ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות תמיכה כספית מMRC בריטניה (G0800498). כמו כן, אנו רוצים להודות לפרופ &#39;JM Fritschy, אוניברסיטת ציריך, למתן נוגדן GABA -R למקטע ספציפי γ2 ופרופסור ר&#39; הארווי, בית הספר לרוקחות UCL, למתן pcDNA 3.1 (+) וקטורי ביטוי המכיל עמידות לאנטיביוטיקה גנים לייצור שורות תאי HEK293 transfected ביציבות.

<ol><li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li>
<li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA+excitatory%2Finhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li>
<li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pharmacology%2C+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li>
<li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+action%3A+opening+of+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li>
<li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy%2C+cleft+palate%2C+and+hypersensitive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li>
<li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li>
<li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptor+diversity+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li>
<li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li>
<li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid%28A%29+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li>
<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li>
<li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li>
<li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gamma+2+subunit+of+GABA%28A%29+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li>
<li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+GABAA+receptors%3A+form%2C+pharmacology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li>
<li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li>
<li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li>
<li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA%28A%29+receptors+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li>
<li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li>
<li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha%282%29-subunit-containing+GABA%28A%29+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li>
<li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organizing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li>
<li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation%2C+maturation%2C+and+function+of+vertebrate+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li>
<li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVentimiglia%2C+R+%22Culturing+nerve+cells%3A+Rat+striatal+neurons+in+low-density%2C+serum-free+culture%22">Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture</a>. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+GABA%28A%29+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li>
<li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain%3A+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li>
<li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li>
<li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reports%22%5BJournal%5D)">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li>
<li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li>
<li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li>
<li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

למרות שפרוטוקול זה הוא לא קשה מבחינה טכנית לבצע, יש כמה שלבים קריטיים שיש אחריו כדי להשיג את מבחני שיתוף התרבות לשחזור מדויקים ביותר. ראשית, הנוירונים קוצניים בינוני תרבותיים חייבים להיות נזרעו בצפיפות אופטימלית. אם נזרע בדלילות מדי, תאי עצב נוטים לפתח לאט לאט ובהישרדות מופחתת במידה ניכרת. מצד השני, אם זורעים בצפיפות רבה מדי, תאי עצב נוטים לצבור אשר פוגע בניתוח של קשרים עם תאי HEK293. שנית, מומלץ להביע כתב ניאון, GFP או mCherry בHEK293 תאים ביציבות להביע Rs GABA, לפני platting אותם לתרבות המשותפת זמני. זה מאפשר זיהוי אמין של HEK293 תאים, אשר יכולים להיות בסכנה על ידי דמיון בצורה ובגודל בין תאים אלה ותא גליה שרד נדיר בתרבויות עצביות. כדי להשיג transfection יעיל עם GFP או mCherry cDNA, שורות תאי HEK293 צריכים להיות בשלב הצמיחה מעריכית וזורעים בצפיפות המתאימה ב6-גם צלחות. זריעה דלילה ואחרי transfection תגרום לתאים לגדול בצורה גרועה, ואילו ימנע התאים על פני זריעה מתופס cDNA. באופן אידיאלי, צריכים להיות נזרעו תאים, כך שהם בין 70 - ומחוברות 90% ביום transfection. שלישית, transfection חייב להיות מותאם לשורת תאים כל שימוש, כמו כמה שורות תאים רגישות יותר מהאחרים. סיבה לכך הוא GABA המכונן ביטוי R בHEK293 תאים מפחית הישרדות תא ואת יכולתם של תאים להתאושש לאחר transfection. יתר על כן, הישרדות תלויה בסוג של RS GABA לידי ביטוי בתאי HEK293, עם כמה שורות תאים להיות משמעותית יותר רגישות יותר מהאחרים. Transfection באמצעות מגיב liposomal הוא שיטה אופטימלית לביטוי חלבונים זרים בשורות תאים גדלו במהירות, לספק הן יעילות transfection הגבוהה ורמת ביטוי. עם זאת, מגיב זה גורם יותר מדי נזק לשורות תאים גדלו לאט, לבו אנו משתמשים מגיב transfection אינו liposomal באופן קבוע. זה עובד בצורה דומה למגיב liposomal אבל כמות ה- DNA דרושה לtransfection יעיל מצטמצמת משמעותית. זה מאפשר הישרדות תא גדולה יותר (בערך 80-90% בהשוואה ל -60% באמצעות מגיב liposomal) אבל עם יעילות נמוכה transfection (60%). לבסוף, מספר HEK293 שליטה או α1 / β2 / γ2 HEK293 לבטא בתאים הוסיפו לתרבויות עצביות צריכה להיות מותאם. הוספה מעט מדי תאים פוגעת בניתוח המוצלח של מגעים בין תאי HEK293 ותאי עצב, כי הם הופכים להיות מאוד נדירים. לעומת זאת, הוספת תאי HEK293 רבים מדי גורמת למוות של תאים עצביים בתוך כמה שעות. אידיאלי צריכים להיות מוכנות תרבויות נוירון הקוצני הבינוני עובריים באמצעות רקמת striatal גזור מגיל עוברי 15 - 17. עם זאת, זה קורה לעתים קרובות כי הם עוברים מעט צעירים או מבוגרים מהגיל האופטימלי. במקרה זה, את מספר תאי העצב שנזרע בתרבות תהיהצריך להיות מגוון. רקמה שהיא צעיר מן E15 ייתכן שתהיה הצורך נזרעה בצפיפות נמוכה במקצת, תוך רקמה שהיא מבוגר יותר מE17 ייתכן שיהיה הצורך נזרע בצפיפות גבוהה יותר, כדי לאפשר להישרדות תא אופטימלית. יתר על כן, arabinoside ציטוזין (Ara-C) ייתכן שיהיה הצורך להוסיף לתרבויות ישנות יותר כדי למנוע צמיחה של גליה, שהוא יותר בשפע ברקמה בוגרת. בעת יצירת שיתוף תרבויות, חשוב לצלחת המספר מותאם של HEK293 transfected או α1 / תאים לבטא β2 / γ2 HEK293, כאמור לעיל. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך כדי לקבוע את זה לכל שורת תא בודדת, בגלל הבדלים בהישרדות שלהם. בדרך כלל 30,000 תאים בנפח מרבי של 50 μl יש להוסיף גם כל צלחת 24 גם, שכבר מכילה 500 μl של מדיום תרבות העצבי, כמו זו מבטיחה כי המדיום העצבי המותנה אינו מדוללת יותר מדי וכי התנאים בתוך כל טוב נשאר קבוע למדי, למשל </em&gt; הריכוז של גורמי גדילה. הוספת כמויות גדולות יותר מ -50 μl היטב כל אחד היה בדרך כלל להרוג תאי העצב. אחד החסרונות העיקריים של שיטת שיתוף התרבות הוא שהתרבויות עצביות נוצרות מהתאים ניתק גדלו כמו monolayer, מה שאומר שהנוירונים הוסרו ממייקרו-הסביבה הרגילה שלהם ואינם מסוגלים להקים את הארגון אנטומי הרגיל שלהם. לכן הם חסרים את הקשרים המתאימים, תשומות ומולקולות מופרשות מהתאים אחרים שעשויים להשפיע על השלבים הראשונים של התפתחות סינפסה. לדוגמא, בvivo נוירונים קוצניים בינוניים מעוצבבים בצפיפות על ידי תשומות glutamatergic מהקליפה, התלמוס ואזורים אחרים במוח 34, לעומת זאת, בתרבויות העצבית שלנו סינפסות glutamatergic לא יוצרות כי תשומות אלה שניזוקו במהלך הנתיחה של רקמת striatal. איך ההיעדרות של סינפסות glutamatergic פונקציונליות בתאי עצב קוצניים בינוניים תרבותיים AFFects היכולת שלהם ליצור סינפסות GABAergic אחד עם השני ו / או HEK293 תאים המבטא GABA Rs נותרת פתוחה. ניתן לטפל בשאלה זו בקלות על ידי נוירונים culturing הקוצניים בינוניים יחד עם נוירונים בקליפת המוח ומאפשרים כך glutamatergic כדי ליצור סינפסות תפקודית 35 לפני התוספת של תאי HEK293. גישה חלופית תהיה לתכנן מערכת מודל שיתוף תרבות המבוססת על תרבויות פרוסה organotypic, אשר לשמור על חלק מcytoarchitecture שעשויה להיות חשוב להתבגרות והיווצרות הסינפסה. עם זאת, יש לי תרבויות הפרוסה organotypic neuropil צפופה והטרוגנית שיכול לסכן את הניתוח שבוצע כאן. חסרון נוסף חשוב של שימוש במבחני התרבות משותפת הוא שGABA Rs הביע על פני השטח של תאי HEK293 לא התקבצו כפי שהם נמצאים בתאי עצב, אם כי נראה שלא יהיה צורך להיווצרות הסינפסה נתנה ביטוי על פני השטח גבוה מספיק 30. לדוגמא, בrמוח אודנט ובתרבויות בהיפוקמפוס, מקטע GABA R α1 נמצא במרבית הסינפסות GABAergic בכל תחומי הפוסט-סינפטי של תאים פירמידליים. עם זאת, α2 ממוקם במיוחד בתת-קבוצה של סינפסות בsomata ודנדריטים אך מועשר במגזר הראשוני האקסון, כפי שנחשפו על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים 36. בהתחשב בעובדה שהיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות עדיין יכולה להיות מזוהה באופן מהימן וניתח 30, זה מצביע על כך שהצפיפות של RS GABA על פני התא של תאי HEK293 עשויה להיות דומה ל, או אפילו גבוהה יותר מהצפיפות של קולטנים אלה בתוך הסינפטי אשכולות בתאי עצב. זה יכול להסביר, לפחות חלקית, מדוע חלבונים סינפטיים הידבקות, כגון neuroligin, וחלבוני צפיפות פוסט-סינפטי, כגון gephyrin, אינם נחוצים להיווצרות הסינפסה בשיתוף התרבויות, אם Rs GABA התאסף כראוי נמצאים במספיק צפיפות. זה מתועד היטב שרופי GABA הן מבחינה מבנית ותפקודי הטרוגנית, ושהרכב מקטע הקולטן קובע לוקליזציה subcellular ותכונות פרמקולוגיות. לדוגמא, שילוב של 2 יחידות משנה ידוע כתנאי מוקדם ללוקליזציה סינפטיים של RS GABA תוך המקטע הוא כמעט אך ורק בהווה בRs GABA extrasynaptic. קולטנים המשלבים רק αβ שילובים הם חשבו גם להיות מקומיים בעיקר לתחומי extrasynaptic 12- 14. בין אם ספציפי הזה נשמר במערכת התרבות המשותפת שלנו, ניתן לבדוק בקלות על ידי זמני transfecting 2 או למקטע cDNAs לשורות תאי יציבות להביע HEK293 תת-יחידות α וβ, לפני שמוסיף אותם לתרבויות עצביות. הניסויים הראשוניים שלנו באמצעות גישה זו הראו כי קשרים סינפטיים נוצרים בקלות ורק בנוכחות של למקטע 2, המציין כי הספציפיficity נצפה in vivo עשוי להישמר במבחנה (מידע לא מוצג). יתר על כן, Rs GABA שילוב תת-יחידות α שונות באופן סלקטיבי מקומי לקשרים סינפטיים נוצרו עם סוגים ספציפיים של תאי עצב presynaptic. לדוגמא, בpallidus גלובוס, Rs α1-GABA נמצאים בדרך כלל בstriatopallidal (STR-GP) וסינפסות palliopallidal (GP-GP), אשר ממוקמות על דנדריטים ואזורים גופניים של נוירונים הקוצניים בינוניים, בהתאמה. Rs α3-GABA נמצא באזורי perisomatic של נוירונים קוצניים בינוניים והם פנו בביטחונות האקסון GP מקומיים, תוך Rs α2-GABA נמצאים על דנדריטים הדיסטלי של הנוירונים האלה ויצרו קשר עם בעיקר על ידי תשומות מסטריאטום 32. ביטוי של תת-יחידות α ספציפיות בסוגים שונים של סינפסות ובתאים עצביים שונים הודגם גם באזורים אחרים במוח כגון hippocampus 21 ו18,20 הניאוקורטקס. ממצאים אלה מעלים את השאלה כיצד סינפסות המעכבות הספציפיות נוצרות במוח. האם ההידבקות של סוג מסוים של מסוף presynaptic לגרום החדרת תת GABA R הספציפי לנקודתי מגע? האם קולטנים נסחרים למקומות subcellular ספציפיים לפי הרכב המקטע שלהם, שבו הכנסת קרום הפלזמה שלהם היא תנאי הכרחי להידבקות של מסופי axonal ממוצא מסוים? עד כה, על השאלות אלה נותרו ללא מענה. השימוש במערכות מודל מופחת כגון מערכת מודל שיתוף התרבות, מאפשרים לנו להתחיל לענות על שאלות מורכבות זה מכיוון שהמערכה היא בקלות נוחה לtransfection של בונה DNA ויישום של חומרים כימיים ו, ​​חשוב מכך, הוא מתאים לניתוח הדמיה תא חי 30. כך, באמצעות מערכת מודל זה אנו יכולים להתחיל בבדיקת התפקיד של מולקולות בודדות, כוללים סוגים שונים של RS GABA, יודעיםn להיות נוכח בקשרים סינפטיים. יתרון נוסף הוא שהסינפסות בצורת מערכת מודל זה במהירות, בתוך דקות עד שעות, צמצום משך טיפול בניסויים. מערכות מודל שיתוף תרבות דומה הועסקו בעבר בהצלחה למסך למולקולות synaptogenic רומן 27,37,38. הבנה כיצד מערכת העצבים המרכזית מתפתחת, מתבגר וקשרים בין תאי עצב צורות כל כך מסובכים לשליטה, לדוגמא, התנהגות או קוגניציה, הוא בעל חשיבות עליונה. מטרה רחוקה זה תושג רק על ידי התוויית המנגנונים המולקולריים הקובעים את שלביה השונים של הכרה ותקשורת תא אל התא במהלך התפתחות. בשל מורכבות, הפרטים המולקולריים של אינטראקציות תאיות רבות אלה יכולים כיום ללמוד עם דיוק רק במערכות מופחתות. עם זאת, היכולת להגדיל את המורכבות של מערכות אלה בהבעת שילובים מרובים של חלבונים ולומדים כיצדהם פועלים יש כמה יתרונות בהשוואה ל, למשל, גישות מחיקה גנטיות. סיבה לכך הוא הפרשנות מדויקת של ההשפעות של מחיקת גן יחיד נפגעת לעתים קרובות על ידי שינויים הקשורים במנגנונים מפצים מסווים את ההשפעות של נגעים מקוריים, במיוחד במוח המתפתח. טכניקת שיתוף התרבות אך אינפורמטיבי הפשוטה שתוארה כאן אפשרה גילוי של התפקיד המבני של RS GABA בהיווצרות הסינפסה ונפתחה אפשרות לחקור כיצד Rs GABA ומולקולות הידבקות תא אחרות ו / או חלבוני מטריצה ​​הסינפטי לתקשר אחד עם השני במהלך synaptogenesis. חלבוני מטריצת Synaptic הם בעלי עניין המיוחד לאור עובדה שיש להם לאחרונה הוכח לשחק תפקיד מפתח בהיווצרות הסינפסה glutamatergic 39. פיתוח נוסף של דגמי התרבות המשותפת הוא חשוב כי יש להם הפוטנציאל לקדם את הידע של המנגנונים המולקולריים המנחים את &#39;ורגיל שלנו# 8217; התפתחות מוח ובכך להגביר את ההבנה של איך מנגנונים אלה שינו בהרבה מחלות התפתחותיות, כמו אפילפסיה, סכיזופרניה, הפרעות ספקטרום האוטיסטי ועוד רבים אחרים שלנו.

GABA הוא אחד מהנוירוטרנסמיטרים הקדומים ביותר שנמצאו במוח העוברי, שקדמה להנוירוטרנסמיטר גלוטמט מעורר הנפוץ ביותר 1. במהלך פיתוח, GABA depolarizes ומרגש את תאי עצב לא בוגרים, ששיחק תפקיד מפתח בויסות התפשטות תאים, הגירה והיווצרות של רשתות נוירונים ללא גרימה להפעלת יתר רעיל. במוח הבוגר, פוטנציאל ההיפוך לערוצי קולטן GABA מוסט לפוטנציאל שלילי יותר כתוצאה מירידה בריכוז תאית של כלוריד. שינוי זה נגרם על ידי עד-רגולציה של שיתוף טרנספורטר אשלגן כלורי (KCC2), אשר מעביר כלוריד מחוץ לתא, ובמקביל, את תקנה של טרנספורטר נתרן-אשלגן כלורי (NKCC1), שבו יש ההשפעה ההפוכה 2. במוח, GABA נקשר בעיקר לאו GABA או GABA-B קולטנים לתווך עיכוב הסינפטי מהיר או איטי, בהתאמהly. Rs GABA הוא קבוצה של קולטנים המכונים גם ionotropic heteropentameric או תעלות יונים Cys לולאה מגודרת ליגנד. שתי מולקולות של GABA נדרשות להפעלה של הקולטן, אשר הוא חדיר ליוני כלוריד ובמידה פחותה יותר, יונים ביקרבונט. העלייה במוליכות כלוריד מקטינה את היעילות של depolarizing, אירועים מעוררים בהפעלת תא עצב הפוסט-סינפטי 3. גיוון מבני של RS GABA כבר זמן רב מוכר כגורם מפתח בקביעת מגוון הרחב שלהם מאפיינים פונקציונליים ותרופתיים. Rs ילידי GABA הוא הטרו-pentamers המורכב מיחידות משנה עם isoforms מרובה סווגה כ: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π וθ 3, עם משותף טופולוגיה הטרנסממברני הכוללת תחום גדול N- מסוף תאי, ארבעה תחומים הטרנסממברני (TMS), ותחום תאיים עיקרי בין זיכרונות 3 ו -4 4.β3 וγ2 תת-יחידות חיוניות לעיכוב הסינפטי והישרדות האורגניזם, כי עכברים שנשאו מחיקה גנטית של תת-יחידות אלה למות לאחר לידת 5,6. בניגוד לכך, isoforms הבודד של מקטע α הם חשוב לתפקוד של קשרים סינפטיים ספציפיים במוח הקשורים להתנהגויות שונות כגון חרדה, הרגעה, גירוי, ואחרים, אבל הם לא, בנפרד, חיוניים לחיים 7-9. Rs GABA הם האתרים העיקריים של פעולה עבור מגוון רחב של תרופות עם תרופת הרגעה חזקה, היפנוטי, טיפול בחרדות ותופעות פרכוסים, כגון בנזודיאזפינים, ברביטורטים, neurosteroids והרדמת 7,10,11. Rs Synaptic GABA מכיל בדרך כלל תת-יחידת γ2, שתי תת-יחידות β (הנפוץ ביותר β2 או β3) ושתי תת-יחידות α (α1, α2, α3 או α5) 12,13. המעמד הדומיננטי של קולטנים נוספים סינפטי מכיל מקטע δ בשילובעם שתי תת-יחידות α (α4 או α6), ושתי תת-יחידות β (β2 או β3) 14. לוקליזציה subcellular של GABA R כדי אקסונים, דנדריטים או סומה, והחדרה לתוך קרום הפלזמה תלויה בנוכחות של β-יחידות משנה 15,16. עם זאת, שילוב סלקטיבי של GABA שונה R תת לסוגים שונים של סינפסות וקושר היטב עם הנוכחות של תת-יחידות α ספציפיים (α1, α2, α3 או α5) 7,17,18. חשוב לציין, מחיקה של מקטע α1 או α2 בעכברים גורמת לשינויים ultrastructural בסינפסות מעכבות 19. הדבר מצביע על כך GABA RS עצמם עשויים למלא תפקיד ישיר בויסות היווצרות הסינפסה. ראיות מצביעות על כך שהתפתחות סינפסה GABAergic היא רצף בדיוק-מתואם של אירועים, בם שתי המטרות עצבי קשר סוגים שונים של אקסונים המעכבים וקולטנים המקובצים בכל כיתה של סינפסה המעכבת הנן סלקטיביים, ופונקציונלי קשובים 17,20-22. עיקרון יסוד זה של ייחוד בסינפסות GABAergic מעלה את השאלה, כיצד השותפים טרום postsynaptic להכיר אחד את השני במהלך הייזום של קשרים סינפטיים. במבחני חוץ גופית התרבות המשותפת יושמו בהצלחה ללמוד על כמה מהמנגנונים של היווצרות הסינפסה ועל מנת לבחון את תפקידם של חלבונים פורשי שסע הסינפטי בודדים בתהליך הזה. אחד השילובים הנפוצים טרנס-סינפטי האינטראקציה החלבון המתפקדים דו directionally לתווך היווצרות הסינפסה והתבגרות, הם Neurexins (Nrxns) וNeuroligins (NLS). Nrxns הם חלבוני סינפטי כי תערוכת שחבור חלופי בתוך תחומים החלבון שלהם laminin-neurexin-המיני מחייב הורמון, והוליד isoforms שונים 23. בעוד Nrxns גם אינטראקציה עם חלבונים אחרים, NLS נחשב לרשות הפוסט-סינפטי בכל מקום שלהםrtners 24. יחד חלבונים אלה תורמים למחזיקים קרומי סינפטי ופוסט-סינפטי בפרד קרוב ונוקשה 25. שני isoforms הנפוץ ביותר הוא NL-1 וNL-2 אשר נמצא בסינפסות מעוררות ומעכבות, בהתאמה 26. אחת ממערכות מודל שיתוף התרבות הקדומות ביותר, שנועדו לחקור אינטראקציות חלבון טרנס-סינפטי, מועסק סוגים שונים של תאים שאינם עצביים, שורות תאים הנפוצות ביותר האלמותיות כגון כליה העוברית האנושי (HEK) 293 תאים, לNL--Express על 2. כאשר התאים אלה בתרבית עם תאי עצב pontine, הצטברות של חלבוני סינפטי בקרבת פני השטח של תאי HEK נצפתה, המצביעה על היווצרותו של קשר כמו סינפסה. תוספת של β-neurexin המסיס לשיתוף תרבויות אלה עכבה את הקמתה של אנשי קשר, המצביעה על כך אינטראקציות הטרנס-סינפטי בין Nrxns וNLS נחוצות למגע הסינפטי היווצרות 27. יתר על כן, ביטוי חולףשל β-neurexin בCOS תאים (V-1 C (קופי) בrigin O, ונושא את החומר הגנטי S V40) שיתוף תרבותי עם glutamatergic ניתק בהיפוקמפוס ונוירונים GABAergic ביטוי מושרה של gephryin חלבון הפוסט-סינפטי ושל תת-יחידות GABA R γ2 וα2 בנקודות מגע בין שני סוגי התאים אלה 28. דוגמא נוספת של מודל שיתוף תרבות משמש ללמוד היווצרות הסינפסה מעורבת HEK293 תאים, זמני transfected עם GABA R תת-יחידות α2 / β3 / γ2 וNL-2, ואוכלוסייה מעורבת של תאי עצב ההיפותלמוס 29. מחקר זה הגיע למסקנה כי הביטוי של NL-2 הוא דרישה הכרחית להיווצרות של סינפסות מעכבות. α1 עם זאת, במחקר התרבות המשותפת האחרון, transfected ביציבות / β2 / γ2 GABA Rs בHEK293 תאים נמצאו מספיק כדי לגרום סינפסות הפונקציונלית כאשר שיתוף תרבותי עם מד GABAergicנוירונים ium קוצניים, ללא צורך בחלבוני הדבקת טרנס-סינפטי או פוסט נוספים. עם זאת, עלייה בולטת בהיווצרות הסינפסה וכוח נצפתה כאשר NL-2 היה במשותף עם אותה הביע GABA Rs 30. זה מצביע על כך מערכת מודל שיתוף תרבות זו יש יתרונות על פני מערכות מודל שתוארו לעיל, רוב כנראה רגישות ואמינות של זיהוי קשר הסינפטי מוגברים. שני גורמים חשובים המסייעים לשיפור הכללי בזיהוי של קשרים סינפטיים הם: i) השימוש בשורות תאי HEK293 transfected ביציבות עם ביטוי גבוה ועקבי של תת-יחידות GABA R על פני השטח של תאים בודדים. עקביות זו מאפשרת השוואות כמותיות בין תנאי שיתוף תרבות שונים. ii) השימוש באוכלוסייה טהורה של תאי עצב קוצניים בינוני GABAergic תרבית מסטריאטום העוברי ביום 31 במסיר סיבוכים ואי-בהירויות הנובעות מהשימוש באוכלוסיות עצביות מעורבות וallows, למשל, בחירה של סוגי postsynaptic המתאימים ביותר GABA R שניתן להשוות אחד עם השני במהלך היווצרות הסינפסה. היווצרות של סינפסות היא חשב לערב הרבה אותות טרנס-סינפטי בתוך מתחמי הידבקות תא טרום postsynaptic. בשל האופי הדו-כיוונית של איתות הסינפטי והמספרים העצומים של מולקולות הידבקות תא, קשה לזהות מרכיבים מרכזיים מעורבים בהיווצרות הסינפסה. כך, transfecting חלבון הידבקות תא בודד לתא הלא-עצבי (במקרה זה, שתי המטרות postsynaptic הנפוצות בעולם לנוירונים קוצניים בינוני GABAergic in vivo, α1 / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 GABA Rs 32) מאוד מפחית את המורכבות של אותות טרנס-סינפטי זמינים על פני השטח postsynaptic ומאפשר ניתוח כמות מדויק של יעילותו של חלבון זה בקידום היווצרות הסינפסה.

<table><tbody><tr><td>DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>חם באמבט מים ב-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>סכנה:</td></tr><tr><td>מגרה FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Life Technologies</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Neuralbasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>חם באמבט מים ב-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>תוסף B27 Life</td><td>Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) וקטור ביטוי יונקים (ברירה גנטית)</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) וקטור ביטוי יונקים (בחירת זאוצין)</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) וקטור ביטוי יונקים (בחירת היגרומיצין)</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>HEK&alpha יציב; 1&בטא; 2&גמא; 2 קו</td><td>Sanofi-Synthelabo, Paris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418 מלח דיסולפט (גנטיצין)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>סכנה: מגרה</td></tr><tr><td>Phleomycin D1 (Zeocin)</td> <td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>סכנה: רעיל, מגרה וקורוזיבי</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>חם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות; C לפני השימוש. סכנה: מגרה.</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m מסננת תאי ניילון</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>סכנה:</td></tr><tr><td>חומר כלאטי מגרה (Versene)</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה ליפוזומלי (Lipofectamine LTX) עם מגיב חציצה טרנספקציה ליפוזומלי (מגיב PLUS).</td><td>Life Technologies</td><td>15338-100</td><td>שיטת טרנספקציה חלופית: מגיב אפקטן</td></tr> מגיב <tr><td>טרנספקציה לא ליפוזומלי (מגיב אפקטן)</td> <td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>מדיום סרום מופחת (Opti-MEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-סינפטוטמין של עכבר מצומד ל-Cy5</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA (אלבומין סרום בקר)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-גמא שרקנים; 2 GABAA נוגדן לקולטן</td><td>פרופ' ז'אן מארק פריטשי</td> N<td>/A</td> <td>(המכון של ציריך, שוויץ) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-גלוטמט דקרבוקסילאז (GAD)65 נוגדן</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נוגדן נגד סינפסין</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-ובטא; 2/3 נוגדן (BD17)</td> <td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי ואלפא; 1 נוגדן קולטן GABAA</td><td>פרופסור אן סטיבנסון</td><td>N/A</td> <td>(בית הספר לרוקחות של UCL, לונדון) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172</td></tr><tr><td>עז נגד שרקנים מצומד לנוגדנים Cy5</td><td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 488 נוגדן</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 405 נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 555 נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב Alexa Fluor 488 נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>מגיב הרכבה (Prolong Gold)</td> <td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>שימוש בטמפרטורת החדר</td></tr></tbody></table>

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב gabaergic בינוני קוצניים וhek293 תאים ביציבות להביע gaba רצפטורים

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

נוירונים מעכבים פועלים במערכת העצבים המרכזית כדי לווסת את הדינמיקה והתיאום המרחבי-זמני של רשתות עצביות. GABA (חומצה γ-אמינו-בוטירית) היא המוליך העצבי המעכב העיקרי במוח. הוא משתחרר מהטרמינלים הפרה-סינפטיים של נוירונים מעכבים בתוך צמתים בין-תאיים מיוחדים ביותר המכונים סינפסות, שם הוא נקשר לקולטני GABAA (GABAARs) הנמצאים בקרום הפלזמה של הנוירונים הפוסט-סינפטיים המקבלים סינפסות. הפעלת תעלות יונים אלה מגודרות GABA מובילה לזרם של כלוריד וכתוצאה מכך שינויים פוטנציאליים פוסט-סינפטיים המפחיתים את ההסתברות שתאי עצב אלה ייצרו פוטנציאל פעולה. 
במהלך ההתפתחות, לסוגים מגוונים של נוירונים מעכבים בעלי מאפיינים מורפולוגיים, אלקטרופיזיולוגיים ונוירוכימיים מובהקים יש את היכולת לזהות את נוירוני המטרה שלהם וליצור סינפסות המשלבות תת-סוגים ספציפיים של GABAARs. עיקרון זה של עצבוב סלקטיבי של מטרות עצביות מעלה את השאלה כיצד השותפים הסינפטיים המתאימים מזהים זה את זה. 
כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים, הוקמה מערכת מודל חדשה של תרבית משותפת במבחנה, שבה נוירונים GABAergic קוצניים בינוניים, אוכלוסייה הומוגנית מאוד של נוירונים שבודדו מהסטריאטום העוברי, תורבבו עם קווי תאי HEK293 שעברו טרנספטציה יציבה המבטאים GABAA שונהתת-סוגים R. סינפסות נוצרות במהירות, ביעילות ובאופן סלקטיבי במערכת זו, והן נגישות בקלות לכימות. התוצאות שלנו מצביעות על כך שתתי-סוגים שונים של GABAAR נבדלים זה מזה ביכולתם לקדם היווצרות סינפסות, מה שמרמז על כך שניתן להשתמש במערכת מודל מופחתת זו במבחנה כדי לשחזר, לפחות בחלקם, את תנאי ה-in vivo הנדרשים לזיהוי השותפים הסינפטיים המתאימים ויצירת סינפסות ספציפיות. כאן מתוארים תחילה הפרוטוקולים לתרבית הנוירונים הקוצניים הבינוניים ויצירת קווי תאי HEK293 המבטאים GABAARs, ואחריהם הוראות מפורטות כיצד לשלב את שני סוגי התאים הללו בתרבית משותפת ולנתח את היווצרותם של מגעים סינפטיים.

הפרוטוקול עבור מערכת מודל שיתוף תרבות תאי נוירון HEK293 זה כבר מכוון היטב כדי לאפשר את הישרדות תא אופטימלית. במערכת זו, היווצרות של אנשי קשר כמו סינפסה-וניתוחם מסתמך על ביטוי יציב ועקבי של כל שלוש יחידות משנה GABA R שיותכו קולט פונקציונלי. לכן חשוב להשתמש בניתוח immunocytochemical למבחן לביטוי למקטע על פני השטח של תא HEK293 לפני הוספתן לתרבויות עצביות. בניסויים אלה, ביטוי פני תא של α1, β2 ותת-יחידות γ2 (איור 1 א), או α1, β3 וγ2 יחידות משנה (איור 1), זוהה באמצעות נוגדנים למקטע ספציפי שנקשרים לאפיטופים תאיים של תת-יחידות אלה. רמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין תת-יחידות אלה על פני השטח HEK293 הודגמה. לאחר אישור הביטוי על פני השטח ושיתוף הלוקליזציה של GABAתת-יחידות R בתאים, שיתוף תרבויות HEK293 הוכנו באמצעות HEK293 תאים לבטא יחידות משנה α1 / β2 / γ2 GABA R ונוירונים קוצניים בינוני בתרבית למשך 14 ימים (14 ימים במבחנה (DIV)). תאים בשיתוף התרבות הודגרו למשך 24 שעות, קבועים ונותחו באמצעות immunocytochemistry ומיקרוסקופיה confocal. ניתוח של קשר ציין כי מסופי האקסון GAD65 חיובי GABAergic נוצרו רק אנשי קשר סדירים עם שליטת HEK293 התאים (איור 2 א, 2 ב). מספר אנשי הקשר שזוהו בשעה 4 שעות היה 7.3 ± 0.9 לכל תא HEK293, ומספר זה ירד לרמה של 5.5 ± 0.5 חיבורים (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 לנוירונים בתרבית. בניגוד לכך, מסופי האקסון GABAergic GAD65 החיוביים נוצרו קשר כמו סינפסה-רב עם HEK293 תאים המבטאים Rs GABA. מספר אנשי הקשר שהושג ב 4 שעות לאחר הוספת תאי HEK293 היה 28.3 ± 4.7 לכל תא HEK293, ומספר זה היה עלייה נוספתד ל52.1 ± 6.3 (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 ב 24 שעות בשיתוף התרבות (איור 2A, 2B). כדי לקבוע אם מגעים הללו כמו סינפסה-היו 'פעילים', כלומר נתמך לשחרר משדר לפוחי, נוגדן Cy5 מצומדות- אנטי-synaptotagmin תחום ספציפי שלפוחית-luminal התווסף למדיום התרבות המשותפת לאחר 23 שעות של דגירה. נוגדן זה משולב רק למסוף עצב presynaptic כאשר צורות נקבוביות בין לומן שלפוחית ​​הסינפטית ונוזל החוץ תאי במרווח הסינפטי בשחרור הנוירוטרנסמיטר. לאחר שחרור, הנקבובית נסגר, עוזב את synaptotagmin נוגדן פלואורסצנטי Cy5 מצומדות- מצורף לsynaptotagmin בתוך השלפוחית. בדרך זו, רק שלפוחית ​​מעורבת באופן פעיל בשחרור הנוירוטרנסמיטר מסומנים עם הנוגדן. בניסויים אלה כמה אם אנשי קשר או אי התאמה בין השליטה HEK293 תאים ומסופי נוירון הקוצני הבינוני היו 'פעיל &amp; #8217; כפי שמוצג על ידי חוסר שיתוף הלוקליזציה בין GAD65 / הקרינה סינפטי synaptotagmin וקרינת mCherry בHEK293 תאים (איור 3 א). בניגוד לכך, אנשי קשר "פעילים" רבים נוצרו בין המסופים בינוני נוירון הקוצני וα1 / β2 / γ2 להביע תאי HEK293, כפי שנחשף ברמה גבוהה של שיתוף לוקליזציה בין GAD65 / synaptotagmin וmCherry, הביע באופן ספציפי בתאי HEK293 ( איור 3 ב). α1 כדי לבדוק אם תת-סוג של GABA R שונה גם יכול לקדם היווצרות כמו סינפסה-במבחנה, יש לנו שיתוף תרבותי / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293 עם הנוירונים קוצניים בינוניים. שוב, HEK293 תאי שליטה לעתים רחוקות קיבלו קשר עם מסופי presynaptic synapsin חיובי לכת 10.8 ± 0.48 (ממוצע ± SEM) אנשי קשר לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (משמאל איור 4 א, ​​4 ב). עם זאת, תאי HEK293 להביעα1 / β3 / γ2 צורת GABA Rs יותר באופן משמעותי אנשי קשר כמו סינפסה-עם מסופי synapsin החיובי presynaptic של נוירונים הקוצניים בינוני לכת 25.3 ± 0.27 אנשי קשר (ממוצע ± SEM) לכל תא HEK293 לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (מימין איור 4 א, 4 ב). זה מצביע על כך α1 / β3 / γ2 GABA Rs לידי ביטוי בתאי HEK293 גם יכול לקדם היווצרות קשר הסינפטי, אם כי העוצמה שלהם היא נמוכה יותר מהעצמה של α1 / β2 / RS GABA המכילים γ2. ניסויים אלה מצביעים על כך שמערכת מודל שיתוף התרבות שפותחה במעבדה שלנו מאפשרת ניתוח כמותי של קשר היווצרות הסינפטי במבחנה, כמו גם הערכה של יעילותן של תת-סוגים שונים של RS GABA בתהליך זה. ניסויים אלה מראים עוד כי GABA R, בנוסף להיותו רכיבים פונקציונליים קריטיים של סינפסות GABAergic, עשוי לשחק תפקיד מפתחבתהליך של הכרה ויצירת קשרים סינפטיים בין נוירונים מעכבים ותאי המטרה עצביים המתאימים, באופן עצמאי של חלבוני הדבקה הסינפטי אחרים. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600"> איור 1. Immunocytochemical ניתוח ביטוי של α1 GABA R / β2 / γ2 או α1 / β3 / γ2 בשורות תאי HEK293 יציבים. נוגדנים הכרה בתחומים תאיים של תת-יחידות GABA R שמשו לקולטנים תווית הביעו על פני התא. ( ) Α1 להביע שורת תאי HEK293 (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5) ברמות גבוהות. (Α1 שורת תאי B) HEK293 להביע (אלקסה פלואוריד 488), β2 (אלקסה פלואוריד 555) וγ2 (Cy5)תת-יחידות ברמות גבוהות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600"> נוירונים קוצניים בינוני איור 2. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β2 / γ2- לבטא בתאי HEK293 בשיתוף התרבות. (א) תיוג של פלורסנט מסופי presynaptic עם אנטי GAD65 נוגדנים (בירוק) וHEK293 תאים עם mCherry (באדום, משמאל) γ2 מקטע או GABA R (בכחול, מימין), חשפו נקודות של לוקליזציה שיתוף בין אלה סמנים המצביעים על היווצרותו של קשר כמו סינפסה-אחרי 4 או 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר (ב) ניתוח כמותי של שיתוף כמו סינפסה- ntacts. HEK293 תאים זוהו על פי צורתם כפי שנחשפו על ידי הדמיה דסק"ש ו / או ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין GAD-65 puncta החיובית (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8 - 10) לכל תא באמצעות תוכנת ההדמיה, ומתבטאות במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β2 (שחור) לאחר 4 ו 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8 בכל אחד מצב משני ניסויים בלתי תלויים). נתון זה שונה מפוקס ואח '. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מודעה / 52,115 / "width =" 52115fig3highres.jpg 600 "/&gt; Rs 3. GABA איור לקדם היווצרות של אנשי קשר פעילים הסינפטי. Immunolabeling של אנשי קשר כמו סינפסה-נוצרו לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות בין מסופי הנוירון קוצניים הבינוני חיוביים לGAD65 (אלקסה פלואוריד 405 ציאן) ו- (א) בתאים HEK293 שליטה, או / Β2 / γ2 HEK293 תאים-α1 (B), שניהם זמניים transfected עם mCherry לבנות (אדום). אנשי קשר פעילים מזוהים על ידי שיתוף לוקליזציה בין הנוגדן לומינל שלפוחית ​​תחום ספציפי נגד synaptotagmin (Cy5) ונוגדן GAD65 הספציפי הן במסופי presynaptic, וmCherry לידי ביטוי בתאי HEK293. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> igure 4 "FO: = תוכן רוחב" "src =" 6in / קבצים / ftp_upload / 52,115 / "width =" 52115fig4highres.jpg 600 "/&gt; נוירונים קוצניים בינוני איור 4. GABAergic יצירת קשרים כמו סינפסה-עם α1 / β3 / מקטע γ2- להביע HEK293 תאים בשיתוף התרבות. תיוג פלורסנט של מסופי presynaptic עם אנטי synapsin אני נוגדנים (בירוק), ושליטה HEK293 תאים (משמאל), או α1 () / β3 / γ2 לבטא בתאי HEK293, שני transfected הזמני עם mCherry (באדום), חשף נקודות לוקליזציה שיתוף בין סמנים אלה מעידים על היווצרות קשר כמו סינפסה-לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (B). ניתוח כמותי של אנשי קשר כמו סינפסה. HEK293 תאים זוהו על ידי ביטוי mCherry, ומספר אנשי הקשר בין synapsin אני חיובי puncta (בירוק) ואת פני השטח של תאי HEK293 נספר על ידי העין בכל חלק אופטי של סדרת Z-מחסנית (8-10) לכל תא באמצעות תוכנת הדמיה, ומתבטא במספר אנשי קשר / תא. הגרף מציג את מספר אנשי הקשר בין הנוירונים בינוניים קוצניים ושליטה HEK293 תאים (אפור בהיר) או α1 / תאים / γ2-HEK293 β3 (שחור) לאחר 24 שעות בשיתוף התרבות (ממוצע ± SEM, n = 8-12 תאים ב כל מצב, משני ניסויים בלתי תלויים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) transfected ביציבות להביע קולטני GABA פונקציונלי.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

מטרת הליך זה היא להקים תרביות משותפות בין נוירונים עובריים, מסתובבים בינוניים ותאי HEC 2 9 3 המבטאים ביציבות קולטני GABA A כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המצפים את היווצרות סינפסות GABAergic במבחנה. זה מושג על ידי ניתוח ראשון של ה-stri AUM מ-E 16 עד 17 עוברי חולדות או עכברים. בשלב השני, תאי ה-AAL של הסטרי מצופים על גבי תלושי כיסוי.בצלחת 24 בארות הבא HEC 2 9 3 תאים המבטאים ביציבות קולטני GABA A עוברים טרנספטציה עם מחוון פלואורסצנטי דובדבן M. בשלב האחרון, התאים שעברו טרנספטציה עוברים תרבית משותפת עם הנוירונים הקוצניים הבינוניים ב-14 יום במבחנה למשך 24 שעות לפני הקיבוע. בסופו של דבר, ניתן לדמיין את היווצרות הסינפסות בין שתי תת-קבוצות התאים על ידי אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות שכן סינפסות GABAergic מתאמות את פעילותם של תאים עצביים ואחראיות לאלמנטים מבניים ותפקודיים בסיסיים רבים של מעגלים עצביים במערכת העצבים המרכזית. לפני תחילת הניסוי דגרו למשך הלילה 13 מילימטר פוליאול מצופה ליזין. בצלחת של 24 בארות, 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם לחות למחרת שואבים את עודפי הפוליאול ליזין ושוטפים את החלקות הכיסוי בשתי שטיפות באורך עשר שניות ושתיים באורך חמש דקות במים סטריליים.לאחר מכן דגרו את החלקות הכיסוי למשך הלילה בלמינין באותם תנאים ביום הניסוי. ראשית הניחו עכבר בהריון במצב שכיבה על משטח חיטוי אתנול. לאחר מכן צובטים את העור בפינצטה וחותכים סביב הבטן דרך העור, השריר והצפק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים והרחם.לאחר מכן, הוציאו מהרחם את העוברים ביום העוברי 16 עד 17 והניחו אותם בצלחת פטרי המכילה PBS צונן. העבירו את העוברים לתוך מכסה הזרימה הלמינרי כדי להכניע את הראשים לצלחת פטרי חדשה עם HBSS צונן ולאחר מכן השתמשו במלקחיים מעוקלים וישרים כדי לנתח כל אחד מהמוחות. אספו את המוחות בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS צונן.ואז עבור כל מוח, הפרד את שתי ההמיספרות המוחיות והסר בזהירות את קרומי המוח. לאחר מכן, חתכו לאורך קו ההיפוקמפוס וקילפו את קליפת המוח לאחור כדי לחשוף את הסטריאטום. מבנה לבן רווי בחלק הקדמי של חצי הכדור מנתח את השכבה בזהירות רבה כדי להימנע מהכללת רקמה מהמחוך ומניח בצלחת פטרי חדשה.מכיל HBSS צונן חותכים את הטור לחתיכות קטנות מאוד של מילימטר עד שניים באמצעות המלקחיים המעוקלים. לאחר מכן השתמש בפיפטה פסטה מלוטשת באש כדי להעביר את הרקמה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. צמצם את נפח תרחיף הרקמות לסך של מיליליטר אחד ופיפטה את התמיסה ארבע עד שש פעמים נוספות ללטש ביו את קצה הפיפטה לכ-30% מהקוטר המקורי שלה כדי לדרג את התמיסה פי שלוש נוספות כאשר התמיסה נראית הומוגנית מובנית לתמיסת התא דרך מסננת ניילון של 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר.לאחר מכן, לאחר ספירת צלחת שבע כפול 10 בחזקת ארבעה תאים לתוך 500 מיקרוליטר של תרבית עצבית, עוצמה בינונית היטב לצלחת תרבית רקמות של 24 בארות. ערבב את הבאר משמאל לימין ולאחר מכן דגר על התאים למשך 14 יום כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו כל באר פעמיים לזמן קצר עם PBS כדי לנתק את התאים מצלחת שש הבארות.הוסף תמיסת EDTA של טריפסין לכל באר ודגר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם לחות למשך חמש דקות כדי לעצור את התגובה ולהרוות את הכניסה להוסיף מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים לכל באר ולהעביר את התוכן לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ולצנטריפוגה את התאים ב-440 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הסר את הסופינט והשהה מחדש את הגלולה לחלוטין ב -500 מיקרוליטר של תרבית עצבית. מדיום על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות לאחר ספירת זרעים, שלוש פעמים 10 לארבעת התאים לבאר בצלחת תרבית רקמת 24 באר המכילה את הנוירונים ומערבב את הצלחת כדי לפזר את התאים. דגרו על תרביות הקו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.בתמונות אלה, נצפה ביטוי פני התא של תת-יחידות אלפא אחת, בטא שתיים וגמא שתיים GABA AR או תת-יחידות אלפא אחת, בטא שלוש וגמא שתיים GABA AR עם רמה גבוהה של קולוקליזציה על תאי HC 2 93. הנה. ניתוח המגעים בין תא לתא בין תאי HC 2 93 לתאי העצב ב-14 יום במבחנה מצביע על כך שמסופי GABAergic Axon חיוביים של GAD 65 יוצרים רק מגעים ספורדיים עם תאי הבקרה HEC 2 9 3 בהשוואה למגעים דמויי סינפסות רבים שנוצרו בין תאי HEC 2 93 המבטאים את האלפא, בטא שני קולטני גמא שני GABAA. בניסויים אלה, רק השלפוחיות המעורבות באופן פעיל בשחרור המוליך העצבי סומנו עם נקודת המבט של נוגדן אנטיס סינפ טואין.אם אחד מהמגעים בין תאי הבקרה HEC 2 9 3 לבין מסופי הנוירונים המסתובבים הבינוניים היה פעיל. זה מודגם על ידי היעדר קולוקליזציה בין הקרינה הטינית הסינפטית הפרה-סינפטית GAD 65 לבין הקרינה mCherry בתוך תאי HEC 2 93. לעומת זאת, נוצרו קשרים פעילים רבים בין מסופי הנוירונים הקושרים את המדיומים לבין קולטן האלפא אחד, בטא 2 גמא 2 גבא המבטא תאי HEC 2 93 כפי שהתגלה על ידי רמה גבוהה של קולוקליזציה בין סינפת GAD 65 Taman לבין פלואורסצנטי דובדבן M המתבטא במיוחד בתאי HEC 2 93.בתמונות הסופיות הללו, תאי HEC 2 93 המבטאים ביציבות תת-סוג אחר של GABA AR עברו תרבית משותפת עם נוירונים קוצניים בינוניים. הניתוח מדגים מספר רב של מגעים דמויי סינפסות שנוצרו בין סינפסה בפעולה חיובית אחת של GABAergic על מסופים ואלפא אחד B שניים שלושה גמא שניים המבטאים תאי HEC 2 9 3 לאחר 24 שעות. בתרבות משותפת, לטכניקה זו יש פוטנציאל לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח המולקולריים לחקור את תפקידן של מולקולות הידבקות סינפטיות שונות המעורבות ביצירת סינפסות GABAergic.

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

כאן אנו מדגימים את השימוש בצבע ניאון אלקסה מצמידים את α-bungarotoxin למדוד GABA לוקליזציה הקולטן לפני השטח ואנדוציטוזה בנוירונים בהיפוקמפוס. באמצעות השימוש במבנים הנושאים תג תאי קצר שנקשר α-bungarotoxin, ניתוח של סחר endocytic פלזמה קרום חלבון יכול להיות מושגת.

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה מתאר מיון תא שיטה מבוססת על טיהור ותרבות של GABAergic פלורסנט או glutamatergic נוירונים מקליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים לאחר הלידה או חולדות.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

כאן, תיארנו פרוטוקול כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון (AIS) של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק.

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

מלאי קפוא מוכן לשימוש של נוירונים הוא כלי רב עוצמה להערכת תפקודים סינפטיים. כאן, אנו מציגים תרבית ראשונית קלה בצפיפות נמוכה ממלאי קפוא באמצעות צלחת של 96 בארות.

תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

מחקר זה מציג מסגרת רב-ממדית, המשתרעת מ-DNA לתפקוד חלבון והתנהגות עצבית. הוא מציג גישה חדשה לחקירת מוטציות פתוגניות חזויות בתת-היחידה של קולטן GABAA , ומשער כי מוטציות אפילפטוגניות ומוטציות פרוקסימליות, הצפויות כפתולוגיות, עשויות לייצר השפעות דומות על מודל הנוירונים הפירמידליים CA1.

זיהוי וסיווג של גרסאות missense של תת-יחידה לקולטן GABAA ספציפיות לתפקידן בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס

חקור את מנגנוני היווצרות הסינפסה GABAergic באמצעות מודל תרבות משותף של נוירונים קוצניים בינוניים עובריים ותאי HEK293 המבטאים קולטני GABA A. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של מגעים סינפטיים פעילים ומסייעת להבנת הפרעות נוירולוגיות הקשורות לתפקוד סינפטי.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA רצפטורים

גלה סרטונים נוספים