רומן במבחנה מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את האינטראקציות בין תאי דם ותאי אנדותל באמצעות בדיקת תא אנדותל דם חדשה. זה מושג על ידי איסוף דם ממתנדב בריא על ידי ניקור ורידים במערכת פתוחה. בשלב השני, הדם מונח בזהירות על תאי דם מצופים משטח הפרין יחד עם שקופיות מצופות תרבית תאי אנדותל.

לאחר מכן, תאי האנדותל של הדם מסובבים בעדינות כדי להקל על האינטראקציה בין תאי הדם לתאי האנדותל. בסופו של דבר, ניתן להעריך את האינטראקציות בין תא לתא בין תאי הדם לתאי האנדותל ואת ייצור קומפלקס התרומבין אנטי-תרומבין שנוצר על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ואליזה בהתאמה. היתרון העיקרי בטכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלה המשתמשות במודלים של בעלי חיים הוא שכאן ניתן להשתמש במערכת מודל אנושי כדי לחקור מחלות כלי דם לפני תחילת הניסוי.

חבר מחט היפודרמית בגודל 18 לחתיכה בקוטר פנימי של שני מילימטר של צינורות סיליקון מצופים משטח הפרין. משטחי הפלסטיק מצופים בהפרין על מנת למנוע הפעלה לא ספציפית של קרישה. לדוגמה, בתמונה זו, קריש דם נראה בבירור בתא הלא מצופה הזה.

לאחר 30 דקות של מגע דם, טיפול בתא במשטח הפרין מגן על הדם מפני הפעלה בלתי מבוקרת, ומבטיח שהתוצאות נובעות מאינטראקציות הדם של תאי האנדותל. רק לאחר חיבור הצינור, אסוף בזהירות דגימת דם מתורם בריא על ידי ניקור ורידים במערכת פתוחה לתוך צינור מצופה משטח הפרין בנפח 50 מיליליטר. השלם את הדם שנאסף בהפרין לא מפורק כדי להגיע לריכוז סופי של 0.75 IUs למיליליטר והפוך את הצינור פעמיים עד שלוש לערבוב עדין.

לניתוח ריכוז החלבון הראשוני בדם, ערבבו בזהירות מיליליטר אחד של דם לכל שפופרת בצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים 30 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי K 3 EDTA, והניחו את הצינורות על קרח. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה מצופה משטח הפרין כדי להעביר 1.5 מיליליטר דם לכל תא תאי אנדותל דם מצופה משטח הפרין, תוך הקפדה לתת לדם לזרום לאט ומבלי ליצור בועות כדי למנוע הפעלה. לאחר מכן, הסר את דפנות הפלסטיק משקופיות תרבית תאי האנדותל לפי הוראות היצרן, ושטוף בעדינות את תאי האנדותל.

עם PBS, אנו מזיזים כמה שיותר מהשטיפה מהתאים מבלי לתת לתרביות להתייבש, ומניחים את השקופיות על גבי חדרי הדם כשהתאים פונים לדם. לאחר מכן שימוש במגלשות פלסטיק לתמיכה נוספת. כדי למנוע שבירה של שקופיות תרבית התאים, הנח clamp סביב כל תא תאי אנדותל בדם כדי לאבטח את השקופיות.

כעת, סובב את התאים על גלגל מסתובב באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ב-0.5 Gs למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, יש לפרק את תאי תאי האנדותל בדם, לשטוף את שקופיות תרבית התאים ב-PBS ולקבע את התאים בקור קרח של 1% פרלדהיד למשך 10 דקות. לבסוף, להערכת ריכוז החלבון בדם הפעיל, ערבבו מיליליטר אחד של דם מכל תא בצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים 30 מיקרוליטר של 0.34 מולרי K שלוש EDTA, והניחו את הצינורות על קרח למשך שעה אחת לכל היותר.

לאחר מכן לאחר סיבוב התאים, אחסן את הפלזמה בצינורות מיקרו צנטריפוגות חדשים במינוס 70 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. סביר יותר שהפעלת גורמי הקרישה תתרחש בדם עומד ככל שההסתברות לאינטראקציה בין הגורמים המופעלים גדלה. ואכן, נפח הדם ללא כל תנועה על ידי בועות אוויר גדול פי שניים וחצי.

כאשר מוסיפים 1.75 מיליליטר דם לתא בהשוואה ל-1.5 מיליליטר דם, ערכי התרומבין אנטי-תרומבין הנמדדים מצביעים על היווצרות מוגברת של תרומבין אנטי-תרומבין עם נפח דם מוגבר גם כן. מעניין שכאשר מודגרים עם נפח דם מלא, לא נצפים הבדלים בין שתי הקבוצות, מה שמרמז על כך שתאי האנדותל עשויים לווסת את הפעלת הקרישה כדי לחקור את ההשפעה של TNF אלפא על גיוס לויקוציטים. בניסוי זה, qve טופלו ב-20 ננוגרם למיליליטר של TT NF אלפא ארבע שעות לפני מגע הדם, ולאחר מכן כומת מספר התאים החיוביים ל-CD 16.

גיוס התאים החיוביים ל-CD 16 גדל באופן משמעותי עם הטיפול ב-TNF אלפא מ-100 ל-256 תאים חיוביים CD 16 למילימטר רבוע ו-1.5 ליטר דם, ומ-172 ל-378 ו-1.75 מיליליטר דם. לאחר מכן נמדדה היווצרות קומפלקסי התרומבין אנטי-תרומבין בדגימות הפלזמה המתאימות מהדם שהודגרו עם תאים שטופלו ב-TNF אלפא או לא מטופלים. כצפוי, התאים המגורים TNF אלפא גרמו להכפלה משוערת של קומפלקסי התרומבין אנטי-תרומבין בהשוואה לבקרות שלא טופלו לאחר התפתחותו.

טכניקה זו תמשוך את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור, להשלים וקרישה במודל מבחנה באמצעות תאים ראשוניים אנושיים ודם מלא אנושי.