Name: זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: למדו לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר בזחלי Drosophila באמצעות Proximity Ligation Assay. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מכלולי חלבונים באזור הפוסט-סינפטי בנוירומוסקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתסיסנית מרכז Stock Bloomington למתן מניות זבוב. אנו מודים גם לבנק התפתחותית המחקרים Hybridoma וד&quot;ר לין קולי (אוניברסיטת ייל) למתן נוגדנים. תודה מיוחדת לAhHyun Yoo על עזרתה בכתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (קריגר), ויליאם ועדה איזבל פלדת הקרן (קריגר), והמכון הקנדי לחקר בריאות (הרדן).

1. גוף וול הכנה הערה: הכנת גוף זחל קירות instar השלישי (למחקר של NMJs שמעצבב את קיר שרירי גוף) בוצעה כפי שתואר בעבר ברנט ואח '10, או Ramachandran וBudnik 11,12, אבל עם כמה שינויים.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות מניות לטוס וצלבים על 25 מעלות צלזיוס במשך 5-6 ימים באמצעות נהלים סטנדרטיים 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זוחל זחלי instar שלישיים מבקבוקונים או בקבוקים באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הזחלים בצלחת פטרי קטנה המכילה פוספט הצפת מלוח (PBS) כדי להסיר כל חלקיקי מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחל יחיד על גבי דיסק sylgard ולטבול אותו בכמה טיפות של PBS קר כקרח. באמצעות PBS קר כקרח יעזור לי המם את הזחל שהופך אותו קל יותר לתמרן. לאורך לנתיחה, להבטיח כי ההכנה היא תמיד שקועה בPBS כדי למנוע את זה מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את laRvA עם צד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך ששני קטעים לקנה הנשימה נראים תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 2 א). שימוש במלקחיים כדי לתפוס סיכת minutien, להצמיד את הזחל בקצה האחורי ליד spiracles (איור 2). עם סיכה אחרת, לחדור מבעד לציפורן בקצה הקדמי ליד הפה הווים. בעדינות למתוח את הזחל מתוך אורך, אז להצמיד אותו (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים microdissection, לצבוט את הקצה האחורי ליד הסיכה כדי ליצור פתח קטן. החתך צריך להיות שטחי מספיק רק לעבור לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבת קצה הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך, לחתוך לאורך כל אורכו של קו האמצע הגב בין שני קטעים לקנה הנשימה (איור 2 ג). כוון את להבי מספריים מעט כלפי מעלה בעת החיתוך כדי למנוע נזק לשרירי קיר גוף הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אופקי קטן מעט קדמי לתפקידסיכת eriorly-הציבה (איור 2 ג). לעשות עוד חתך דומה מעט אחורי לפין anteriorly-הציב (איור 2 ג). החתכים צריכים רק לעבור לציפורן. הערה: שלושה חתכים מצעדים 1.1.7 ו1.1.8 בשילוב צריך להיות דומה " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> "כשסיים, כלומר, שמאל ויד ימין דש בצד הגב של גוף הזחל צריך להיות מיוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את זהירות את האיברים הפנימיים עם המלקחיים. הוספה כמה טיפות בכוח של PBS תעזור לתפוס את האיברים מחוץ לגוף הזחל, וכך קל יותר כדי להסיר אותם. הימנע תוקע גוף הזחל כפי שיגרום נזק לקיר שרירי גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוש גוף הזחל פתוח ולהצמיד את הפינות כלפי מטה (איור 2 ד). כאשר מצמיד, למתוח את קיר הגוף אופקי ואנכי כדי ליצור מלבן באופן שווה-מתוח (seדואר איור 2G לצורה), מטפל שלא לקרוע את קיר שרירי גוף בתהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים הסרת כל איברים שנותרו פנימיים (איור 2E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבעון וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את גוף הקירות תלו בכמה טיפות של התמיסה של Bouin. דגירה במשך 15 דקות על קרח. לחלופין, להשתמש paraformaldehyde 4% (PFA) כמקבע חלופי; דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם פוספט הצפת מלוח עם טריטון (PBT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר בזהירות את הסיכות ולהעביר את גוף הקירות בפינות שלהם לתוך צינור microcentrifuge siliconized 0.65 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את גוף הקירות בPBT ב 4 ° C עד מוכן לPLA. לקבלת תוצאות אופטימליות, להתחיל immunostaining גוף הקירות בתוך יום או ימים של נתיחה. הערה: כדי לחסוך בחומרים כימיים ועל מנת להבטיח כי הם התייחסו לכל הגוף באופן שווה במהלך קירות assay, ניתן להציב גנוטיפים שונים ליחידצינור. ניתן להבחין גנוטיפים על ידי חיתוך הפינות של קירות הגוף שונה (ראה תרשים 2F לדוגמאות). </li></ol></li></ol> 2. אימונוהיסטוכימיה הערה: Immunostaining של גוף זחל קירות instar השלישי בוצע כפי שתואר בעבר ברנט ואח '14 וRamachandran ו -11 Budnik, אבל עם כמה שינויים 11,14.. הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום עם 1% אלבומין סרום שור (BSA) במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גוף הקירות עם נוגדני עכבר ועיקריים ארנב נגד שני החלבונים של עניין (בדילול מלא 1% BSA) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. במקרה זה, להשתמש בעכבר 01:10 אנטי-DLG ו -1: 250 ארנבNTI-HtsM 15,16. נוגדנים כנגד סמנים שאינם נעשו בעכבר או ארנבת יכולים להיכלל גם - למשל, להשתמש 1: 200 עיזים אנטי-Hrp להתוות ממברנות עצביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות כדי לזהות הסמנים (בדילול מלא BSA 1%) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. כאות PLA מאוחר יותר דמיין עם fluorophore אדום, fluorophore אחר יש להשתמש כדי לזהות את הסמן - למשל, להשתמש 1: 200 אנטי-עז FITC- מצומדות כדי לזהות את הנוגדן אנטי Hrp העז. בשל השימוש בחומרים כימיים רגיש לאור, לשמור על הצינורות בחושך מנקודה זו ואילך. הערה: הערכה המשמשת מאפשרת לPLA להתבצע בין נוגדנים העיקריים שהועלו בעכבר וארנב, עם האות דמיין בערוץ האדום תחת מיקרוסקופ confocal. אם תרצה, ערכות אחרות זמינות המאפשרות assay להיעשות עם פרימהנוגדני ר"י גדלו במינים אחרים, ואת האות דמיין בערוצים אחרים. </li></ol></li></ol> 3. סמיכות קשירת Assay הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות PLA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם בדיקות PLA (1: 5 דילול כל אחד בBSA 1%) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 40 μl של מינוס אנטי עכבר הבדיקה PLA, 40 μl של PLUS נגד ארנב הבדיקה PLA ו -120 μl של BSA 1% על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. עד דילול 01:25 של בדיקות PLA עדיין יכול לגרום ליחס הולם אות לרעש (כלומר, עבור ניסוי זה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון קשירת (01:40 דילול של אנזים במאגר קשירת) לשעה 1C ° 37 t. במקרה זה, להשתמש 5 μl של אנזים, 40 μl של חיץ 5 קשירת וμl 155 של מים טוהר גבוהים כדי להבטיח טבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים עבור 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון ההגברה (1:80 דילול של פולימראז במאגר הגברה) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 2.5 μl של פולימראז, 40 μl של 5 חיץ הגברה ו157.5 μl מים טוהר גבוהים על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף B פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 0.01x הצפת לשטוף B פעם 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בכמה טיפות של תמיסת הרכבה לפחות 30 דקות לפני ההרכבה, או לאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים עדינים, להעביר בזהירות את קירות גוף לשקופית פלטפורמת wה- i הציפורניים שלהם פונות כלפי מטה. מקם את גוף הקירות בשורות ובאותו הכיוון בתוך טיפה או שתיים של mountant. מניחים coverslip x 40 מ"מ 22 מ"מ מעל מטפל הכנה לא ליצור בועות אוויר, ואז לאטום את השקופית עם לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות בחושך ב -20 ° C עד מוכן להדמית confocal. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li>
<li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Lgl%2FDlg%2FScribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction%2C+polarity+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li>
<li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li>
<li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li>
<li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adducin%3A+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li>
<li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hts%2FAdducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li>
<li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+p21-Activated+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li>
<li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity%3A+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li>
<li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+structural+and+functional+synapse+development%3A+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li>
<li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+forest+tree+by+tree%3A+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulated+Drosophila+adducin+is+a+determinant+of+synaptic+plasticity+in+a+complex+with+Dlg+and+PIP2+at+the+larval+neuromuscular+junction%0A++%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction
 .</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

דו&quot;ח זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ. Assay מבוצע על הכנות שריר קיר גוף זחל לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני נוכחים בNMJ. בעזרת טכניקה זו, DLG וHTS מוצגים להיות בסמיכות זה לזה, ובכך קיימים במתחם, במיוחד באזור postsynaptic 27. בתמיכה של תוצאה זו, מחקר קודם סיפק עדות לקשר שלהם עם הנתונים הבאים: 1) הפצות immunoreactive של DLG וHTS חפיפה באזור postsynaptic של NMJs זחל, 2) DLG וHTS צורה מורכבת המבוססים על שיתוף ניסויי immunoprecipitati...

תסיסנית דיסקים גדולים (DLG) הוא חבר של המשפחה שמורה kinase guanylate קרום הקשורים פיגומי חלבונים המסייעים לתזמר את ההרכבה של קומפלקסי חלבונים גדולים באתרים ספציפיים של קרום הפלזמה. זוהה במקור כחלבון מדכא סרטן, DLG משמש כגורם חשוב 1,2,3 קוטביות apicobasal אפיתל. DLG משמש גם כמודול פיגומים גדול בצומת העצבית-שהרירית (NMJ) של הנוירונים מוטוריים glutamatergic במהלך התפתחות זחל 4. DLG משחק תפקידים מגוונים בNMJ הזחל, וpleiotropism מסתמך על יכולתו לקשר עם חלבונים מרובים 5,6. חלבון אחד כזה הוא שאו הו-לי טאי (HTS), homologue לadducins היונקים שתוארו בעיקר בכל הקשור לתפקידם בויסות תקטין spectrin שלד תא 7. זה בעבר הוכח כי DLG וHTS יכולים ליצור קומפלקס אחד עם השני על בסיס במבחנה </em&gt; שיתוף immunoprecipitation ניסויים מעורבים lysates לטוס כל המבוגר 8. חסרון אחד של תוצאות אלה, עם זאת, הוא שהם לא מציינים היכן צורות מורכבות זו. עם השימוש באימונוהיסטוכימיה, ההפצות של DLG וHTS הם נצפו לחפיפה בקרום postsynaptic של NMJs זחל, אבל הם במתחם באזור זה 8? כפי שניתן לראות לאחרונה ומפורט יותר כאן, הקירבה קשירת Assay (PLA) משמש כדי לחפש בשיתוף אתרו בין DLG וHTS במיוחד בNMJ זחל 27. PLA הוא טכניקה חדשה יחסית המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר 9. ב assay זה, נוגדנים עיקריים נגד שני החלבונים של עניין מזוהים עם זוג של נוגדנים משני מינים ספציפיים, המכונה בדיקות PLA, אשר מצומדת לoligonucleotides (איור 1 א &#39;, ב&#39;). אם שני החלבוניםים נמצא בסמיכות זה לזה (כלומר בתוך כמה עשרות ננומטרים), ניתן לגשר על המרחק בין בדיקות PLA המצורפות באמצעות הכלאה של שני oligonucleotides נוסף מחבר (איור 1 ג). בקונפורמציה זו, מסתיימת ללא oligonucleotides המחבר קרוב מספיק כדי ליצור קשר אחד עם השני, ומולקולת DNA מעגלית סגורה יכולה להיווצר עליו בקשירה באתרו (1D איור). מולקולת ה- DNA המעגלית משמשת כתבנית באתר הגברה המעגל מתגלגל, אשר ערוכה על ידי אחד מoligonucleotides המוצמד לבדיקות PLA (איור 1E). רצפים בתוך מוגבר מוצר ה- DNA וכתוצאה מכך, concatemeric אז יכולים להיות דמיינו עם, בדיקות שכותרתו fluorescently משלימות oligonucleotide (איור 1F). מאז DNA המוגבר נשאר מחובר לאחד מבדיקות PLA, לוקליזציה subcellular של withi האינטראקציה בין חלבוניםרקמת na אפשר ללמוד בקלות. כמה שיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון כוללים בטכניקות חוץ גופית כגון שיתוף immunoprecipitation, הנפתח מבחני והקרנת שתי היברידית שמרים, ובטכניקות vivo כגון העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) וbimolecular פלואורסצנטי שלמה ( BiFC). מלכודת של הטכניקות במבחנה היא שהם אינם מזדהים בו האינטראקציה מתרחשת באופן אנדוגני, בעוד vivo טכניקות האמורות בלערב את הביטוי המלאכותי של חלבוני היתוך שעלול שלא לשקף התנהגות יליד עמיתי אנדוגני. אחד יתרונות עיקריים של PLA הוא שהוא מסוגל לקבוע בתוך רקמת לוקליזציה subcellular של interactors חלבון אנדוגני שנמצאים בסמיכות זה לזה, וסביר להניח להרכיב מורכב, עם מידת הקרבה הדרושה כדי ליצור אות להיות דומה לFRET וBiFC. PLA יכול לזהות אינטראקציות עם סגוליות גבוהות ורגישות בשל הצימוד של הכרת נוגדן והגברת DNA. לפיכך, assay יכול ליצור אותות בדידים, בהירים בצורה של puncta החושפות את עמדתה של האינטראקציה המדויקת. בנוסף, ניתן לאתר אנטיגנים בקושי נראים לעין. לבסוף, PLA הוא טכניקה פשוטה יחסית לביצוע, וזה לוקח לא יותר מהליך immunohistochemical סטנדרטי כדי להשלים. לכן, PLA מספק יתרון טכני על מבחני אינטראקציה אחרים חלבון-חלבון שלעתים קרובות נגועים בזמני הכנה ארוכים ופתרון בעיות נרחבות. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני באתר. כאן, PLA מבוצע על הכנות שריר זחל קיר גוף שבו DLG וHTS מוצגים לאכן מתקיימים במתחם באזור postsynaptic של NMJs. PLA לא היה בשימוש בעבר כדי ללמוד את NMJ הזחל, ויש כיום רק קומץ של מאמרים שפורסמו שהשתמשו assay זה ברקמת דרוזופילה. יש לקוות כי חשיפה נוספת של PLA לקהילת תסיסנית תגרום שימוש ככלי נוסף הגדיל אותו כדי להשלים את מבחני אחרים, נפוצים יותר חלבונים אינטראקציה.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים (בסדר #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>מערבבים בסיס אלסטומר וחומר ריפוי ביחס של 10:1. מוגדר למשך 30 דקות. יוצקים לתבנית (למשל השתמשו בצלחת תרבית תאים עם 12 בארות). יש להניח לריפוי למשך 24 שעות לפחות. היצמדו למכסה של מכסה צלחת פטרי בגודל 60X15 מ"מ בעת הניתוח.</td></tr><tr><td>סיכות זעירות (0.0125&nbsp; קוטר קצה מ"מ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-דיסקציה (עדינים במיוחד)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td><td></td><td></td> פלטפורמה <td>הדבק שני כיסויים בגודל 22 x 22 מ"מ2 מחליק על שקופית מיקרוסקופ עם לק שקוף, ומשאיר < מרווח של 20 מ"מ ביניהם להרכבת מדגם.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>המלאי אוזן מחדש על גבי מאזן GFP כך שניתן יהיה לבחור מוטציות הומוזיגוטיות על סמך היעדר אות GFP.</td></tr><tr><td>1x PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7.0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA ב-1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (מדע אנכימיה - 66194-300). ראה doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 להוראות כיצד להכין את התמיסה.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (תמיסת מלח פוספט עם טריטון): 1x PBS עם 0.01% טריטון</td><td></td><td></td><td>טריטון X-100 (סיגמא-אולדריץ' - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (אלבומין בסרום בקר): 1% BSA ב-1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-Dlg (דיסקים גדולים)</td> <td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>4F3</td><td>השתמש בדילול של 1:10 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>ארנב נגד HtsM (הו-לי טאי שאו)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר לין קולי (אוניברסיטת ייל). יש להשתמש בדילול של 1:250 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-פאק (קינאז המופעל על ידי p21)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר ניקולס הארדן (אוניברסיטת סיימון פרייזר). יש להשתמש בדילול של 1:500 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>עכבר נגד WG (ללא כנפיים)</td> <td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>השתמש בדילול של 1:5 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>עז נגד HRP (חזרת פרוקסידאז)</td><td>ג'קסון&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>חמור מצומד FITC נגד עזים</td><td>ג'קסון&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>Duolink באתרו PLA בדיקה נגד עכבר MINUS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink באתרו PLA בדיקה נגד ארנב פלוס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink באתרו זיהוי ריאגנטים אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x מאגר כביסה A: 0.01&nbsp; מ טריס, 0.15&nbsp; M NaCl, 0.05% טווין 20, pH 7.4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82049</td><td>טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1), טווין 20 (פישר סיינטיפיק - BP337)</td></tr><tr><td>מאגר כביסה 1x B: 0.2&nbsp; מ טריס, 0.1&nbsp; M NaCl, pH 7.5</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82049</td><td>טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x מאגר כביסה B: 2&nbsp; מ"מ טריס, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr> <tr><td>מדיום הרכבה Duolink באתרו עם DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) הוא חבר משומר במשפחת גואנילט קינאז הקשור לממברנה, ומשמש כחלבון פיגומים עיקרי בצומת העצבי-שרירי של הזחל (NMJ) בדרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי ההתפלגות הפוסט-סינפטית של Dlg ב-NMJ הזחל חופפת לזו של Hu-li tai shao (Hts), הומולוג לאדוקינים של היונקים. בנוסף, Dlg ו-Hts נצפים כיוצרים קומפלקס זה עם זה בהתבסס על ניסויי קו-אימונו-משקעים הכוללים ליזטים של זבובים בוגרים שלמים. עם זאת, בשל אופי הניסויים הללו, לא היה ידוע אם קומפלקס זה קיים ספציפית ב-NMJ במהלך התפתחות הזחל.
בדיקת קשירת קרבה (PLA) היא טכניקה שפותחה לאחרונה המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולה לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן. בבדיקה זו, דגימות מודגרות עם נוגדנים ראשוניים כנגד שני החלבונים המעניינים באמצעות פרוצדורות אימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות. הנוגדנים הראשוניים מתגלים לאחר מכן עם זוג נוגדנים משניים מצומדים לאוליגונוקלאוטידים שתוכננו במיוחד, הנקראים בדיקות PLA, שניתן להשתמש בהם כדי ליצור אות רק כאשר שתי הגשושיות נקשרו בסמיכות זו לזו. לפיכך, ניתן לדמיין חלבונים שנמצאים במתחם. כאן, מודגם כיצד ניתן להשתמש ב-PLA כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן ב-NMJ של זחל דרוזופילה. הטכניקה מבוצעת על הכנת שרירי דופן גוף הזחל כדי להראות כי קומפלקס בין Dlg ל-Hts אכן קיים באזור הפוסט-סינפטי של NMJs.

בNMJs זחל instar השלישי wild-type, DLG נמצא ברובה בקרום postsynaptic של boutons glutamatergic אני סוג, עם רמות immunoreactivity DLG להיות בולטות יותר בboutons Ib סוג מהסוג האם boutons (איור 3 א) 4. HTS נוכח לאורך כל השרירים, אבל מתרכז באזור postsynaptic עם רמות immunoreactivity HTS מופיעות זהות בשני סוגים אני boutons, והוא נמצא גם Presynaptically (איור 3 א ') 8,17. שים לב שההפצות של DLG וHTS החופפים במידה רבה באזור postsynapt...

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות את הלוקליזציה התת-תאית של אינטראקציות חלבון אנדוגניות בזחל הדרוזופילה NMJ. זה מושג על ידי ביצוע אימונופלואורסצנציה באמצעות זוג נוגדנים משניים מצומדים אוליגונוקלאוטידים הנקראים בדיקות PLA, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים כנגד שני החלבונים המעניינים. לאחר מכן, הפער בין בדיקות ה- PLA מגושר באמצעות הכלאה של שני האוליגונוקלאוטידים המחברים.רק כאשר שני החלבונים נמצאים בסמיכות זה לזה ונוצרת מולקולת DNA מעגלית סגורה על קשירה באתרה, אז מתבצעת הגברת מעגל מתגלגל באתרה על מנת להגביר רצפים בתוך מולקולת ה- DNA המעגלית הסגורה, אשר מתגלים לאחר מכן עם אוליגונוקלאוטידים משלימים המתויגים פלואורסצנטית. האות הפלואורסצנטי המתקבל שנוצר מכל תוצר הגברה נראה אפוא בקלות כנקודת אור מובהקת כאשר צופים בו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות כגון E שני משקעים היברידיים ואיום, הוא ש- PLA מסוגל לזהות בתוך הרקמה את הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים אנדוגניים הממוקמים בסמיכות זה לזה וככל הנראה יוצרים קומפלקס.למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי רשתות האינטראקציה בין חלבון לחלבון המתרחשות במיוחד ב-de larva ו-mj. ניתן ליישם אותו גם על מערכות ג'ולו אחרות. הצע את רקמות האפיתל בעוברים ובדיסקים דמיוניים.מדגימים את ההליך הל יו והא קינג, שני טכנאים מהמעבדה שלנו. לאחר דגירה של תרביות דרוזופילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שישה ימים, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לקטוף זחלי כוכב שלישי זוחלים מהבקבוקונים או בקבוקים כדי לשטוף את הזחלים. מעבירים אותם לצלחת פטרי קטנה המכילה PBS.לאחר מכן הכניסו את אחד הזחלים השטופים לדיסק סיגר S וטבלו אותו בכמה טיפות PBS קר כקרח כדי לעכב אותו, ובכך להקל על המניפולציה. מקם את הזחלים כשהצד הגבי שלהם פונה כלפי מעלה כך ששני מסלולי קנה הנשימה נראים תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לתפוס סיכת מנוצ'ין, הצמד את הזחלים כלפי מטה בקצה האחורי ליד הספירלות עם סיכה נוספת חודר דרך הציפורן בקצה הקדמי ליד ווי הפה ומותח בעדינות את הזחלים לאורכו לפני הצמדתו כלפי מטה.לאחר מכן, באמצעות דיסקציה מיקרו, מספריים צובטים את הקצה האחורי ליד הסיכה כדי ליצור פתח קטן, החתך צריך להיות שטחי מספיק כדי פשוט לעבור דרך הציפורן. לאחר מכן הנחת קצה הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך, ותוך כדי הפניית להבי המספריים מעט כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה בשרירים הבסיסיים, חתוך לכל אורך קו האמצע הגבי בין שתי דרכי קנה הנשימה. כעת בצע חתך אופקי קטן ממש דרך הציפורן, מעט קדמי לסיכה הממוקמת מאחור.לאחר מכן בצע חתך דומה נוסף מעט אחורי לסיכה הממוקמת קדמית. לאחר הוספת כמה טיפות חזקות של PBS לגוף הזחל, השתמש במלקחיים כדי לנקות בזהירות את האיברים הפנימיים. הימנע מלתקוע את גוף הזחל מכיוון שהדבר יגרום נזק לגוף.שרירי הקיר פורשים את גוף הזחל פתוח וכדי להצמיד את הפינות כלפי מטה, מותחים את דופן הגוף הן אופקית והן אנכית ליצירת מלבן מתוח באופן שווה. הקפדה לא לקרוע את שרירי דופן הגוף בתהליך לקיבוע הרקמה. טבלו את דפנות הגוף המוצמדות בכמה טיפות של תמיסת בואן ודגרו על קרח למשך 15 דקות לאחר הקיבוע.השתמש ב-PBT כדי לשטוף את הטישו שלוש פעמים. לאחר מכן לחסוך בריאגנטים ולהבטיח שכל דפנות הגוף מטופלות באופן שווה במהלך הבדיקה. חותכים את הפינות של כל גנוטיפ בצורה שונה כדי להבחין ביניהן.ולאחר הסרת הסיכות בעזרת מלקחיים עדינים, הניחו את כולם באותו צינור מיקרו צנטריפוגה סיליקון בנפח 0.65 מיליליטר. כדי לחלחל לרקמה, השתמש ב-PBT כדי לשטוף את דפנות הגוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת. לאחר הסרת הכביסה הסופית, יש להוסיף 1% BSA כדי לחסום את הדגימות ולדגור למשך שעה.לצד כתם חיסוני, דפנות הגוף מוסיפות נוגדנים ראשוניים של עכבר וארנב כנגד שני החלבונים המעניינים ודוגרות במשך שעתיים. במקרה זה, נעשה שימוש באחד עד 10 עכברים נגד DLG ואחד עד 250 ארנב נגד HTS ב-1% BSA. ניתן להוסיף נוגדנים נגד סמנים גם לאחר הדגירה.השתמש ב-PBT כדי לשטוף את דפנות הגוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן הוסיפו פלואורו ארבעה נוגדנים משניים מסומנים כנגד כל סמן ב-1% BSA, ודגרו בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת בבוקר. השתמש ב-PBT כדי לשטוף את דפנות הגוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.כדי להתחיל את הבדיקה בדילול של 1 עד 5 לפחות 200 מיקרוליטר. הנפח הכולל של בדיקת PLA, אנטי עכבר מינוס ובדיקת PLA נגד ארנב פלוס ב-1% BSA לדפנות הגוף דוגרים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שימוש במאגר כביסה A כדי לשטוף את דפנות הגוף פעמיים למשך חמש דקות כל אחת בדילול של 1 עד 40 של ליגאז בתמיסת ליגאז, דגירה במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. השתמש במאגר כביסה A כדי לשטוף את דפנות הגוף פעמיים במשך שתי דקות כל אחת לפני הוספת דילול של 1 עד 80 של פולימראז בתמיסת הגברה.דגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להכנת הדגימות להדמיה. השתמשו במאגר כביסה B כדי לשטוף את דפנות הגוף פעמיים למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן השתמש בדילול של פי 100 של מאגר הכביסה B כדי לבצע כביסה אחרונה למשך דקה אחת.אזנו את דפנות הגוף בכמה טיפות של תמיסת הרכבה למשך 30 דקות לפחות באמצעות מלקחיים עדינים. העבירו בזהירות את דפנות הגוף למגלשת פלטפורמה עם מרווח הציפורן כלפי מטה. מקם אותם בשורות באותו כיוון בתוך טיפה או שתיים מתמיסת ההרכבה.הניחו החלקת כיסוי בגודל 22 מילימטר על 40 מילימטר מעל התכשיר, והקפידו לא ליצור בועות אוויר. לאחר מכן השתמש בלק שקוף כדי לאטום את השקופית. אחסן את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להדמיה קונפוקלית.כפי שמוצג כאן ב-njs זחלים מסוג בר, DLG נמצא בעיקר בממברנה הפוסט-סינפטית של בוטון גלוטמטרגי מסוג 1 כאשר הרמות בולטות יותר בסוג 1 B מאשר סוג 1 S bs HTS נמצא בכל השריר, אך מתרכז בקרום הפוסט-סינפטי כאשר הרמות שוות בשני הסוג הראשון Bhuton, DLG ו-HTS חופפים במידה רבה באזור הפוסט-סינפטי כדי לקבוע אם DLG ו-HTS קיימים בקומפלקס. ב-N-M-J-P-L-A בוצע עם נוגדנים נגד DLG ואנטי HTS כפי שניתן לראות כאן. אות PLA בין שני החלבונים נצפה במיוחד בסוג הבר NMJ, האות מתמקם בעיקר באופן היקפי לממברנה הפרה-סינפטית המסומנת על ידי HRP.לפיכך, DLG ו-HTS נמצאים בסמיכות וככל הנראה יוצרים קומפלקס באזור הפוסט-סינפטי. התוצאה ספציפית כבקרה שלילית הכוללת מוטציות HTS שחסרות. תגובתיות חיסונית של HTS לא מראה תצוגות הגדלה גבוהה של אות PLA של ה-bns מראות כי DLG ו-HTS Immunoreactivity חופפים באופן גס בממברנה הפוסט-סינפטית.לעומת זאת, PLA בין שני החלבונים מביא ל-PUNCTA בדיד המצביע על כך שרק תת-קבוצה של סך חלבוני ה-DLG וה-HTS נמצאים במורכבות לאחר שליטה. טכניקה זו אינה אורכת יותר מהליך אימונוהיסטוכימי סטנדרטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד משתמשים ב- PLA כדי לזהות את הלוקליזציה התת-תאית של אינטראקציה חלבונית אנדוגנית המתרחשת בזחל NMJ.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

למדו לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר בזחלי Drosophila באמצעות Proximity Ligation Assay. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מכלולי חלבונים באזור הפוסט-סינפטי בנוירומוסקולרי.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

גלה סרטונים נוספים