציגים שיטה להדמית הזמן לשגות ארוך טווח של explants שבלול עכבר העוברי בשידור חי. תכנית התפתחותית אחראית על בניית מבנה הורה מאוד, מורכב מתמורת השבלול של יונקים לכעשרה ימים. על מנת ללמוד את השינויים בביטוי הגנים על פני תקופה זו ותגובתם לתרופות או מניפולציה גנטית, הדמיה לטווח ארוך יש צורך. בעבר, הדמיה חיה יש בדרך כלל מוגבלת על ידי יכולת הקיום של רקמת explanted בתא humidified על גבי מיקרוסקופ רגיל. קושי בשמירה על תנאים אופטימליים לצמיחת תרבות בכל קשור ללחות וטמפרטורה יש להציב מגבלות על האורך של ניסויי הדמיה. מיקרוסקופ המשולב בתרבית רקמת חממה שונה מספק סביבה מצוינת להדמיה לטווח ארוכה וחי. בשיטה זו אנו מדגימים כיצד להקים explants שבלול עכבר עוברי וכיצד להשתמש במיקרוסקופ חממה לנהל imagi הזמן לשגותng באמצעות שני שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון את התנהגותו של יום עוברי טיפוסי (E) 13 explant שבלול וSox2, סמן של תאי prosensory של השבלול, מעל 5 ימים.

כאן אנו מראים מונטאז '(איור 1) וסרט (איור 2) המדגים כיצד explant שבלול organotypic טיפוסי יגדל אם מצופה על E13.5. עכבר כתב Sox2 שימש כדי להמחיש את אזור prosensory. הסרט ממחיש כי השבלול עובר צמיחה והתכנסות וסיומת, לא נראים התאים באזור הלטרלי של תחום Sox2 הירוק לחלק כמו הרקמה המקיפה אותה מתרחב. זהו מאפיין של האיבר של קורטי; על E13 האפיתל החושית הפוטנציאלי יוצאת מחזור התא, והוא ידוע בהמשך כאזור של אי-הפצה 13. ניסוי הזמן ל...

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות שבלול עוברי שנלקח מעכבר מדווח פלואורסצנטי במרווחים של 30 דקות במשך חמישה ימים. זה מושג על ידי קצירת שבלול עוברי ביום 13 מעכברים מדווחים פלואורסצנטיים. לאחר מכן, השבלול מתורבת במבחנה.לאחר מכן ממקמים את תרביות השבלול במיקרוסקופ אינקובטור. לבסוף, מוגדרת שגרת הדמיה אוטומטית והשבלול E מצולם. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהדמיה ארוכת טווח של תרביות שבלול כדי להראות תנועות מורפוגנטיות של אפיתל השבלול בכללותו, כמו גם שינויים בביטוי הגנים המדווחים לאורך זמן, וההשפעות של חומרים פרמקולוגיים איטיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו צילום ידני של תרבויות קרנות X לאורך זמן הוא שמערכת זו אוטומטית לחלוטין. זה מאפשר לאסוף יותר נקודות זמן, וזה מבטיח שאותו אזור של השבלול או קבוצת התאים יצולם באותו כיוון בכל נקודת זמן, כל זאת תוך כדי גידול באינקובטור תרבית רקמה לא סדיר. לאחר השלמת מדיום הנשר המותאם של KO או DMEM ותמיסת מלח האיזון של האנק או HBSS בהתאם לפרוטוקול הטקסט הנלווה.מתחת למכסה זרימה למינר, השתמש בחמישה מיליליטר של DMEM בתוספת unsu כדי להשעות מחדש, 200 מיקרוליטר של פיפטת מצע קרום מרתף 150 מיקרוליטר למרכז כל באר של 10 מילימטר של צלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. דגירה במשך 40 דקות בחממת CO2 בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. להכנת עמדת העבוד

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את התהליך לבידוד צמחי גנגליון ספירליים מהאוזן הפנימית וטיפוחם יחד עם איבר קורטי במערך מרובה אלקטרודות. גרעיני ספירלה מופקים בקפידה ונחתכים לחלקי רקמות קטנים יותר או לצמחים. צמחים אלה מתורבתים על האזור הפעיל של מערך האלקטרודות כדי לקדם צמיחה של תהליכים עצביים.

גידול נוירונים של גנגליון ספירלי מורין על מערכים מרובי אלקטרודות

מקור: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. הדמיית זמן-lapse של ארבוריזציה עצבית באמצעות תיוג דליל של וירוסים הקשורים לאדנו. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש דינמיקה דנדריטית בצמחי רשתית של עכבר חי. הוא מתאר את השלבים לייצוב הרשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ביצוע הדמיה אפיפלואורסצנטית כדי לדמיין אינטרנוירונים אמקריניים של התפרצות כוכבים, ולכידת תמונות תלת מימד בהילוך מהיר כדי לנטר שינויים במורפולוגיה דנדריטית אמקרינית.

הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

למדו שיטת דימוי חי לטווח ארוך של אקספלנטים שבלוליים מעכברי דיווח פלואורסצנטיים. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועות מורפוגנטיות ושינויי ביטוי גנים לאורך חמישה ימים בפרקי זמן של 30 דקות.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

גלה סרטונים נוספים