לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות שבלול עוברי שנלקח מעכבר מדווח פלואורסצנטי במרווחים של 30 דקות במשך חמישה ימים. זה מושג על ידי קצירת שבלול עוברי ביום 13 מעכברים מדווחים פלואורסצנטיים. לאחר מכן, השבלול מתורבת במבחנה.

לאחר מכן ממקמים את תרביות השבלול במיקרוסקופ אינקובטור. לבסוף, מוגדרת שגרת הדמיה אוטומטית והשבלול E מצולם. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהדמיה ארוכת טווח של תרביות שבלול כדי להראות תנועות מורפוגנטיות של אפיתל השבלול בכללותו, כמו גם שינויים בביטוי הגנים המדווחים לאורך זמן, וההשפעות של חומרים פרמקולוגיים איטיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו צילום ידני של תרבויות קרנות X לאורך זמן הוא שמערכת זו אוטומטית לחלוטין. זה מאפשר לאסוף יותר נקודות זמן, וזה מבטיח שאותו אזור של השבלול או קבוצת התאים יצולם באותו כיוון בכל נקודת זמן, כל זאת תוך כדי גידול באינקובטור תרבית רקמה לא סדיר. לאחר השלמת מדיום הנשר המותאם של KO או DMEM ותמיסת מלח האיזון של האנק או HBSS בהתאם לפרוטוקול הטקסט הנלווה.

מתחת למכסה זרימה למינר, השתמש בחמישה מיליליטר של DMEM בתוספת unsu כדי להשעות מחדש, 200 מיקרוליטר של פיפטת מצע קרום מרתף 150 מיקרוליטר למרכז כל באר של 10 מילימטר של צלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. דגירה במשך 40 דקות בחממת CO2 בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. להכנת עמדת העבודה והכלים, הפעל את הספסל הנקי של הזרימה הלמינרית והשתמש באתנול 70% כדי לרסס אותו ולהשרות מלקחיים, כפיות וכלי מצופה סיליקון שחור.

בתחנת העבודה הנקייה, קצרו עוברים מההריון המתאים בקרח. HBSS קר בתוספת 1% ערימות. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, זהו עוברים המציגים פעילות מדווחת חיצונית או בתוך איבר גלוי והעבירו אותם ל-HBSS קר כקרח עם ערימות של 1% לאיסוף עצמות זמניות, באמצעות מקור אור קריר ומלקחיים עדינים.

עבדו במהירות כדי להצמיד את חוליות צוואר הרחם ומתחת ללסת כדי לאסוף את הראשים. לאחר איסוף ראשי העוברים על פי פרוטוקול הטקסט, פתח בזהירות את הגולגולת, ואז הסר את עיטור המוח מהחלק הקדמי של הראש והעביר את הגולגולת האחורית לצלחת עם קרח טרי. קר. HBSS ערימות, מנתחים בזהירות את העצמות הטמפורליות בצורת בוטנים, דואגים לשמור על מערכת שיווי המשקל שלמה.

כדי לנתח את השבלול, העבירו את העצמות הטמפורליות לכלי מצופה אלסטומר סיליקון שחור בערימות HBSS קרות כקרח. הצמד את אזור שיווי המשקל של העצם על ידי החדרת סיכות בזווית אלכסונית על מנת לייצב את העצם הטמפורלית וליצור מקום למלקחיים. לאחר מכן, הסר בזהירות את הסחוס המקיף את השבלול על ידי החדרת קשר אחד של המלקחיים לסחוס בקצה החיצוני של בסיס השבלול, וקיצוץ חור בסחוס.

הצמד אופקית לרוחב החלק העליון ובאלכסון והרם בזהירות את החלק הקדמי של הקפסולה. הכנס חוד של המלקחיים בין הסחוס שנותר לצינור, וחתוך בעדינות את הסחוס שנותר. המשטח האפיקלי של השבלול חשוף כעת.

החל מהבסיס, תפוס את האזור שבו גג התעלה פוגש את אפיתל השבלול ופתח את צינור השבלול. מקלפים בעדינות את גיזום הגג במידת הצורך עד להסרה מלאה. חתוך את כל חלקי הממברנה שנותרו בצד המדיאלי של הצינור.

לאחר מכן נקו את הצינור מעודפי רקמה מזנכימלית ונתקו את הצינור מהמערכת הווסטיבולרית לשתלי תרבית. הנח משטח לומינלי אחד למעלה במרכז צלחת תרבית תחתית זכוכית מצופה מצע. שואבים בזהירות את הנוזל ומשאירים למשך שתי דקות.

ואז טיפה. הוסף 150 מיקרוליטר של DMEM בתוספת להסבר X, הקפד לא להפריע לו כדי שיוכל להתיישב על המצע. מניחים את כלי הזכוכית התחתונים בצלחת פטרי עמוקה בקוטר 12 ס"מ עם צלחת קטנה של מים סטריליים לשמירה על לחות.

הכניסו את התרביות לאינקובטור של 35 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מנת שהאקספלן יתחבר למצע וישטח לביצוע הדמיה חיה. לאחר בחירת הדגימות, השתמש במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי להעריך את מצבו של כל שבלול שהושתל ובחר רק צמחים שבהם הצינור שלם ומחובר לזכוכית מהבסיס לקודקוד. הגדר את החממה ל-35 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לתרבית.

רקמת השבלול שואבת בעדינות את ה-DMEM התוסף מהתרביות ומחליפה אותו ב-500 מיקרוליטר לפחות, מדיום טרי. במקרים בהם ההסבר מחובר באופן רופף, פיפטה טבעת של מדיום סביב קצה המנה. הנוזל הנוסף הזה ייצור תא לחות מיניאטורי מבלי להפריע לתצוגה בזמן שהוא ממשיך להיצמד למטריצה.

למיקרוסקופ בדוגמה זו יש פלטפורמה מסתובבת המחזיקה 8 צלחות דגימה של 35 מילימטר מתחת למכסה הזרימה הלמינרית. החלף את מכסי הפלסטיק במכסי זכוכית והכנס את הכלים למחזיק הכלים לדוגמה. אם יש צורך להחליף את המדיה במהלך הניסוי.

כדי להימנע מהפרעה לאקספלור, השתמשו בכיסויי כלים צירים שיאפשרו פתיחת המכסים בזמן שהצלחת נשארת בהתאמתה במיקרוסקופ, הניחו את מחזיק צלחת הדגימה בתוך מיקרוסקופ החממה, והקפידו לא לעקור את האקספלן מתחתית הכלי או להפריע למדיום. כדי להגדיר את שגרת ההדמיה, הפעל את המיקרוסקופ UV lamp ואת המצלמה ופתח את תוכנת ההדמיה. עבור כל דגימה שנמצאה, בחר מישור אזור הדמיה של מיקוד וחשיפה, תוך התחשבות לא רק במראה האקספלן בזמן ההתחלה, אלא גם כיצד הרקמה תנוע במהלך הריצה.

בערוץ הקרינה, הגדר ערימת Z שבמרכזה מישור המוקד שנבחר. לאחר מכן הגדר את תדירות ואורך הדגימה לניסוי. זה יוגבל על ידי הזמן שלוקח לאסוף תמונות כדי ליצור סרט בסוף פרק זמן.

השתמש בתוכנה כגון METAMORPH כדי לפתוח את קבצי התמונה לדוגמא מסגרת אחר מסגרת. בחר את מישור המוקד הטוב ביותר להצגת אוכלוסיית התאים המעניינת. לבסוף, המר את התמונות לנקודה קובץ VI, או ייצא אותן כמונטאז' כדי ליצור סט תמונות שניתן לפתוח ולנתח בתוכנת עיבוד תמונה או להמיר לפורמטים אחרים.

מוצג כאן סרט המדגים כיצד שבלול אורגנוטיפי יגדל אם הוא מצופה. ב-E 13.5 נעשה שימוש בעכבר SOX שני מדווח כדי להמחיש את האזור החושי המקצועי כפי שנראה בירוק כאשר התאים של האזורים הלא-חושיים מתחלקים ונעים. האזור החושי הלא מתפשט בירוק עובר סידור מחדש של רקמות ותנועות הרחבה מתכנסות

ניסוי דולג זמן שני המתמקד בבסיס האמצעי של אקספלן שבלול אחר מדגים שככל שהוא מרחיב את היתרונות. האזור החושי מצטמצם בתרבית הראשונה. עובי הרקמה מאפשר לזהות אזורי ביטוי אך לא תאים בודדים.

עם זאת, לאחר שלושה ימים בתרבית, הרקמה השתטחה במידה ניכרת, מה שמאפשר לדמיין תאים פלואורסצנטיים בודדים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה אימונו-פלואורסצנטית או מיצוי חלבון ו-RNA על מנת להעריך שינויים בביטוי גנים ברמה המולקולרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לנתח ולתרבית שבלול וכיצד להשתמש במיקרוסקופ אינקובטור כדי לבצע הדמיה חיה על פני תקופה של ימים.