הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow הקאמרי
30 בדצמבר 2014
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר להעריך דינמיקת גיוס לויקוציטים לשעבר vivo על ידי חיבור קאמרי מצופים במולקולות דבקות-נגזר האנדותל למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים שכן הוא מאפשר להערכה לויקוציטים בתנאים ביולוגיים יחסי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מעגל סגור עורקי ex vivo כדי להעריך אינטראקציות לויקוציטים עם מולקולות הידבקות אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגיים. זה מושג תחילה על ידי ציפוי תא זכוכית דק במולקולת ההידבקות האנדותל המעניינת. בשלב השני, צינורות פוליאתילן וסיליקון מחוברים לתא ולאחר מכן בניתוח לעכבר.
לאחר מכן דם מעורק הצוואר כפי שמותר לזרום דרך הצינור. והאינטראקציות הבאות של הלויקוציטים המקומיים עם תא הזכוכית המצופה נרשמות בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן לחשב לאורך זמן את ההשפעות של טיפולים שונים על התזוזה ומהירות הגלגול של הלויקוציטים כאינטראקציה עם מולקולות ההדבקה המשותקות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקה קיימת כמו ניתוח פרו ציטומטריה, הוא שבטכניקה זו מוערכת אינטראקציה של לויקוציטים עם מולקולות אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגיים. יום לפני הניסוי חבר סנטימטר אחד של צינורות פוליאתילן PE 10 לחתיכת צינור סיליקון באורך שישה סנטימטרים, ואחריו חמישה סנטימטרים של צינורות פוליאתילן. כדי להכין את מערך הצינורות לצד הצוואר של החיה לצד הצוואר, חבר את הצינור כפי שהודגם זה עתה בתוספת TTU בתוך צינורות הסיליקון של שישה סנטימטרים, במרחק של כ-1.5 סנטימטרים מצינור הפוליאתילן של סנטימטר אחד.
לאחר מכן, חבר קצה אחד של חתיכת צינור סיליקון בגודל 10 סנטימטר למתמר הלחץ והכנס את קצה ה-T של צינור ה-T בצד הצוואר לקצה השני. ודא שאתרי החיבור הדוקים וללא דליפות. לאחר מכן השתמש במזרק של מיליליטר אחד המחובר למחט בגודל 25 כדי להחדיר לכל תא מיקרו-זרימה את חלבון ציפוי פני השטח האנדותל הטרי שהוכן המעניין, ואחסן את התאים המצופים בצינור של 15 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת.
כדי לחבר את צינור הצוואר והצוואר לתא המיקרו-זרימה, חבר צינור סיליקון סנטימטר אחד לכל צד של החדר, ולאחר מכן אטום את החיבורים עם חתיכת פרם מלבנית קטנה המתוחה עם הצינור פוגש את החדר. השתמש במזרק כדי למלא את החדר והצינור באלבומין סרום בקר 0.1%. ואז לאחר בדיקת דליפה, דגרו לתא למשך 45 דקות.
בטמפרטורת החדר לקראת סוף הדגירה, ייצב את תא המיקרו-זרימה על חריץ לצלחת פטרי עם טיפה קטנה של סיליקון בכל חריץ. לאחר מכן חבר את צינורות הצוואר והצוואר לכל צד של החדר. לאחר מכן, בזמן שהסיליקון מתייבש, חבר מזרק נעילה של 60 מיל מלא בהפרין למתמר הלחץ והעביר הפרין בדרגת 100 USP דרך הצינור והתא עד שאין בועות אוויר.
לפני חיבור העכבר לתא המיקרו-זרימה, הפעל את המחשב, את המיקרוסקופ ואת מכשיר הקלטת הלחץ המתאים. לאחר הגדרת התוכנה, אבטח עכבר בן 10 עד 12 שבועות. במצב הגחון, בצע חתך באזור הצוואר בעזרת מספריים ולאחר מכן נתח את בלוטת התריס כדי לחשוף את קנה הנשימה וכלי הדם.
נקה את עורק הצוואר עד לחשיפה מלאה. הקפדה לא לפגוע בעצב התועה. ואז העבירו את העיקול של חתיכת תפר מקופלת מתחת לעורק הצוואר וחתכו את התפר בעיקול.
אז יש שתי חתיכות תפר מתחת לעורק. לולאה כל תפר לקשרים מבלי להדק, ואז הניחו את התפרים לווריד הצוואר השמאלי באותו אופן. כאשר תפרי הצוואר נמצאים במקומם, הזרקו מיליליטר אחד של הפרין לתוך ה-ip של העכבר.
לאחר ההזרקה, הדק את התפר העליון על עורק הצוואר והנח מהדק כלי נמוך ככל האפשר על החלק החשוף של העורק. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את העורק בתפר העליון ולאחר מכן השתמש במספריים מיקרו עדינים כדי לבצע חתך קטן כשמינית מהיקף העורק קרוב לתפר העליון. כעת הכנס את צינור עורק הצוואר באמצעות מחזיק צינור דרך החתך שנעשה בעורק והעביר אותו למטה על ידי התפר התחתון.
ואז קושרים את התפר התחתון ואחריו את העליון. אז העורק אטום סביב הצינור, ויוצר מספר קשרים כדי להבטיח אטימה הדוקה. לאחר חזרה על אותו הליך עבור צינור הצוואר, מינוס מהדק הכלי, פתח זמנית את מהדק הכלי על צינור עורק הצוואר כדי לבדוק את הזרימה.
אם אין נזילות, העבר את העכבר למיקרוסקופ וחבר את צינור הצוואר ווריד הצוואר לצינור תא המיקרו-זרימה כדי לתעד את מהירות הגלגול של הלויקוציטים דרך תא המיקרו-זרימה. שחרר לחלוטין את מהדק הצוואר כדי למלא את החדר. אפשר לדם להסתובב במשך שלוש עד חמש דקות כך שתנאי הזרימה יתייצבו.
בינתיים, כוונן את שלב המיקרוסקופ כך שהתא יהיה ישר עם מטרת המיקרוסקופ וקצהו מקביל לחלון הקלטת הווידאו על המסך. לאחר מכן, בנה צלחת פטרי עם מים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הורד את יעד הטבילה במים פי 10 לתוך הצלחת כך שהתאים הזורמים דרך החדר יהיו גלויים, התאם את עוצמת האור לפי הצורך כדי לדמות לחץ זרימה פיזיולוגי בינוני, כוונן את המהדק על הצינור כך שהמתמר יקרא 30 מילימטרים קבועים של כספית. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל את ההקלטה הן של סחר הלויקוציטים והן של הלחץ עם חלוף הזמן הראשון קרוב לקצה הצוואר של החדר ונע נגד הזרימה לכיוון קצה הצוואר עד להשלמתו.
בסיום ההקלטה, סגור את השסתום באתר הכניסה כדי לעצור את זרימת הדם והחלף את התא בתא חדש המצופה במולקולת הידבקות אחרת אם תרצה. במהלך כל הקלטה, רק לויקוציטים מקיימים אינטראקציה ניכרים בתוך החדר. לדוגמה, בכל אחת מהתמונות הללו, ראשי החץ הלבנים מצביעים על לויקוציטים בודדים שנלכדו על ידי מולקולת ההדבקה המעניינת ואשר מתגלגלים לאורך התא בין התאים הזורמים החופשיים האחרים.
בתוך זרימת הדם, ניתן לראות חפץ משותף מחוץ לחדר עם הכדורים הכהים הגדולים בכל התמונות, מה שיכול לעזור לצופה להעריך את תנועת הלויקוציטים ביחס לנקודה קבועה. הגרף ממחיש תרשים סופי של הנתונים. הטיפול הניסיוני הראשון נצפה כמקטין את מהירות הגלגול הניכרת כהסטה שמאלה, והטיפול הניסיוני השני נצפה כמגביר את המהירות המופיעה כהסטה ימינה, הן בהשוואה למהירות גלגול הבקרה בשילוב עם הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו תיוג הלויקוציטים ו-vivo x Viva כדי לענות על שאלות אחרות כמו התרומה של התקדמות מחלת לויקוציטים מסוימים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת דינמיקת גיוס לוקוציטים ex vivo באמצעות תא זרימה מיקרוסקופית (microflow chamber) המחובר למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות של לוקוציטים עם מולקולות היצמדות אנדותליאליות בתנאי זרימה פיזיולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של כלי הדם
רקע
- גיוס לוקוציטים הוא חיוני לתגובות חיסוניות.
- הבנת האינטראקציות בין לוקוציטים לתאי אנדותל יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- ייתכן שטכניקות קיימות אינן משכחבות במדויק תנאים פיזיולוגיים.
- פרוטוקול זה נועד להתגבר על מגבלות אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכה בזמן אמת של דינמיקת לוקוציטים.
- הערכת ההשפעות של טיפולים על התנהגות לוקוציטים.
- העמקת ההבנה של אינטראקציות בין לוקוציטים בתנאי זרימה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציפוי תא זכוכית במולקולות הדבקה אנדותליאליות.
- חיבור התא למערכת ההסעה של העכבר.
- הזרקת דם והקלטה של אינטראקציות בין לוקוציטים.
- ניתוח מהירות הגלגול והמעתק של לוקוציטים.
תוצאות עיקריות
- הושגה ויזואליזציה בזמן אמת של אינטראקציות בין לוקוציטים.
- נמדדו מהירות הגלגול וההעתקה של הלוקוציטים.
- השיטה הדגימה יתרונות על פני טכניקות מסורתיות.
- תנאי זרימה פיזיולוגיים נשמרו בהצלחה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקה של לוקוציטים.
- ניתן להחילוו על טיפולים שונים המשפיעים על התנהגות לוקוציטים.
- הטכניקה משפרת את הבנתנו לגבי תגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חקר אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל תחת תנאי זרימה פיזיולוגיים הוא קריטי להפחתת סיכונים של מטרות למחלות דלקתיות ולאימות היפותזות מכניסטיות בשלבי הגילוי המוקדמים. בדיקה זו, המשתמשת בתא מיקרו-זרימה עם ביטורף עצמי (autoperfused) ex vivo, מאפשרת כימות בזמן אמת של מהירות הגלגול (rolling velocity) של לוקוציטים, ובכך מספקת ביטחון חיזוי באימות המטרה ותומכת בהחלטות go/no-go בתוכניות פרה-קליניות. על ידי שימור התפקוד הטבעי של הלוקוציטים ומניעת ארטיפקטים הנובעים ממניפולציות ex vivo, השיטה משפרת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד לאימות הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת הביטוי התפקודי של מולקולות היצמדות של לוקוציטים תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של מהירות הגלגול של לוקוציטים כמדד תפקודי לפעילות של מולקולות היצמדות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות כימות של מעורבות המטרה והשפעות מכניסטיות של תרכובות אימונומודולטוריות במערכת הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקות המשך על ידי ביסוס פרופילי אינטראקציה של לוקוציטים תחת זרימה מבוקרת.
- ערך תפעולי: מספק פלטים כמותיים סטנדרטיים הניתנים לשחזור (מהירות גלגול, הסטה), המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות לאורך קמפיינים שונים.
- סקלאביליות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לבדיקת מולקולות היצמדות מרובות או מועמדים טיפוליים בסביבה פיזיולוגית עקבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה באמצעות שימוש בלבנוציטים טבעיים מדם פריפרי של עכברים תחת הרדמה, ובכך משמר מצבים תאיים הדומים לאלו הקיימים in vivo.
- ערך תפעולי: מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מדידת פלטים פונקציונליים הניתנים לתרגום ישיר לנקודות סיום של מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית.
- מזעכר סיכונים: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון, על ידי זיהוי תרכובות המשנות אינטראקציות בין לבנוציטים לאנדותל תחת זרימה, עוד לפני ביצוע מחקרי in vivo יקרים.
שילוב של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המוליך (lead), ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטיים לפני ביצוע סריקה פנוטיפית או מחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות כימות דינמיקת היצמדות לוקוציטים תחת זרימה פיזיולוגית, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה באמצעות ציפוי תא תקין וייצוב הזרימה, מה שמבטיח מדידות הדירות של אינטראקציות לוקוציטים.
- אנליזה: מייצרת תוצאות כמותיות (מהירות גלגול, תזוזה) באמצעות אנליזת ImageJ, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של השפעות הטיפול בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי שימוש באוכלוסיות לוקוציטים טבעיות, ובכך שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית להשלכה על מודלים של דלקת in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כבסיס הניתן לשימוש חוזר לסריקה של מטרות או תרכובות מרובות, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של מודלים ומשפרת את יעילות זרימת העבודה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי מדידה של התנהגות תפקודית של לוקוציטים תחת מאמץ גזירה, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות המתרחשות בבדיקות סטטיות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות תנאי זרימה מבוקרים (30 mmHg) והדמיה בזמן אמת, ובכך ממזער שונות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת תובנות מכניסטיות מוקדמות, מה שמפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למחלות דלקתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים על ידי כימות השפעות המודולציה של המטרה, ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות נתונים בקווי פיתוח של תרופות אימונומודולטוריות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה, מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (Intravital microscopy) וויסות לחץ המודינמי לשמירה על מעגלים עורקיים-ורידיים יציבים ex vivo.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל מתמר לחץ, וסת זרימה של Harvard Apparatus ועדשה לטבילה במים לצורך ויזואליזציה של לוקוציטים.
- מחייב סטנדרדייזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ציפוי התא, הכנת צינוריות והליכי הפריניזציה להבטחת זרימה פיזיולוגית עקבית.
- כולל שיקולי התאמה בעת בדיקת מולקולות היצמדות אנדותליאליות שונות או תתי-סוגים של לוקוציטים, דבר המצריך תיקוף של יעילות הציפוי והסגוליות שלו.
- מגבלות מעשיות כוללות את המורכבות הטכנית של קניולציה כירורגית של כלי דם ואת הצורך במודלים של עכברים תחת הרדמה, דבר העשוי להגביל את תפוקת העבודה.
