Name: בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד שיטות ציטומטריית זרימה לניתוח תגובות תאי T נגד וירוס הנילוס המערבי. השיטות מודדות יכולת הצגת אנטיגן של תאי דנדריטיים והפעלת תאי T ספציפיים במעבדה בטוחה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH ל-T.W. (R01AI072060 ו-R01AI099123). G. Xie נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של מרכז Sealy לפיתוח חיסונים. אנו מודים לד"ר ריצ'רד פלאוול (המכון הרפואי הווארד יוז, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל, ניו הייבן) ולד"ר שיזואו אקירה (אוניברסיטת אוסקה, יפן) על אספקת עכברי MyD88–/– ולד"ר Y Cong (UTMB, גלווסטון) על אספקת עכברים טרנסגניים OTII.

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טקסס רפואית הסניף. 1. בידוד של DCs מעכברים נגועים ללא ונגוע WNV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה לגיל ושיסוד פעילות המינית 6-10 בן שבוע, wild-type C57BL / 6 (B6) וMyD88 - / - עכברים. לחסן intraperitoneally (IP) עם 500 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) של המוטציה WNV NS4B- P38G. ביום 3 לאחר פגיעה, להרדים MyD88 B6 ו-- / - עכברים עם CO 2. השתמש בעכברים שאינם נגועים בשתי הקבוצות שולטת. השתמש בשלושה עכברים מכל קבוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרווה רטובה על צד השמאלי של עכבר הקריב באמצעות אתנול 70% וחתכה את הפרווה בצד השמאלי של העכבר, כמחצית דרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות. גזור לפתוח את חלל הגוף. הסר את הטחול באמצעות המלקחיים. מניחים את הטחול בצלחת פטרי עם RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד DCs טחול באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-CD11c פיהוראות היצרן. </li></ol> 2. טיהור ותיוג של תאי T של עכברים הטרנסגניים OTII <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר טחול אחד מעכבר OTII נאיבי כמתואר בשלב 1.2 לעיל וhomogenize הטחול בין הקצוות החלבית של שתי שקופיות. מעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף בינוני RPMI עד 14 מיליליטר. בואו ההשעיה לשבת במשך 5 דקות ולהעביר 13 מיליליטר של אותו צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי CD4 + T טחול באמצעות ערכת בידוד תא CD4 + T על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר, לשטוף פעמיים עם PBS. תאים גלולים בPBS עם אלבומין 0.5% בסרום שור (BSA) בשעה 1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר, ולהוסיף 0.5 μmol / מיליליטר של CFSE. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר בינוני מלא קר (RPMI-1640 עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת, כרך 1/100אנטיביוטיקה / antimycotics, 1/100 כרך L-גלוטמין ו 1/1000 כרך של 1000 x 2-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 5 דקות. לשטוף את תאי פעם עם PBS, לתקן 0.2 x 10 6 תאי CD4 + T שכותרתו ב 2% PFA ולרכוש על cytometer זרימה. השתמש בדוגמה זו כדי לקבוע את הרמה הבסיסית של CFSE. מחדש להשעות את שאר תאים שכותרתו במדיום מלא. </li></ol> 3. תאים Co-תרבות OTII T עם DCs של עכברים נגועים WNV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 2 x 10 5 תאים של עכברי OTII CD4 + T מטוהרים לבד או עם DCs המטוהר של wild-type או MyD88 - / - עכברים (2 x 10 4) בצלחת גם 24 עם או בלי שאריות OVA 323-339 (ז 1 / מיליליטר) ב 1 מיליליטר בינוני מלא בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. קציר תאים, לשטוף פעמיים במאגר FACS (PBS עם 1% FBS) ולתקן ב0.25 מיליליטר 2% PFA. מערבולת באופן מיידי. </li></ol> 4. ניתוח תזרים Cytometry של במבחנה &lt;/ Em&gt; תא T לקרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישה, לחץ לחיצה כפולה על סמל תוכנת cytometry הזרימה. עבור חלקת צפיפות של יניארי FSC-מול SSC-ליניארי, ערוצים בחרו 0 עד 200,000 בFSC-ו0 עד 200,000 על SSC-. ואז ליצור שער על תאי חיים (P2, ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את עוצמת הקרינה של CFSE, לפתוח את ההיסטוגרמה עבור ערוץ FL1 ולרכוש 20,000 אירועים על האוכלוסייה מגודרת. הגדר את סמן על דגימות תאים בתרבית OTII לבד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דוגמאות לתאי OTII שיתוף תרבותיים עם DCs wild-type (איור 1) או MyD88 - / - DCS (איור 1 ג) באופן דומה. </li></ol> 5. בידוד וגירוי של Splenocytes לציטוקין מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק B6 וMyD88 - / - עכברים עם המוטציה WNV NS4B-P38G באותו האופן כפי שתואר בSTEp 1.1. ביום 30 לאחר פגיעה, מחדש אתגר ששרד עכברים עם 2000 PFU של ip הזן הפראי סוג WNV בימים 8 ו -21 זיהום על-יסודי WNV או ביום 4 הבאים זיהום משני, להרדים עכברים עם CO 2 לאוסף של טחולים . הערה: השתמשנו 2-3 עכברים בכל קבוצה לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך השעיה תא בודדת של splenocytes כמתואר לעיל בשלב 1.2 ושלב 2.2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות אותם ב 10 מיליליטר בינוני שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים עם מדיום מלא ל -2.5 x 10 6 תאים / מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של splenocytes בצינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדמות תאי CD8 + T, לדלל פפטידים WNV הספציפי NS4B וE (SSVWNATTA וIALTFLAV) ל1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO. לגירוי של תאי CD4 + T, לדלל פפטידים WNV הספציפי ns3 ו- E (RRWCFDGPRTNTILE וPVGRLVTVNPFVSVA) ל1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO. הוסף 10 μl של פפטידים לתאים followeד על ידי 1 μl של פתרון Brefeldin. השתמש בתאים ללא טיפול פפטידים כפקדים. מערבבים את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף שני חורים עם מחט G 18 בכובע של הצינור. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות. </li></ol> 6. תאיים ציטוקין מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי צינור מיקרו צנטריפוגות חדשה. ספין תאים 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ, ספין 5 דקות ב300-400 XG מחדש להשעות תאים על ידי pipetting עם 120 μl FACS חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl חוסם Fc דגירה תאים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ על צינור אחד. ספין 5 דקות ב300-400 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב300 μl FACS חיץ ולפצל אותם לשלושה צינורות (כ -0.8 x 10 6 תאים לכל צינור). כפי שניתן לראות בטבלה 1, שומרים לעצמנו את הצינור הראשון של כל מצב תרבות לחולדת צביעת IgG-PE. לצינור השני, להוסיף 3 μl של אנטי-CD4 APC לCD4 תאי פפטידים שטופלו, 3 μl אנטי CD8 FITC לתאים שטופלו-פפטידים CD8 או שניהם הנוגדנים לתאים ללא טיפול פפטידים. השתמש בצינור השלישי לצביעת פיצוי. עבור כל מצב תרבות, להשתמש בשלושה צינורות של תאי CD4 מוכתמים בAPC-מצומדות, CD8 FITC- מצומדות או נוגדני PE- כותרת CD3 לבד (3 μl לכל צינור) כפקדי פיצוי על FL1, fl2 וערוצי FL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בקצרה מערבולת. השאר על קרח למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. להוסיף 1.4 מיליליטר חיץ FACS. ספין 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס לשבש תא גלולה (או בקצרה מערבולת). מחדש להשעות תא גלולה ב250 pipetting solutionby הקיבעון / permeabilization μl. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר חיץ FACS. דקות ספין 5 ב300-400 תאי XG וגלולים במאגר FACS 300 μl. הערה: בשלב זה, ניתן להעביר תאים למעבדה BL2 לעיבוד נוסף או לאחסן במקרר ומוגן מפני אור לup לשלושה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl FACS חיץ. ספין 5 דקות ב300-400 תאי XG וגלולים ב500 μl של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר &#39;x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב100 μl 1x פרם / לשטוף, להוסיף 3.5 אנטי-IFNγ-PE μl לצינור הוסיף בעבר עם נוגדנים לCD4 ו / או סמני תא CD8 T בשלב 6.3 ועכברוש μl 3.5 IgG-PE בצינור שמורות לשליטת IgG במשך 25 דקות על קרח ולהגן מפני אור. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר &#39;x. חזור על שלב הכביסה על ידי הוספת 1.4 מיליליטר 1x חיץ permeabilization / לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 5 דקות ב300-400 XG ולמזוג supernatant. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ FACS מחדש להשעות ב400 μl של חיץ FACS לרכישה סופית. </li></ol> 7. ניתוח תזרים Cytometry של תאיים ציטוקין מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותן הגדרות כמו בשלב הרכישה 4.1. Create שער על תאי חיים (P2, ראה איור 2 א). התאם את המתח באמצעות צינורות פיצוי לכל אחת מקבוצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מגרשי נקודה חדשים פתוחים, אחד כדי להציג נתונים שנאספו לFL1 vs. Fl2 (CD8 vs. IFN-γ), והשני הוא להציג נתונים שנאספו לFL4 vs. Fl2 (CD4 vs. IFN-γ). לרכוש 50,000 אירועים לאוכלוסייה מגודרת של כל דגימה. </li></ol>

<ol><li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li>
<li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li>
<li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li>
<li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li>
<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vgamma4%2B+T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

WNV הוא פתוגן BL3. בשל תקנות בטיחות, מבחני אימונולוגיים עם דגימות נגועות WNV לעתים קרובות מוגבלים על ידי הזמינות של ציוד במתקנים BL3 או יותר ארוכים ומייגע לבצע. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשתי שיטות מבוססות cytometry זרימה ללמוד תגובות חיסוני בתיווך תא במהלך זיהום WNV 5. בשני מבחני, טופלו תאים נגועים בWNV עם 1-2% PFA ישירות או עם פתרון הקיבעון / permeabilization המכיל 4% PFA. זה ידוע כי 1% קיבעון PFA של תאים נגועים בנגיף ביעילות יכול להפחית את מספרם של חלקיקים מזהמים ...

וירוס הנילוס המערבי (WNV), neurotropic, בתוספת חש-flavivirus, הוא איום על בריאות ציבור מתעורר. נכון לעכשיו, אין חיסונים אושרו לשימוש בבני אדם 1. זן WNV מוחלש, שבו יש תחלופה P38G בחלבון 4B nonstructural (NS), ידוע לגרום לא קטלני בעכברים אבל ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T בעכברים מאשר wild-type WNV NY99 זן 2. עכברים שחוסנו עם המוטציה NS4B-P38G היו מוגנים מפני כל אתגר המשני עם wild-type הקטלני WNV. הדבר מצביע על כך שיש המוטציה NS4B-P38G תכונות מתאימות למועמד אידיאלי חיסון. המנגנונים שבאמצעותם המוטציה NS4B-P38G גורמת חסינות אדפטיבית מגן גבוהה לא ברור הם הבינו עדיין. קולטנים כמו אגרה (TLRs), אשר מכירים הבקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, ממלאים תפקיד חיוני בייזום של חסינות מולדת לזיהום נגיפי. מסלול איתות TLR ליבה מנצל תגובה הראשונית בידול מיאלואידית gene 88 (MyD88) כמתאם הראשי 3,4. במחקר שנערך לאחרונה, איתות MyD88 הוצגה לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של חסינות תא בתיווך בזיהום המוטציה WNV NS4B- P38G בעכברי 5. תאי Dentritic (DC) הם אחד מתאי מציגי אנטיגן החשובים ביותר מציגים היכולת הייחודית ליזום תגובות תא T העיקרי בזיהום ויראלי 6,7. CD4 + CD8 + ותאי T הן לתרום לחסינות לטווח ארוכה וחשובים להישרדות מארח בעקבות זיהום WNV wild-type 8,9. שני מבחני אימונולוגיים שמשו במחקר זה להעריך את הפונקציות של תאים אלה בעכברים שעברו מוטציה נגועה NS4B-P38G. ראשית, assay תחול במבחנה תא T נוצל כדי להשוות את יכולת מציגי אנטיגן של DCs של נגוע WNV wild-type וMyD88 - / - עכברים. כדי להגביר את הרגישות של assay, CD4 הנאיבי &lt;sup&gt; + תאי T היו מבודדים מעכברים מהונדסים OTII, המבטאים ספציפי Vα2 / Vβ5 TCR לovalbumin העוף פפטיד (OVA) 323 - 339. DCs של עכברים נגועים WNV היה מטוהרים, ושיתוף תרבותי עם carboxyfluorescein succinimidyl פסחא (CFSE ) תאי CD4 + T שכותרתו בנוכחות פפטיד OVA. לאחר 5 ימים של התרבות המשותפת, תאים נקצרו וקבוע עם paraformaldehyde (PFA) ונותחו על ידי הזרימה cytometry. מבחני שגשוג בוצעו באופן מסורתי באמצעות שילוב של 5-bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) או deoxyriboside tritiated הטימין (3 HTdr) 10. עם זאת, מבחני אלה הם או רדיואקטיביים ו / או בצורך של ציוד מיוחד ברמת הבטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים, שבו מחקרי WNV מתבצעים. ניתוח התזרים cytometric של שגשוג לימפוציטים ידי halving הסידורי של עוצמת הקרינה של הצבע החיוני CFSE הפך נפוץ יותר במבחנים חיסוניים כצבע הוא יותר ביציבותושולב באופן שווה לתאים, זוהה בקלות על ידי cytometry זרימה, והוא nonradioactive 11. Assay יש גם את היכולת להעריך את מספר חלוקות תא. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay זה במחקרי WNV הוא שקיבוע של התאים הנגועים ב1-2% PFA יכול להשבית 12 WNV, אשר יאפשר רכישת מדגם עם cytometer זרימה במעבדה BL2. בשלב הבא, הליך מכתים ציטוקינים תאיים שונה (ICS) שימש כדי ללמוד את התפקיד של MyD88 איתות ברגולציה של תגובות תא T הספציפיות WNV בעכברים הנגוע במוטציה NS4B-P38G. ב assay זה, טופלו splenocytes מבודד מעכברים נגועים במבחנה עם פפטידים ספציפיים WNV. Brefeldin התווסף ללשמור ציטוקינים בתוך התא. אחרי 5 שעות דגירה, תאים נקצרו, שטפו ומוכתמים עבור תת תא T. תאים אז היו קבועים בPFA, permeabilized ומוכתמת לאינטרפרון -γ (IFN) ונותחו על ידי זרימת cytometry.כמו עם assay זרימה אחר מבוסס cytometry, פעם אחת מטופלות התאים עם קיבעון וחיץ permeabilization מכיל PFA, ניתן להעביר דגימות נגועות למעבדה BL2 לעיבוד וניתוח נוספים. במספר מחקרים שפורסמו, השתמשנו ICS למדוד פונקציות מפעיל סלולארי T בעכברים נגוע WNV 13,14. למרות שזה מבוסס היטב, חסרון עיקרי אחד של assay זה הוא שההליך הוא ארוך מאוד ויכול להיות זמן רב יותר כאשר היא מבוצעת בתוך מתקני BL3. כאן, שיטה מבוססת ICS צינור מיקרו צנטריפוגות הוצגה להיות יותר ריאלי, קל יותר להמשיך ופחות זמן רב כאשר היא מבוצעת בתוך מעבדה BL3.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>מתחמם ב-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>Anti-CD11c חרוזים מגנטיים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>עוקבים אחר היצרן הוראות</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים נגד CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>עקוב אחר היצרן' s הוראות</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>שאריות OVA 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>פפטידים</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A תמיסה</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td> <td>מצומד APCe-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>CD8 מצומד FITC</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>פתרון קיבוע/פרמביליזציה</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פרמיביליזציה/שטיפה</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>Accuri BD מדע ביולוגי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בניתוח חוץ גופייה של תיווך myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים mutant

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

וירוס מוחלש הנילוס המערבי (WNV), (NS) 4B-P38G מוטציה nonstructural, מושרה ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T מסוג wild-WNV בעכברים. לאחרונה, גורם בידול מיאלואידית 88 איתות (MyD88) הוצגה להיות חשוב ליחול תא T ראשוני ופיתוח תא T הזיכרון במהלך זיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. במחקר זה, שני לזרום שיטות מבוססות cytometry - במבחנה assay תא T תחול ומכתים ציטוקינים תאיים (ICS) - נוצלו כדי להעריך תאים דנדריטים (DCS) ופונקציות תא T. בתא T תחול assay, התפשטות תאים נותחה על ידי זרימת cytometry הבא שיתוף התרבות של DCs משני הקבוצות של עכברים עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) - שכותרתו תאי CD4 + T של עכברים הטרנסגניים OTII. גישה זו סיפקה קביעה מדויקת של שיעור מתרבים תאי CD4 + T עם שיפור ברגישות לכללית מאשר המסורת באופן משמעותיאל מבחנים עם ריאגנטים רדיואקטיביים. מערכת צינור microcentrifuge הייתה בשימוש בשני הליכי תרבית התאים ומכתים ציטוקינים של פרוטוקול ICS. בהשוואה למערכת מבוססת צלחת תרבית רקמה המסורתית, הליך שינוי זה היה קל יותר לביצוע ברמת בטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים. יתר על כן, טופלו תאים נגועים WNV- עם paraformaldehyde בשני מבחני, שאפשרו ניתוח נוסף מחוץ מתקני BL3. בסך הכל, ניתן להשתמש במבחנה מבחני אימונולוגיים אלה כדי להעריך ביעילות מערכת חיסונית בתיווך תא במהלך זיהום WNV.

בassay תא T תחול, תאי CD4 + T CFSE שכותרתו היו בתרבית עם DCs מטוהר מנגוע המוטציה wild-type NS4B-P38G וMyD88 - / - עכברים בנוכחותו או היעדריו של פפטידים OVA. תאי T שכותרתו בתרבית לבד עם או בלי OVA במשך 5 ימים שמשו כקבוצת ביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 1 א, הכולל תאי T היו סגור לניתוח של עוצמת הקרינה בערוץ FL1. הסמן הוקם על בסיס תאי CD4 + T שכותרתו הטרי ביום 0 כדי לקבוע את קצב ההתפשטות ללא שיתוף התרבות של DCs. הייתה רמה נמוכה ש...

שתי שיטות מבוססות זרימה ציטומטרית - בדיקת תחול תאי T במבחנה וצביעה ציטוקינים תוך תאית שימשו למדידת יכולת הצגת אנטיגן של תאים דנדריטיים ותגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן לזיהום מוטנטי בנגיף מערב הנילוס בעכברים.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להציג שתי בדיקות אימונולוגיות מבוססות זרימה ציטומטרית למדידת התגובה החיסונית המתווכת של התאים לזיהום בנגיף מערב הנילוס בתאים דנדריטיים של תאי T במבחנה, או dcs מטוהרים מעכברים נגועים בנגיף West Nll. תרבית משותפת עם תאי T נאיביים עם תווית CFSE מטוהרים משני עכברים טרנסגניים OT בנוכחות פפטיד ביציות. תגובת ההתפשטות של תאי T מנותחת לאחר מכן על ידי זרימה ציטומטרית במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית שנייה בבדיקת צביעת ציטוקינים תוך-תאית שונה ציטים PLE מעכברים נגועים בנגיף מערב הנילוס, מגורה ex vivo עם פפטידים ספציפיים למערב הנילוס בצינור מיקרו צנטריפוגה ואז התא מקיים ייצור ציטוקינים תוך תאיים ומנותח בצינור על ידי זרימה ציטומטרית במעבדה ברמת הבטיחות הביולוגית השנייה.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבחון את תפקידם של מסלולי איתות ספציפיים בהפעלת תאי T בבעלי חיים נגועים בנגיף הנילוס המערבי, והן מפחיתות משמעותית את זמן הביצועים בתוך מתקנים ברמה 3 של בטיחות ביולוגית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חסינות תאית של נגיף N מערבי, ניתן ליישם אותה גם על פתוגן אחר ברמת בטיחות ביולוגית שלוש עבור בדיקת תחול תאי T במבחנה. התחל בבידוד תאים דנדריטיים של הטחול מפרא מסוג C 57 שחור שש A, שמונה עכברי נוקאאוט שלי מחוסנים בנגיף מערב הנילוס והדברת בעלי חיים לא נגועים בחרוזים מגנטיים נגד CD 11 C בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן כדי לבודד את תאי ה-T, הומוגניזציה של הטחול שנותח מעכבר OT שני עם הקצוות החלביים של שתי שקופיות, העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ואז הוסיפו מדיום RPMI לנפח סופי של 40 מיליליטר. תנו לתאים להתיישב במשך חמש דקות ואז העבירו 30 מיליליטר של הסאפ המתהווה לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בערכת בידוד תאי T חיוביים CD ארבעה בהתאם להוראות היצרן כדי למיין את תאי ה-CD ארבעה תאי T חיוביים ולאחר מכן להעביר את התאים שנאספו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ואחריו שתי שטיפות ב-PBS לאחר השטיפה השנייה, דגרו את התאים ב-PBS עם אלבומין סרום בקר 0.5% באחוז אחד מששת התאים למיליליטר ו-0.5 מיקרומולר למיליליטר CFSE ב-37 מעלות צלזיוס מוגנות מאור לאחר 10 דקות, דגרו את התאים בחמישה מיליליטר קר, מדיום שלם על קרח למשך חמש דקות.לאחר שטיפת PBS נוספת, תקן 0.2 כפול 10 לששת תאי CD המסומנים ב-CFSE ארבעה תאי T חיוביים ב-2% PFA וקבע את הרמה הבסיסית של ביטוי CFSE של תא T על ידי זרימה ציטומטרית. השעו מחדש את שאר התאים המסומנים ב-CFSE, לא שלמים, בינוניים, ולאחר מכן תרבית פעמיים 10 לחמישה מטוהרים או שני CD ארבעה תאי T חיוביים לבד או עם פעמיים כפול 10 לארבעת סוגי הבר המטוהרים או ה-D שלי שמונה שמונה dcs נוקאאוט בצלחת של 24 בארות עם או בלי מיקרוגרם אחד למיליליטר מעל שאריות 3 23 3 39 במיליליטר אחד של מדיום שלם לבאר ב-37 מעלות צלזיוס לאחר חמישה ימים, קצרו את התאים ושטפו אותם פעמיים בעובדות חוצצים ומקבעים את הכדורים ב-0.25 מיליליטר של 2% PFA ומיד מערבל את הדגימות לרכישת נתוני זרימה ציטומטרית. לחץ פעמיים על תוכנת ציטומטריית הזרימה ובחר ערוצים אפס עד 200, 000 בפיזור קדימה ואפס עד 200, 000 בפיזור צדדי כדי ליצור עלילת צפיפות.לאחר מכן צור שער על הבארות החיות כדי לנתח את עוצמת הפלואורסצנט של CFSE. פתח את ההיסטוגרמה עבור ערוץ FL אחד ורכוש 20,000 אירועים על האוכלוסייה המגודרת. לאחר מכן הגדר סמן על הדגימות עבור שני תאים OT שגודלו לבד.רכוש נתונים עבור תרבית משותפת של שני תאים OT עם סוג בר או D שלי שמונה שמונה dcs נוקאאוט באופן דומה לבדיקת צביעת ציטוקינים תוך תאיים. לאחר יצירת תרחיף תא בודד מטחול שנקטף מנגיף מערב הנילוס, עכברים נגועים בנקודות הזמן המתאימות סופרים את התאים ואז מדללים אותם במדיום מלא עד פי 2.5 אחוז מששת התאים לריכוז מיליליטר. לאחר מכן, Eloqua מיליליטר אחד של הציטים לתוך שפופרת מיקרו צנטרי של 1.5 מיליליטר.ואז כדי לעורר את ה-CD שמונה תאי T חיוביים, הוסף 10 מיקרוליטר של פפטידים ספציפיים מערביים מדוללים טריים ואחריהם מיקרוליטר אחד של פלדה. בתמיסה, מערבבים בזהירות את מתלי התאים ולאחר מכן מחוררים שני חורים במכסה הצינור בעזרת מחט בגודל 18 ודוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. לאחר העברת התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש וסובב אותם לאחר שטיפה של מיליליטר אחד של מאגר פקס, השעו מחדש את הגלולה השנייה ב-120 מיקרוליטר של מאגר פקס.לאחר מכן חסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים עם בלוק FC וסמן את הצינורות בנוגדני הניסוי והבקרה המתאימים כמתואר בטבלה. לאחר מכן, דגרו את התאים במאגר קיבוע וחדירה ולאחר מכן העבירו את התאים לרמת בטיחות ביולוגית למעבדה לתיוג עם נוגדני גמא בקרה או אנטי אינטרפרון על פי הטבלה. כדי למדוד את ייצור הציטוקינים התוך-תאיים, הגדר תרשים פיזור קדימה לצד זה כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן שער את התאים החיים באמצעות צינורות הפיצוי כדי להתאים את המתחים לפי הצורך.צור תרשים נקודה אחד כדי להציג את הנתונים שנאספו עבור CD שמונה תאים חיוביים לעומת אינטרפרון גמא חיוביים, ואחריו עוד אחד עבור CD ארבעה תאים חיוביים לעומת אינטרפרון גמא חיוביים ורכוש 50,000 אירועים עבור האוכלוסייה המגודרת של כל דגימה. בניסוי זה, סך תאי ה-C היו מגודרים כדי לקבוע את קצב התפשטות תאי ה-T הבסיסיים. בהיעדר תרבות משותפת עם DCS.כאשר תאי ה-T היו בתרבית משותפת עם DC שבודדו מבעלי חיים נגועים בנגיף הנילוס המערבי, תאי ה-T החיוביים ל-CFSE הראו התפשטות של 87% תאי T המסומנים CFSE בתרבית משותפת עם DCS מ-D שלי שמונה שמונה עכברי נוקאאוט בנוכחות מעל הציגו שיעור התפשטות של 74.5%, מה שמצביע על כך שהמחסור במסלול האיתות D שמונה שלי מוביל לפגיעה ביכולת הצגת האנטיגן על ידי ה-dcs במהלך אפס מערב מוטנטי זיהום בנגיף. אחוז CD הטחול, ארבעה אינטרפרון גמא חיוביים חיוביים ו-CD שמונה תאי T חיוביים לאינטרפרון גמא חיוביים שבודדו מעכברים מסוג בר נגועים בנגיף הנילוס המערבי בנתון מייצג זה היה 0.4% ו-1.7% בהתאמה. בעוד שאחוז תאי הטחול החיוביים הכפולים שבודדו מנגיף הנילוס המערבי הדביק את שמונה עכברי הנוקאאוט שלי היו רק 0.2% ו-0.6%ניתוחים דומים בוצעו עם ציטים שבודדו מעכברים לא נגועים ללא הבדל באחוז תאי ה-T החיוביים הכפולים בין שתי הקבוצות.יתר על כן, האוכלוסיות החיוביות הבודדות של CD ארבעה חיוביים ו-CD שמונה חיוביים לעכברי הבר הנגועים היו 21% ו-13.3% מכלל ציטי ה-SP המגודר, בעוד שהם נקבעו רק כ-15.9% ו-11.2% מ-D שמונה ציטי SP נוקאאוט בהשוואה לקבוצות הנגועות, גם CD 4 חיובי וגם CD 8 תגובות חיוביות של תאי T הופחתו ב-D שלי שמונה שמונה עכברי נוקאאוט בהשוואה לקבוצת הסוג הפראי ביום השמיני לאחר זיהום בנגיף החילזון המערבי המוטנטי. לסיכום, איתות ה-D שמונה שלי מעורב בהפעלה הראשונית של תאי T של שתי האוכלוסיות ותורם ל-CD ארבע תגובות חיוביות של תאי T בשלב מאוחר יותר של ההדבקה. ציטומטריית השפעת המבוססת על פרימז tcell במבחנה המשתמשת ב-CFSE המסומן OT שני תאי T מספקת קביעה מדויקת יותר של אחוז תאי ה-T החיוביים ל-CD4 המתרבים עם הרגישות הכוללת המשופרת משמעותית בהשוואה לפרוטוקולים הסטנדרטיים הנוכחיים.צינור השדה המיקרו, ICS Math שלישי אינו דורש מכשירים מיוחדים, מה שמציע גם בחירה חסכונית יותר וגם גמישה יותר לחוקרים.

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

γ-Herpesviruses (γ-HVs) להקים לאורך החיים התמדה ב המארח שלהם. זיהום של עכברים עם γ-HV68 מספק ממושמע...

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח...

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

וירוסים שפעת A (IAVs) הם חשובים פתוגנים הנשימה האנושית. כדי להבין את פתוגניות של IAVs וכדי לבצע בדיקות פרה גישות חיסון הרומן, חייתיים מחקה פיזיולוגיה אנושית נדרשים. כאן, אנו מתארים שיטות להערכת iav ב פתוגנזה, התגובות ההורמונאלית, יעילות החיסון באמצעות מודל של העכבר של זיהום.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1- / - מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ICR מוסמך (המכון לחקר הסרטן) מודל murine של זיהום מערכת העצבים המרכזית כדי להציג את ההתפתחות של נוירופתיה. ניטור ויראלי חריפה הפרעות נצאליטיות על ידי עשרות מחלה זהה יכול להתבצע על מראה דנגי וירוס המושרה נוירופתיה ב vivo.

מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ'יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

למד שיטות ציטומטריית זרימה לניתוח תגובות תאי T נגד וירוס הנילוס המערבי. השיטות מודדות יכולת הצגת אנטיגן של תאי דנדריטיים והפעלת תאי T ספציפיים במעבדה בטוחה.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

גלה סרטונים נוספים