הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מעגל סגור עורקי ex vivo כדי להעריך אינטראקציות לויקוציטים עם מולקולות הידבקות אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגיים. זה מושג תחילה על ידי ציפוי תא זכוכית דק במולקולת ההידבקות האנדותל המעניינת. בשלב השני, צינורות פוליאתילן וסיליקון מחוברים לתא ולאחר מכן בניתוח לעכבר.

לאחר מכן דם מעורק הצוואר כפי שמותר לזרום דרך הצינור. והאינטראקציות הבאות של הלויקוציטים המקומיים עם תא הזכוכית המצופה נרשמות בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן לחשב לאורך זמן את ההשפעות של טיפולים שונים על התזוזה ומהירות הגלגול של הלויקוציטים כאינטראקציה עם מולקולות ההדבקה המשותקות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקה קיימת כמו ניתוח פרו ציטומטריה, הוא שבטכניקה זו מוערכת אינטראקציה של לויקוציטים עם מולקולות אנדותל בתנאי זרימה פיזיולוגיים. יום לפני הניסוי חבר סנטימטר אחד של צינורות פוליאתילן PE 10 לחתיכת צינור סיליקון באורך שישה סנטימטרים, ואחריו חמישה סנטימטרים של צינורות פוליאתילן. כדי להכין את מערך הצינורות לצד הצוואר של החיה לצד הצוואר, חבר את הצינור כפי שהודגם זה עתה בתוספת TTU בתוך צינורות הסיליקון של שישה סנטימטרים, במרחק של כ-1.5 סנטימטרים מצינור הפוליאתילן של סנטימטר אחד.

לאחר מכן, חבר קצה אחד של חתיכת צינור סיליקון בגודל 10 סנטימטר למתמר הלחץ והכנס את קצה ה-T של צינור ה-T בצד הצוואר לקצה השני. ודא שאתרי החיבור הדוקים וללא דליפות. לאחר מכן השתמש במזרק של מיליליטר אחד המחובר למחט בגודל 25 כדי להחדיר לכל תא מיקרו-זרימה את חלבון ציפוי פני השטח האנדותל הטרי שהוכן המעניין, ואחסן את התאים המצופים בצינור של 15 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת.

כדי לחבר את צינור הצוואר והצוואר לתא המיקרו-זרימה, חבר צינור סיליקון סנטימטר אחד לכל צד של החדר, ולאחר מכן אטום את החיבורים עם חתיכת פרם מלבנית קטנה המתוחה עם הצינור פוגש את החדר. השתמש במזרק כדי למלא את החדר והצינור באלבומין סרום בקר 0.1%. ואז לאחר בדיקת דליפה, דגרו לתא למשך 45 דקות.

בטמפרטורת החדר לקראת סוף הדגירה, ייצב את תא המיקרו-זרימה על חריץ לצלחת פטרי עם טיפה קטנה של סיליקון בכל חריץ. לאחר מכן חבר את צינורות הצוואר והצוואר לכל צד של החדר. לאחר מכן, בזמן שהסיליקון מתייבש, חבר מזרק נעילה של 60 מיל מלא בהפרין למתמר הלחץ והעביר הפרין בדרגת 100 USP דרך הצינור והתא עד שאין בועות אוויר.

לפני חיבור העכבר לתא המיקרו-זרימה, הפעל את המחשב, את המיקרוסקופ ואת מכשיר הקלטת הלחץ המתאים. לאחר הגדרת התוכנה, אבטח עכבר בן 10 עד 12 שבועות. במצב הגחון, בצע חתך באזור הצוואר בעזרת מספריים ולאחר מכן נתח את בלוטת התריס כדי לחשוף את קנה הנשימה וכלי הדם.

נקה את עורק הצוואר עד לחשיפה מלאה. הקפדה לא לפגוע בעצב התועה. ואז העבירו את העיקול של חתיכת תפר מקופלת מתחת לעורק הצוואר וחתכו את התפר בעיקול.

אז יש שתי חתיכות תפר מתחת לעורק. לולאה כל תפר לקשרים מבלי להדק, ואז הניחו את התפרים לווריד הצוואר השמאלי באותו אופן. כאשר תפרי הצוואר נמצאים במקומם, הזרקו מיליליטר אחד של הפרין לתוך ה-ip של העכבר.

לאחר ההזרקה, הדק את התפר העליון על עורק הצוואר והנח מהדק כלי נמוך ככל האפשר על החלק החשוף של העורק. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את העורק בתפר העליון ולאחר מכן השתמש במספריים מיקרו עדינים כדי לבצע חתך קטן כשמינית מהיקף העורק קרוב לתפר העליון. כעת הכנס את צינור עורק הצוואר באמצעות מחזיק צינור דרך החתך שנעשה בעורק והעביר אותו למטה על ידי התפר התחתון.

ואז קושרים את התפר התחתון ואחריו את העליון. אז העורק אטום סביב הצינור, ויוצר מספר קשרים כדי להבטיח אטימה הדוקה. לאחר חזרה על אותו הליך עבור צינור הצוואר, מינוס מהדק הכלי, פתח זמנית את מהדק הכלי על צינור עורק הצוואר כדי לבדוק את הזרימה.

אם אין נזילות, העבר את העכבר למיקרוסקופ וחבר את צינור הצוואר ווריד הצוואר לצינור תא המיקרו-זרימה כדי לתעד את מהירות הגלגול של הלויקוציטים דרך תא המיקרו-זרימה. שחרר לחלוטין את מהדק הצוואר כדי למלא את החדר. אפשר לדם להסתובב במשך שלוש עד חמש דקות כך שתנאי הזרימה יתייצבו.

בינתיים, כוונן את שלב המיקרוסקופ כך שהתא יהיה ישר עם מטרת המיקרוסקופ וקצהו מקביל לחלון הקלטת הווידאו על המסך. לאחר מכן, בנה צלחת פטרי עם מים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הורד את יעד הטבילה במים פי 10 לתוך הצלחת כך שהתאים הזורמים דרך החדר יהיו גלויים, התאם את עוצמת האור לפי הצורך כדי לדמות לחץ זרימה פיזיולוגי בינוני, כוונן את המהדק על הצינור כך שהמתמר יקרא 30 מילימטרים קבועים של כספית. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל את ההקלטה הן של סחר הלויקוציטים והן של הלחץ עם חלוף הזמן הראשון קרוב לקצה הצוואר של החדר ונע נגד הזרימה לכיוון קצה הצוואר עד להשלמתו.

בסיום ההקלטה, סגור את השסתום באתר הכניסה כדי לעצור את זרימת הדם והחלף את התא בתא חדש המצופה במולקולת הידבקות אחרת אם תרצה. במהלך כל הקלטה, רק לויקוציטים מקיימים אינטראקציה ניכרים בתוך החדר. לדוגמה, בכל אחת מהתמונות הללו, ראשי החץ הלבנים מצביעים על לויקוציטים בודדים שנלכדו על ידי מולקולת ההדבקה המעניינת ואשר מתגלגלים לאורך התא בין התאים הזורמים החופשיים האחרים.

בתוך זרימת הדם, ניתן לראות חפץ משותף מחוץ לחדר עם הכדורים הכהים הגדולים בכל התמונות, מה שיכול לעזור לצופה להעריך את תנועת הלויקוציטים ביחס לנקודה קבועה. הגרף ממחיש תרשים סופי של הנתונים. הטיפול הניסיוני הראשון נצפה כמקטין את מהירות הגלגול הניכרת כהסטה שמאלה, והטיפול הניסיוני השני נצפה כמגביר את המהירות המופיעה כהסטה ימינה, הן בהשוואה למהירות גלגול הבקרה בשילוב עם הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו תיוג הלויקוציטים ו-vivo x Viva כדי לענות על שאלות אחרות כמו התרומה של התקדמות מחלת לויקוציטים מסוימים.