Name: רומן במבחנה מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: למד את שיטת מודל הדם-אנדותל במבחנה לחקירת אינטראקציות בין תאי דם אנושיים לאנדותל. שיטה זו מאפשרת הערכת קרישה וגיוס תאי דם לבן במחקר מחלות כלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה השבדית למחקר (90293501, A0290401, A0290402), השביעית תכנית המסגרת של הקהילה האירופית במסגרת הסכם מענק N ° 602,699 (Direkt), קרן NovoNordisk, Brunnberg קרן Gurli ואדוארד, גזע תרפיה, Vleugel קרן וÅke Wiberg קרן.

הערה: דם נשאב מאנשים בריאים על ידי venipuncture מערכת הפתוח באישור בועדת האתיקה הסקירה באופסלה (הרשאה מס &#39;2008/264). 1. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים אנושיים עיקריים וריד טבור אנדותל (HUVEC) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בצלוחיות T75 מצופים בג&#39;לטין 1% ב- pH 7.4 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מבקבוק T75 המכיל HUVEC (או סוג אחר של תאי האנדותל אנושיים ראשוניים) ולשטוף את התאים עם 2.1 mM EDTA בpH PBS 7.4. ניתוק תאים על ידי הוספת 1 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA ודוגר במשך 2 - 3 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי שטיפת הבקבוק עם FBS 9 מיליליטר 10% ב- pH 7.4 PBS ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מיליליטר. ספין למטה התאים ב 735 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בזהירות בכלי דם בינוני צמיחת תאי אנדותל (EC GMMV) ולספור את התאים בתא &quot;שודד גופות. זרעי 21,000 גאמות / 2 סנטימטר בשקופיות תרבית תאי 1 היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. HUVEC יהיה מחובר אחרי 1 - 2 ימים של התרבות. צג המורפולוגיה של תאי confluency יומי תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 2. הכנה של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל המשטחים המלאכותיים שיהיו במגע עם דם בשכבה כפולה של הפרין המשותק (CHS) על פי הוראות היצרן. חומרים מצופים CHS המוגן מפני אבק יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד 6 חודשים ללא הפסד של פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש venipuncture מערכת הפתוח עד זוב דם מתורם בריא זמן קצר (&lt;30 דקות) לפני תחילת ניסוי תא אנדותל דם. זוג מחט מזרק (18 G x 50 מ&quot;מ) לצינורות CHS סיליקון המצופה (קוטר פנימי: 2 מ&quot;מ) לפני האיסוף בזהירות דם בצינור מיליליטר 50 CHS מצופה. דם מוסף עם הפרין unfractionated להגיע לריכוז סופי של 0.75 IU / ml. מערבבים את הדם בעדינות על ידי inverting הצינור 2 - 3 פעמים. </li></ol> דגם 3. דם האנדותל הלשכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק תאי דם (איור 1 א; מבט מלמעלה) בmethacrylate אקריליק polymethyl (PMMA) מורכב משני צילינדרים (גובה 8 מ&quot;מ ורדיוס 9 מ&quot;מ) שמודבקים לשקופית PMMA (25 x 75 מ&quot;מ). התאם את הקצוות של הגלילים כלפי מעלה עם טבעות אטימות מגומי כדי לאטום את חדר הדם נגד שקופיות זכוכית עם תאים בתרבית האנדותל (איור 1). סובב את תאי דם הקשורים לשקופית התרבות עם תאי האנדותל לאחר מכן במצב אנכי (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה CHS מצופה להעביר 1.5 מיליליטר דם לכל CHS המצופה בלטפל קאמרי שלא להפעיל את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דם 1 מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 30 μl 0.34 ח&quot;כ 3 EDTA להגיע ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ K EDTA 3 לקביעת ריכוזי חלבון פלזמה הראשונית באמצעותאנזים קשור assay immunosorbent (ELISA). לערבב בזהירות את הדם ולשמור על הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קירות הפלסטיק של שקופיות זכוכית תרבית תאים על פי הוראות יצרן ובזהירות לשטוף את התאים בpH PBS 7.4. הקפד להסיר לאחר מכן הרבה נוזלים ככל האפשר מהשקופיות. אל תתנו לתאים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על גבי תאי הדם, תאים מול הדם. אבטח את השקופיות על ידי הצבת מהדק סביב תא התא האנדותל דם. השתמש בשקופית פלסטיק לתמיכה נוספת כדי למנוע שבירה של שקופיות זכוכית תרבית תאים בעת ביצוע המהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את תא התא האנדותל דם על גלגל מסתובב (40 סנטימטרים קוטר) מקום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. סובב כל תא בגלגל ברמה של 0.5 XG למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לפרק את תא התא האנדותל דם. שטוף את שקופיות תרבית התאים בpH PBS 7.4 ולתקן את התאים בparaformaldehyde 1% קרים כקרח (PFA) ואו 10 דקות. העברת דם מיליליטר 1 מכל תא לmicrocentrifuge צינורות המכילים 30 μl 0.34 EDTA ח&quot;כ 3 כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mM EDTA K 3 ולערבב בעדינות את הצינורות. שמור את הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב4,560 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר את הפלזמה הדם לצינורות microcentrifuge חדשים וחנות ב-70 ° C עד לניתוח נוסף. </li></ol> 4. ניתוח של דם האנדותל אינטראקציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים immunofluorescent עם CD16 אנטי אנושי בעכבר ואחריו עז משניים אנטי העכבר Alexa 488 וphalloidin-TexasRed. בצע כל שלב צביעה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף את השקופיות בpH PBS 7.4 בין כל שלב ושלב. Counterstain הגרעינים עם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. ניתוח מרכיבי דם קשור לתאי האנדותל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה כגון CellProfiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantify התגובות בתא הדם עם תרומבין-באנטי-טרומבין (TAT) ELISA לפי הוראות יצרן של דגימות הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים סטטיסטיים מתאימים, לדוגמא., מבחן t מזווג, כדי לנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> אינטראקציות רבות בין הדם ודופן כלי דם הן בדרך כלל נשמרו במצב שקט בשל האופי הלא דביק ואנטי-טרומבוטיים של האנדותל. 7 במצבים פתולוגיים כוללים דלקת, האנדותל מופעל עם עלייה וכתוצאה מכך ביטוי הקולטן הידבקות 8 ו יכולת מופחתת לעכב עצירת דימום. 9 הפעלה של מערכות המפל בדם בתורו מגבירה את thrombogenicity של האנדותל גורמת גיוס פקקת וויקוציטים נוספים. 10 כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי גומלין עדינים בין תאי האנדותל וכל דם, שיש לנו פיתח רומן בשיטה חוץ גופית שבו תאי אנדותל בתרבית ממוקמים במגע עם דם כל. למיטב ידיעתנו, ההגדרה שלנו היא הראשון שהראתה תאי האנדותל מודגרות עם כל דם אנושי עם שום או נוגד קרישה מעט מאוד לתקופות זמן ארוכות יותר. NT &quot;&gt; הרגישות של מערכת זו מופעלת על ידי venipuncture מערכת הפתוח בשילוב עם שכבת המגן של הפרין משותק על כל המשטחים הונחו במגע עם דם. השימוש במערכת פתוחה ברכש דם מפחיתה את ההפעלה של מערכות המפל במהלך venipuncture תוך התרת השימוש בסכום שנקבע עצמי של נוגדי קרישה. ייתכן, עם זאת, לשמש צינורות דם פונו זמינים מסחרי בהתאם לנקודות הקצה המיועדים של המחקר. הריכוז הסופי של נוגד קרישה הוסיף לצינורות מערכת הסגורים ביותר הזמינים מסחרי עלולים לעכב רגיש , ואחרת קשה ללמוד, אינטראקציות בהתקנה. 6 משטח הפרין מגן נוסף מבטל הפעלה של דם דרך שטח מגע על ידי כל משטחים אחרים מאשר תאי האנדותל. 5 ואכן, דגירה של דם מלא בתוספת כמות קטנה של הפרין unfractionated ב חדר ללא ההגנה של CHS הביא להיווצרות קרישים. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בועת האוויר בתוך החדר מאפשרת ערבוב של הדם במהלך דגירה עם תאי האנדותל. על מנת להעריך את ההשפעה של גודל בועת האוויר, השתמשנו בשני כרכי דם שונים. במודל זה, מדדנו רמות TAT דומות ללא קשר לגודל בועת אוויר בתאים הודגרו עם HUVEC. TAT היה, לעומת זאת, גדל עם גודל בועת האוויר קטן יותר ברגישות היתר לאלרגיה באופן מלא טופל תאים. זה, בהתאם למאפייני תא אנדותל שתוארו קודם לכן 11, מצביע על השפעה רגולציה על ההפעלה המוגברת של קרישה הניתנת על ידי תאי האנדותל שחסר בחדר CHS אינרטי. בועת האוויר במערכת יוצרת זרימה על מחזור של החדר. גודלה של הבועה ישפיע על הכוחות בתוך מערכת זו מסתובבת. זה מוצג על ידי התוצאות שלנו באיור 2 ד היו בועה קטנה יוצרת ערכי TAT גבוהים המייצגים כוח ירד על כלומר הדם, זרימת הדםבתוך התא הוא נמוך יותר ובכך שהפעיל מערכת המפל מתרחש למידה גבוהה יותר. יש לציין כי במערכת זו אנו יוצרים זרימה מסתובבת שתהיה שונים במהירות על פני החדר עם המהירות הגבוהה ביותר לאורך הקירות, והנמוך ביותר במרכז. זה כמובן לא סביבה אופטימלית בכל קשורה לזרימה ולחץ גזירה לתאי אנדותל, אבל עדיין יש לנו מערכת הפקת תוצאות יציבה ודיר. תנאים יותר אופטימליים יכללו במחזור הזרימה למינרית בהעדר המערבולת. זהו, עם זאת, לא ניתן במודל המיוצג כאן ולידיעתנו על מערכת כזו היא לא זמינה עד כה. אמנם, יש כמה מערכות מייקרו-נוזליות זמין מסחרית שאינן ניתן לשלב עם כל דם נמוך עם שום או רמות של נוגד קרישה נוספה למערכת ובכך נכשל כדי לאפשר הערכה נאותה רגישה של יחסי הגומלין בין כל הרכיבים הנמצאים בדם ותאי האנדותל. יתר על כן, חלה עלייה של פי 2 בגיוס של תאי דם לכיוון TNFα מופעל HUVEC בשילוב עם היווצרות הוכפלה של תאת באופן בלתי תלויה בנפח הדם. זה מוודא את יציבות של מערכת המודל וגם מראה את האפשרות להשתמש האנדותל מופעל בשילוב עם כל דם. עתיד על, תא התא האנדותל דם יכול לשמש כדי לחקור גיוס תאי דם לכיוון תאי האנדותל המופעלים על ידי מגוון רחב של סמנים הביעו על תאים בתנאים ובשלבי הפעלה שונים. יתר על כן, המודל יכול לשמש בשילוב עם סוכנים תרופתיים על מנת לבדוק את ההשפעות על מצבים דלקתיים. לסיכום, אנו מציגים את היתרון הגדול של שילוב מודל קאמרי עם תאי דם וכלי דם אנושיים כדי ליצור אדם שלם במערכת חוץ גופית לבצע חקירות רלוונטיות למחלות כלי דם.

שיטות לניתוח אינטראקציות דם וכלי דם במחלות לב וכלי דם, בדרך כלל כרוכות בניסויי מחקר בבעלי החיים. תוצאות שנוצרו במודלים של בעלי חיים מחקר ניסיוניים עשויות, עם זאת, יש לי משמעות קטנה או לא למחלות בבני אדם. 1,2 ככזה, יש צורך בטוב ואמין במודלים חוץ גופית לחקור אינטראקציות הסלולר בין תא הדם ותאי האנדותל של כלי דם ב מערכת כמו בני-. לפיכך, אנו הקמנו מודל תא תא האנדותל דם. זה מבוסס על מודל שתואר קודם לכן לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין חומרים ביולוגיים וכל הדם אנושי. 3 בניגוד במבחנת הגדרות אחרות שבם בדרך כלל מוגבלת מספר הרכיבים מטוהרים, כלומר, טרומבוציטים, כדוריות דם לבנות או תאי האנדותל זמינים, המודל הנוכחי משלב את כל הרכיבים להציג בכלי דם. ההתקנה של ג אנדותל הדםמודל קאמרי ell נועד לאפשר שימוש בדם אדם טרי נמשך עם נוגד קרישה הוסיפה מעט או ללא. הדם המאוחסן בפרקי זמן ארוכים יותר לרכוש כל כך נקרא נגעי אחסון שבו פירוט של אריתרוציטים עלול להפריע לאינטראקציות עדינות בין הדם ותאי האנדותל. 4 כדי להימנע מהיווצרות קריש דם במהלך הטיפול של דם מלא vivo לשעבר דורש גם מינונים גבוהים של נוגדי קרישה או שכל החומר במגע עם דם צריך להיות לא-הפעלה. כמשטחי הפעלה שאינן נדירים בסביבת המעבדה, חומרים עשויים לחלופין להיות מצוידים בשכבת מגן של הפרין המשותק. שכבת המגן של הפרין המשותק (להלן כפי משטח הפרין Corline (CHS)) שניתן להחיל את רוב חומרי יצירת משטח שבו קשר דם יכול להתרחש מבלי לגרום להפעלה של מפל הקרישה. 5 לכן, על ידי ריהוט החדרים עם CHS, ce אנדותל הדםll קאמרי מודל מאפשר שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של נוגדי קרישה בדם. הימנעות התוספת של ריכוזים גבוהים של נוגד קרישה במודל תא אנדותל הדם מאפשרת לחקור אינטראקציות רגישות בתוך כלי דם שעלולים להיות רעול פנים. 6 מודל תא תא האנדותל דם מורכב משני תאים שנוצרו על ידי הצמדת גלילי פלסטיק (גובה: 8 מ"מ; רדיוס: 9 מ"מ) לשקופית מיקרוסקופ פלסטיק. הקצוות פונים כלפי מעלה על הצילינדרים מצוידים בחריצים שמצוידים בטבעות אטימות מגומי המשמשות לאיטום התאים נגד שקופיות תרבית תאים. התאים מלאים באופן חלקי בלבד עם דם כמו האוויר שנשאר בתא שומר דם בתנועה כאשר התאים מסובבים לאחר מכן במצב אנכי (איור 1). על מנת להעריך את התפקוד של המודל, ביצענו ניסויים עם או לחלוטין CHS מצופהתאי תא או טבור אדם וריד האנדותל (HUVEC). שני כרכי דם נפרדים היו assayed והיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין (TAT) מתחמים (סמן עקיף של קרישה) נמדדה עם assay אנזים קשור immunosorbent (ELISA). לאחר מכן, אנו הערכנו את ההשפעה של כמויות דם וגורם נמק גידול (TNFα) מגורה בתאי האנדותל בגיוס לויקוציטים על ידי ניתוח תמונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg"> איור 1. הגדרה של מודל תא תא האנדותל דם. (א) למעלה להציג ציור סכמטי של תא הדם שנעשה בPMMA. תאי האנדותל אנושיים יסודיים (ב ') בתרבית על שקופיות קאמריות 1 היטב. כל דם אדם טרי מתווסף לשני תאים בשקופית מיקרוסקופ. מטופלים התאים וכל החומר המשמשים לטיפול בדם עם ציפוי HS מגן. לאחר הסרת קירות לסה"נשקופית תרבות LL, התאים ממוקמות מול הדם והמערכת תהיה סגורה בחוזקה. לאחר מכן תאי תא (C) אנדותל הדם מודגרת תחת סיבוב ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התגובות בתא הדם עשויים להיות מנותחות על ידי ELISA ותאי האנדותל יכולים להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופי.

<table><tbody><tr><td>תאי אנדותל ורידים אומביליקניים אנושיים (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>ניתן להשתמש בכל סוג אחר של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>הכינו 1% ג'לטין ב-PBS, דגרו 5 מ"ל ב-T75 למשך 15 דקות והוציאו לפני תרבית התאים.</td></tr><tr><td>מעבדת מחקר אנזימים</td> <td>TAT ELISA</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>דילול 1:100</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11001</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>בדיקות מולקולריות</td><td>אדומות פלואידין-טקסס</td><td>A22287</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>בדיקות מולקולריות</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td>דילול 10 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 באר שקופיות תרבית תאים</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td></td><td>NA ניתן לייצר תא דם ב-PMMA או בכל פלסטיק אחר המסוגל לקשור CHS</td></tr><tr><td>מהדקים</td><td>אופיס דיפו</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>קורלין הפרין משטח (CHS)</td> <td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>מחט היפודרמית</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>גודל: 18 גרם x 5 מ"מ</td></tr><tr><td>הפרין לא מקוטע (UFH)</td> <td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>הכן תמיסת מלאי של 0.34 M ב-milliQ H2O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>זמין בחינם ב-www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

רומן במבחנה מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

רוב של כל המחלות הידועות מלווים בהפרעות של מערכת הלב וכלי הדם. מחקרים לתוך המורכבות של מסלולי האינטראקציה מופעלים במהלך פתולוגיות לב וכלי דם, עם זאת, מוגבלים על ידי חוסר שיטות חזקות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. על מנת לבנות מודל אירועים של כלי דם פתולוגיים שפיתחנו assay במבחנה לחקר יחסי הגומלין בין האנדותל וכל דם. Assay מורכב של תאים ראשוניים אדם אנדותל, אשר ממוקמים במגע עם דם כל אדם. השיטה משתמשת בדם האם של עם שום או מעט מאוד נוגד קרישה, המאפשרת מחקר של אינטראקציות עדינות בין מרכיבים מולקולריים ותאיים הנמצאים בכלי דם. חקרנו את הפונקציונליות של assay על ידי השוואת הפעלה של קרישת דם במחזורים שונים הודגרו עם או בלי תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVEC). ואילו גדול יותר נפח דם תרם לעלייה בהיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין מתחמים (TAT), נוכחות של HUVEC הביאו הפעלה מופחתת של קרישה. יתר על כן, אנחנו מוחלים ניתוח תמונה של קובץ מצורף לויקוציטים לHUVEC מגורה עם גורם נמק גידול (TNFα) ומצא את נוכחותו של CD16 + תאים להיות גבוה יותר באופן משמעותי על TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאי unstimulated לאחר מגע דם. לסיכום, assay ניתן להחיל ללמוד פתולוגיות כלי דם, שבו אינטראקציות בין האנדותל ותא הדם מוטרדות.

נחיצותו של CHS ציפוי על מנת למדוד את תגובות בכל דם ספציפיים לאלה שהושרו על ידי תאי האנדותל, כל החומרים המשמשים לתא התא האנדותל דם חייבים להיות מרוהטים עם ציפוי CHS לפני השימוש. איור 2 א (משמאל) מראה תא ללא ציפוי אחרי 30 דקות של קשר דם עם מתנת קריש נראית בבירור. טיפול בתא עם CHS (איור 2 א, מימין) ומצד שני מגן על הדם מהפעלה לא מבוקרת, על מנת להבטיח כי התוצאות הן בשל אינטראקציות תא-דם האנדותל. האפקט של נפח הדם בלשכה הפעלה של קרישה היא סבירה יותר בדם קופא על שמריו כהסתברות של אינטראקציה בין גורמי קרישה מופעלים גדלה. במודל תא תא האנדותל דם, דם נשמר בתנועה בשל הזרימה של בועת אוויר בתוך החדר. בoבצו לקבוע את ההשפעה של שינויים בנפח הדם, וכך גם גודל בועת אוויר, חדר CHS מצופה היה קשור לשקופית זכוכית מצופה CHS שנבדקה עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם כל למשך 30 דקות. נפח דם ללא כל תנועה על ידי בועות האוויר הוא גדולים פי 2.5 כאשר 1.75 מיליליטר של דם נוסף לחדר לעומת כאשר 1.5 מיליליטר של דם משמש (איור 2). TAT-הערכים הנמדדים הציעו מוגברים TAT-היווצרות עם עליית נפח דם (איור 2 ד). כאשר HUVEC (איור 2 ג) הודגרו עם או 1.5 או 1.75 מיליליטר של דם מלא, אין הבדל צוין בין שתי הקבוצות, מצביע על כך שתאי האנדותל עשויים לווסת את ההפעלה של קרישה (איור 2 ד). האפקט של TNFα על גיוס תא דם וההפעלה של קרישה על מנת לחקור את ההשפעה של TNFα על גיוס לויקוציטים, HUVEC היה תענוגאד עם 20 ng / ml TNFα 4 שעות לפני מגע דם. קשר דם - גם עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם - היה נמשך 30 דקות לאחר ששקופיות התרבות היו מוכתמות עבור CD16 (איור 2F), צילם ומספר CD16 + התאים היה לכמת. הגיוס של CD16 + תאים גדל באופן משמעותי עם טיפול TNFα (2E איור) 100-256 CD16 + תאים / מ"מ 2 (p &lt;0.0001) עם 1.5 מיליליטר דם ו172-378 (P &lt;0.0001) עם 1.75 מיליליטר דם. ההיווצרות של קומפלקסי TAT נמדדה בדגימות הפלזמה המקבילה של הדם הודגרו עם תאים או טופל TNFα או מטופלים (איור 2G). תאי TNFα מגורה מושרה הכפלה משוערת של מתחמי TAT בהשוואה לתאים שלא טופלו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600"> איוריור 2: פונקציונליות של מודל תא תא האנדותל דם. צ'יימברס () עם או בלי CHS הודגרו עם כל דם. ללא CHS, קריש נוצר לאחר 30 דקות. מדידה של תרומבין-באנטי-טרומבין מתחמים (TAT), סמן עקיף של קרישה, בדם מודגרות ללא CHS הייתה&gt; 6,000 מיקרוגרם / מיליליטר. (ב) נפח דם לא המשיך לנוע על ידי בועות האוויר מסתובבות ישתנה עם כמויות דם שונות. עם התוספת של 1.5 מיליליטר של דם, נפח זה יהיה 0.3 מיליליטר, ואילו זה יגדל ל 0.74 מיליליטר בתוספת של 1.75 מיליליטר. (ג) HUVEC הדמיה עם מורפולוגיה תכנית מיקרוסקופ לעומת שלב טיפוסי תא האנדותל של monolayer ומחוברות לפני קשר דם. (ד) ערכי TAT לתאים לחלוטין CHS מצופים מראים הבדל קטן כאשר כמויות דם שונות מתווספות. התוספת של 1.5 מיליליטר דם הביאה 35 ± 11 מיקרוגרם / מיליליטר (n = 7) בהשוואה לרמה של 1.75 מיליליטר, אשר הביא 8577; 70 מיקרוגרם / מיליליטר TAT (n = 8). הבדל זה הוא כבר לא נוכח בעת HUVEC מודגרת עם אותו נפח הדם; 66 ± 55 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.5 מיליליטר (n = 5) ו -66 ± 29 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.75 מיליליטר (n = 7). כימות (ה) למספר CD16 + התאים נוכחי משני unstimulated או TNFα מגורה HUVECs לאחר קשר דם. מספר CD16 + התאים גדל באופן משמעותי עם TNFα מגורה תאים מודגרות גם עם 1.5 מיליליטר (basal: 100 ± 40 תאים / מ"מ; TNFα: 256 ± 121 תאים / מ"מ) או 1.75 מיליליטר (basal: 172 ± 67 תאים / מ"מ; TNFα: 378 ± 185 תאים / מ"מ) של דם מלא (, CD16 (ירוק) ו DAPI (כחול) F) נציג תמונות של unstimulated וTNFα מגורה HUVEC מוכתם עבור phalloidin (אדום).. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר (G) ההיווצרות של קומפלקסי תאת הוכפלה על ידי TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאים שלא טופלו הודגרו עם דם (1.5 מיליליטר:. 2.1 ± 0.1 פעמים יותר TAT, n = 3; 1.75 מיליליטר: פי 1.7 ± 1.0 יותר TAT, n = 4). כל הערכים מוצגים כ± הממוצע סטיית תקן; ערכי p חושבו על ידי בדיקות t מזווגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

הנגישות של מודלים אמינים לחקירת אינטראקציות דם וסקולריות בבני אדם לוקה בחסר. אנו מציגים מודל מבחנה של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים בתרבית בשילוב עם דם מלא אנושי כדי לחקור אינטראקציות תאיות הן בדם (ELISA) והן בתא כלי הדם (מיקרוסקופיה).

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את האינטראקציות בין תאי דם ותאי אנדותל באמצעות בדיקת תא אנדותל דם חדשה. זה מושג על ידי איסוף דם ממתנדב בריא על ידי ניקור ורידים במערכת פתוחה. בשלב השני, הדם מונח בזהירות על תאי דם מצופים משטח הפרין יחד עם שקופיות מצופות תרבית תאי אנדותל.לאחר מכן, תאי האנדותל של הדם מסובבים בעדינות כדי להקל על האינטראקציה בין תאי הדם לתאי האנדותל. בסופו של דבר, ניתן להעריך את האינטראקציות בין תא לתא בין תאי הדם לתאי האנדותל ואת ייצור קומפלקס התרומבין אנטי-תרומבין שנוצר על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ואליזה בהתאמה. היתרון העיקרי בטכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלה המשתמשות במודלים של בעלי חיים הוא שכאן ניתן להשתמש במערכת מודל אנושי כדי לחקור מחלות כלי דם לפני תחילת הניסוי.חבר מחט היפודרמית בגודל 18 לחתיכה בקוטר פנימי של שני מילימטר של צינורות סיליקון מצופים משטח הפרין. משטחי הפלסטיק מצופים בהפרין על מנת למנוע הפעלה לא ספציפית של קרישה. לדוגמה, בתמונה זו, קריש דם נראה בבירור בתא הלא מצופה הזה.לאחר 30 דקות של מגע דם, טיפול בתא במשטח הפרין מגן על הדם מפני הפעלה בלתי מבוקרת, ומבטיח שהתוצאות נובעות מאינטראקציות הדם של תאי האנדותל. רק לאחר חיבור הצינור, אסוף בזהירות דגימת דם מתורם בריא על ידי ניקור ורידים במערכת פתוחה לתוך צינור מצופה משטח הפרין בנפח 50 מיליליטר. השלם את הדם שנאסף בהפרין לא מפורק כדי להגיע לריכוז סופי של 0.75 IUs למיליליטר והפוך את הצינור פעמיים עד שלוש לערבוב עדין.לניתוח ריכוז החלבון הראשוני בדם, ערבבו בזהירות מיליליטר אחד של דם לכל שפופרת בצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים 30 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי K 3 EDTA, והניחו את הצינורות על קרח. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה מצופה משטח הפרין כדי להעביר 1.5 מיליליטר דם לכל תא תאי אנדותל דם מצופה משטח הפרין, תוך הקפדה לתת לדם לזרום לאט ומבלי ליצור בועות כדי למנוע הפעלה. לאחר מכן, הסר את דפנות הפלסטיק משקופיות תרבית תאי האנדותל לפי הוראות היצרן, ושטוף בעדינות את תאי האנדותל.עם PBS, אנו מזיזים כמה שיותר מהשטיפה מהתאים מבלי לתת לתרביות להתייבש, ומניחים את השקופיות על גבי חדרי הדם כשהתאים פונים לדם. לאחר מכן שימוש במגלשות פלסטיק לתמיכה נוספת. כדי למנוע שבירה של שקופיות תרבית התאים, הנח clamp סביב כל תא תאי אנדותל בדם כדי לאבטח את השקופיות.כעת, סובב את התאים על גלגל מסתובב באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ב-0.5 Gs למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, יש לפרק את תאי תאי האנדותל בדם, לשטוף את שקופיות תרבית התאים ב-PBS ולקבע את התאים בקור קרח של 1% פרלדהיד למשך 10 דקות. לבסוף, להערכת ריכוז החלבון בדם הפעיל, ערבבו מיליליטר אחד של דם מכל תא בצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים 30 מיקרוליטר של 0.34 מולרי K שלוש EDTA, והניחו את הצינורות על קרח למשך שעה אחת לכל היותר.לאחר מכן לאחר סיבוב התאים, אחסן את הפלזמה בצינורות מיקרו צנטריפוגות חדשים במינוס 70 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. סביר יותר שהפעלת גורמי הקרישה תתרחש בדם עומד ככל שההסתברות לאינטראקציה בין הגורמים המופעלים גדלה. ואכן, נפח הדם ללא כל תנועה על ידי בועות אוויר גדול פי שניים וחצי.כאשר מוסיפים 1.75 מיליליטר דם לתא בהשוואה ל-1.5 מיליליטר דם, ערכי התרומבין אנטי-תרומבין הנמדדים מצביעים על היווצרות מוגברת של תרומבין אנטי-תרומבין עם נפח דם מוגבר גם כן. מעניין שכאשר מודגרים עם נפח דם מלא, לא נצפים הבדלים בין שתי הקבוצות, מה שמרמז על כך שתאי האנדותל עשויים לווסת את הפעלת הקרישה כדי לחקור את ההשפעה של TNF אלפא על גיוס לויקוציטים. בניסוי זה, qve טופלו ב-20 ננוגרם למיליליטר של TT NF אלפא ארבע שעות לפני מגע הדם, ולאחר מכן כומת מספר התאים החיוביים ל-CD 16.גיוס התאים החיוביים ל-CD 16 גדל באופן משמעותי עם הטיפול ב-TNF אלפא מ-100 ל-256 תאים חיוביים CD 16 למילימטר רבוע ו-1.5 ליטר דם, ומ-172 ל-378 ו-1.75 מיליליטר דם. לאחר מכן נמדדה היווצרות קומפלקסי התרומבין אנטי-תרומבין בדגימות הפלזמה המתאימות מהדם שהודגרו עם תאים שטופלו ב-TNF אלפא או לא מטופלים. כצפוי, התאים המגורים TNF אלפא גרמו להכפלה משוערת של קומפלקסי התרומבין אנטי-תרומבין בהשוואה לבקרות שלא טופלו לאחר התפתחותו.טכניקה זו תמשוך את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור, להשלים וקרישה במודל מבחנה באמצעות תאים ראשוניים אנושיים ודם מלא אנושי.

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

אנו מציגים במבחנה מודל המאפשר את מחקר וניתוח של קרישה בדם שאינו anticoagulated כולה,... בדיקות דם במערכת תלוי אפקט נוגד קרישה הטבעי של תאי אנדותל בריאים והתוצאה תא אנדותל הפעלת הקרישה.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

פרוטוקול זה מתאר הערכת התאמה מקיפה של התקנים ליצירת קשר דם באמצעות שתלים נוירונימי לייזר. מודל לולאה של זרימה עם דם האדם טרי, heparinized מוחל כדי לחקות את זרימת הדם. לאחר הפרזיה, סמנים המטולוגיים שונים מנותח ומושווים לערכים שנרכשו ישירות לאחר איסוף הדם להערכת התקנים של המכשירים שנבדקו.

בדיקות הומותאימות של דם-יצירת קשר שתלים בלופ זרימה לולאה דגם מחקה זרימת הדם האנושית

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

מוצג כאן פרוטוקול עבור מודל לולאה מודינמית מתוקנן במבחנה. מודל זה מאפשר לבדוק את תאימות ההמו-תאימות של צינורות זינג'ן או סטנטים של כלי דם בהתאם לתקן ISO (הארגון הבינלאומי לתקינה) 10993-4.

מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

למד את שיטת מודל הדם-אנדותל במבחנה לחקירת אינטראקציות בין תאי דם אנושיים לאנדותל. שיטה זו מאפשרת הערכת קרישה וגיוס תאי דם לבן במחקר מחלות כלי דם.

רומן במבחנה מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

גלה סרטונים נוספים