רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של הליקובקטר פילורי CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

ההליך מדמיין את ייצור היתר של מערכת ההפרשה מסוג CAG מסוג 4, המתרחש בתנאים של הגבלת ברזל תרבית ראשונה h pylori בתנאים של הגבלת ברזל. השלב השני הוא תרבית משותפת של הליקובקטר פילורי עם תאי אפיתל בקיבה. לאחר מכן, עבדו את דגימות התרבות המשותפת לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

בסופו של דבר מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה כפי ששימש להצגת ייצור מוגבר של מערכת הפרשה מסוג CAG מסוג 4 בתנאים של הגבלת ברזל. הטכניקה בכתב יד זה חשובה למחלות הקשורות להליקובקטר פילורי כגון סרטן הקיבה מכיוון שמערכת ההפרשה מסוג CAG מסוג 4 קשורה לסיכון מוגבר לתוצאות מחלה שליליות. לפיכך, הבנה טובה יותר של ויסות משטח חיידקי חשוב זה.

אברונים יכולים לחשוף מטרות כימותרפיות חדשות והיתרון של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה לעומת שיטות קיימות כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא שניתן לדמיין גלולת הפרשה מסוג 4 I. לאנשים חדשים בשיטה זו של מיקרוסקופ אלקטרונים יש בעיות עם ההליך, במיוחד הכימיה הרטובה מכיוון שהיא דורשת תזמון זהיר ויד עדינה על הדם. צלחות אגר צומחות.

H Pylori PMs, חיידק S one, והמוטציה האיזוגנית שלו CAG e, שחסרה מערכת הפרשה מתפקדת מסוג 4. חסנו תרביות וציר אלה מעובד בתוספת כולסטרול כדי לגדול בן לילה. הזרע הבא תאי אפיתל קיבה אנושיים GS על כיסוי שטופל בפוליליזין מחליק ב-12 לוחות באר לתנאים משתנים של זמינות ברזל.

מדללים את ה-h pylori לצפיפות אופטית 600 של 0.3 במרק ברו שונה בלבד. מדיה המכילה 100 מיקרו טוחנות של ברזל כלוריד, 200 מיקרוטולר של מטבל כלטור ברזל סינטטי או 200 מיקרו טוחנות של תרבית ברזל כלוריד. הדגימות במשך ארבע שעות צנטריפוגות את החיידקים ב-1000 גרם ו-Resus משהה את הכדורים בנפח שווה של מרק ברו טרי שעבר שינוי בתוספת כולסטרול.

מדוד את צפיפות החיידקים. לאחר מכן, הדביקו את תאי האפיתל ב-H pylori בריבוי זיהומים של 20 ל-1. בצע דילולים סדרתיים וצלחת את תאי החיידקים על צלחות אגר הדם.

כדי להעריך את כדאיות תאי החיידקים, הנח את תרביות הקו בחממת תרבית התאים למשך ארבע שעות. שפכו את הסופרנטנט מתרבויות ה-h pylori I ו-GS co. שטפו בעדינות את התאים הדבקים שלוש פעמים עם מאגר נתרן מולארי של 0.05

לאחר מכן תקן את הדגימות למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם מאגר נתרן מולארי של 0.05. לקיבוע משני הוסף 0.1% אוסמיום טטרוקסיד במאגר נתרן מולארי של 0.05 בשני שלבי קיבוע רצופים של 10 דקות.

לאחר מכן, לאחר שלוש כביסות, יש לייבש את הדגימות בריכוזים מוגברים של אתנול. הנח את הדגימות במכונת מייבש נקודה קריטית, ולאחר מכן מלא את החדר בפחמן דו חמצני נוזלי. אתנול מטוהר מהתא והתא מתמלא שוב בפחמן דו חמצני נוזלי.

לאחר מכן הדגימה נלקחת לנקודה הקריטית של 31.1 מעלות צלזיוס ו-1073 PSI מרכיבים כעת את החלקות הכיסוי על דפי דגימת SEM מאלומיניום וצובעים קו דק של כסף קולואידי בקצה הדגימה להארקה. במהלך הדמיית SEM, באמצעות מכונת ציפוי מקרטע, מצפים את הדגימות בחמישה ננומטר של פלדיום זהב כדי להגדיל את אות האלקטרונים המשני של הדגימה ואת אפקט הקצה. בדוק את הדגימות עם תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אקדח פליטת שדה במצב ואקום גבוה במרחק עבודה של חמישה עד 10 מילימטרים.

הגדר את מתח ההאצה לחמישה קילו-וולט. לאחר מכן הגדר את גודל הנקודה ל-2.5 עד 2.5. כעת הטה את הדגימה בין 15 ל-25 מעלות כדי להשיג תצוגה טובה יותר של ממשק הפתוגן המארח לצפייה בהגדלה גבוהה.

תעדוף הדמיה של חיידקים נצמדים לקצוות תאי האפיתל עבור חיידקים מחממי חיים PI המועשרים באינטראקציות פתוגן מארח. פתח את קבצי המיקרוגרף בתוכנת תמונה J. זהה pi li כמבנים הנוצרים בין תא החיידק לתא המארח ברוחב אחיד של 10 עד 13 ננומטר ואורך של 60 עד 150 ננומטר.

כייל את כלי המדידה על ידי ציור קו עם כלי הקו הישר ולאחר מכן לחיצה על לשונית הניתוח מהתפריט הנפתח. בחר set scale והזן את ערך סרגל ההגדלה תחת מרחק ידוע והגדר את יחידת האורך לננומטר. לאחר מכן לחץ על אישור.

כעת השתמש בכלי קו ישר כדי לצייר לאורך או רוחב הטייסים ולאחר מכן לחץ על בקרה M כדי למדוד כל פיילוט ולרשום את הערכים הנמדדים בתוכנית גיליון אלקטרוני. השתמש בפרמטרים של אורך ורוחב שנקבעו בעבר כדי להתעלם מתכונות שאינן מתאימות לפרופיל של מערכת הפרשה מסוג CAG מסוג 4. לאחר מכן כמת את מספר ה-PI I על סמך ערכים שנמצאים בטווח ניתוח סטטיסטי של כימות ה-PI LI באמצעות מבחן T של תלמיד דו-זנבי.

בניסוי זה, הליקובקטר פילורי תורבת בתנאים מדוללי ברזל באמצעות טבילת כלאטור סינתטית בריכוזים שאינם מעכבים באופן משמעותי את הצמיחה. החיידקים ייצרו מספר רב של מערכות הפרשה מסוג CAG מסוג 4 PII כאשר תרבית משותפת עם תאי קיבה אנושיים. לעומת זאת, כאשר קיים מקור אקסוגני של ברזל מזין, היווצרות מערכת ההפרשה PII מסוג CAG מסוג 4 מדוכאת.

כימות ה-PII בממשק הפתוגן המארח מגלה כי בתנאים של הגבלת ברזל, הליקובקטר פילורי מציג עלייה כפולה במערכת ההפרשה של CAG מסוג 4 עין PI, אחוז התאים הערומים גדל ב-11% בהשוואה לתאים הגדלים במדיום בלבד. מעניין לציין שלמרות שפעילות מערכת ההפרשה מסוג CAG מסוג 4 כפי שנמדדה על ידי הפרשת IL 8 המארחת מוגברת בתנאים של הגבלת ברזל ומדוכאת בתנאים של זמינות עודפת של ברזל, ממדי PI LI נשארים עקביים בכל תנאי זמינות הברזל. בהתאם למעורבות של מערכת הפרשת CAG מסוג 4, זמינות הברזל אינה משנה את הביוגנזה של PI LI על פני השטח של מוטציה CAG e לאחר פיתוחו.

טכניקת SEM זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מערכת ההפרשה מסוג CAG מסוג 4 לחקור לוקליזציה של חלבונים. ביחס לכריות מערכת ההפרשה מסוג CAG מסוג ארבע. לאחרונה התגלה כי חלבון האפקטור CAG a מתמקם בקצה גלולת ההפרשה מסוג 4.