Name: ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למדו לכמת שינויים במורפולוגיה ובלוקליזציה של חלבונים בתאי T לאחר גירוי כימוקין באמצעות ציטומטריית זרימה עם דימות. שיטה זו מאפשרת ניתוח סטטיסטי מהיר וחזק של אוכלוסיות תאים גדולות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מאוד פייר Bourdoncle, תומאס גילבר ולואיז Rimbault של מתקן קוצ&#39;ין ההדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, CNRS וליגת העל לאומי contre le הסרטן (labellisée Equipe).

1. הכנת T לימפוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עכבר ראשוני או תאי T אנושיים כפי שתואר 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח תאי T אנושיים במדיום RPMI להשלים עם 10% בסרום אנושי AB בצפיפות של 2 - 3 x 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: השימוש בסרום עוברי עגל (FCS) במקום סרום אנושי יכול לעורר קיטוב ספונטני של חלק גדול של תאי T אנושיים בתרבות. שמור את התאים הללו בתרבות ל4-5 ימים ועוד תהליך אותם בכל עת במהלך תקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי T העכבר במדיום RPMI מלא בתוספת 10% FCS בצפיפות תאים דומה. להשתמש מייד או ביום שלמחרת, לאחר O / תרבות N על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 10 ng / ml IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את קו התא האנושי CEM T בRPMI המלא בתוספת 10% FCS. </li></ol> 2. chemokine גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 x 10 5 תאים לכל תנאי ניסוי במדיום HBSS חם בתוספת 10 מ&quot;מ Hepes. עבור חלק מניסויים, שיתוף transfect התאים T אנושי ראשוני היום קודם לכן עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP ו8 מיקרוגרם pcDNA3.1 + (וקטור ריק, שליטה), kinase PKCζ המת, או פלסמידים Par6 N-terminal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום HBSS-Hepes חם (0.3 להשתמש מספר x מיליליטר של תנאי ניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את התאים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. הערה: לכן, צינור אחד המתאים לתנאי ניסוי יחידים יכיל 5 x 10 5 תאים ב0.3 מיליליטר בינוני HBSS-Hepes. עבור חלק מניסויים, להוסיף 500 ננומטר Latrunculin או רכב (DMSO) ודגירת התאים למשך 30 דקות לפני גירוי chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 עד 500 ng / ml CCL19 או chemokine CXCL12 בצינור אחד. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 10-200 מיליליטר chemokine / ng לתאי T אנושיים. תאי CEM אינם מבטאים את הקולטן CCR7 שנקשר CCL19. לכן, תאי CEM רק להיות מסוגלים להגיב לגירוי CXCL12. יתר על כן, שימוש בריכוזים גבוהים יותר chemokine (300-500 ng / ml) לקטב תאי T העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כמה פעמים דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 8 או 10 דקות לתאי T ראשוניים או CEM, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תהליך הקיטוב על ידי הוספה על צינור אחד 0.3 מיליליטר של פתרון חם המכיל paraformaldehyde 2% (PFA) ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. הפוך את צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים מצינורות microcentrifuge לזרום cytometry צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון RT המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב 460 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend התאים של פתרון RT המכיל 5% FCS בPBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של FITC-אנטי-HLA-ABC בצינור אחד, מערבולתם, דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT, הרחק מאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם עם PBS המכיל 5% FCS,פעם אחת עם PBS רק ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב RT: להוסיף 500 μl 1% PFA, דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף תאים עם תמיסה המכילה 1% BSA, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ HEPES בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, למלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון של PBS המכיל BSA 0.2%, saponin 0.1%, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes (חיץ permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים פעמיים במדיום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כדי להסיר בינוני ומערבולתם לנתק את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר TRITC-Phalloidin ו / או 1: של נוגדן אנטי-P-100 ERM דילול על צינור אחד, מערבולתם דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization. דגירה עם נוגדנים משני ניאון במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 200 μl PBS ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. הערה: תאים מוכנים לרכישה. לחלופין, תוך שמירה על נפח כולל מרבי של 200 μl לכל צינור, להוסיף PFA המרוכז ל% 1 סופייםריכוז על מנת לשמר את stainings אם לא כדי לשמש התאים באותו היום לעיבוד נוסף. </li></ol> 4. תמונות רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) ולתת לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן. הערה: תוכנת INSPIRE שימשה עם מטרת 40X (0.75 NA). תוכנת 3.0 הרעיונות שימשה לכל quantifications דיווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של חלונות רכישתו ניתן לשמור בתבנית לניסויים עתידיים. לצייר היסטוגרמות שלכמת את ערכי שיפוע RMS. מאוכלוסיית &quot;בפוקוס&quot;, שנבחרה על RMS היסטוגרמה שיפוע, delimitate האוכלוסייה &quot;תא יחיד&quot; על היסטוגרמה של האזור. ברגע שצינור microcentrifuge הוכנס במכונה, להתאים את כוח הלייזר, שער על תאים בודדים ולרכוש 5,000 T לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברעיונות רכיםכלי, לפתוח את קובץ הרכישה וליצור היסטוגרמה שתציג את הערך של ערך RMS שיפוע לתמונות בשדה בהיר (ערוץ 1) התקבלה לכל תא בודד. צייר שער על ההיסטוגרמה שיפוע RMS שרואה תאים מציגים RMS ערך שיפוע מעל 57. הערה: צבע RMS מאפשר לקחת בחשבון בניתוח רק לימפוציטים מסוג T הנמצאים במישור המוקד. יש לנו לקבוע באופן אמפירי שתאים בודדים המציגים ערך שיפוע RMS עדיף על 57 הם במישור המוקד, ויכולים להיחשב באופן מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, ליצור מסכה חדשה, שנקרא Erode (M01,2) ממסכת המורפולוגיה על תמונות brightfield M01, נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה של האזור, המחושב על מסכת Erode (M01,2). מהתאים שנבחרו בשער הקודם, לפתוח ההיסטוגרמה מראה את השטח של תאים באמצעות מסכה חדשה שנוצרה זה. מסכות המורפולוגיה זמינות על ידי: הערהברירת מחדל הוא הרבה יותר גדולה מהגודל האמיתי של התא. לכן, זה יותר מדויק לשחוק אותו עד 2 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר שער על תאי T הבודדים, לא כולל את חרוזי הכיול ופסולת (פינת קטנה) והכפילויות (שטח גדול). התאם את השער הזה בכל רכישה. הערה: וריאציות בגודל תא תשפיע על מעמדו של השער. ככל שתאי T העכבר קטנים יותר תאי T אנושיים שהם עצמם קטנים יותר מאשר תאי CEM, השטח של כל אחד מסוגי תאים יהיה יחסית לגודלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב בתאים בודדים, בפוקוס שהיו סגור בשלבים הקודמים, לפתוח עלילת נקודה בהיקף של Raw מקס Pixel על הכתמת HLA-ABC (ערוץ 2, ציר x) כפונקציה של Raw מקס Pixel על phalloidin הכתמה (ערוץ 4, ציר y). צור שער שלא לכלול את אירועי ניאון בלא כתם או רוויים. שתי היסטוגרמות פתוחות המציגות את Raw מקס Pixel לHLA-ABC (ערוץ 2) וphalloidin (ערוץ 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, creatמסכת ea חדשה, הנקראת Erode (M02,2) ממסכת המורפולוגיה של התאים HLA-ABC המוכתם (ערוץ 2), נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה הכוללת את הפרמטר המעגלי, המחושבת על Erode (M02,2). הערה: פרמטר זה מודד את הסטייה של צורת התא ממעגל. לכן, תא T עגול ומושלם יהיה ערך מעגלי גבוה ואילו תאים מקוטבים מוארכים יציג מדד מעגלי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך, ליצור היסטוגרמה אחרת שתדווח על הערכים של התכונה המעגליות מהתאים מגודר בעבר. השתמש היסטוגרמה זו עלילה ישירות ההפצה של פרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי השווי של המעגליות לכל תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור תאים-מגורה עישון, לצייר שער לתאים מקוטבים, החל משעת הערך המעגלי הנמוך ביותר עד לגובה שווי הגבול המעגלי שבו רוב תאי מגורה שאינוהם זממו. תראו את תצוגת הנתונים הסטטיסטיים עבור אחוז התאים מקוטבים בקרב האוכלוסייה הנשלטת (% מגודרים). הערה: יש לנו קבוצת השער הזה לערכי מדד מעגליים להלן 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסתכל על הקיטוב של ההכתמה אקטין בתאים, העלילה היסטוגרמה לערך הדמיון R3 פרט מואר, השוואת צביעת HLA-ABC (ערוץ 2) ומכתים phalloidin (ערוץ 4). הערה: גדולה יותר את הערך של תכונה זו, יותר גבי שני stainings הן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה האסטרטגיה gating כמו קודם, עלילה שער על תאי מגורה שאינו לצביעה הנפרדת המציגה את אחוז התאים עם כתמים אקטין מקוטבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יושלם, אחוז התאים מציג הפרדה בחלוקת MHC Class I וstainings phalloidin, אחוז התאים מקוטבים יחד עם הערכים הממוצעים של המדדים מעגליים ודמיון של כל התאים ± SD מוצג בcorrespלוחות סטטיסטיקת onding. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

באמצעות טכנולוגיה האחרונה של זרימת ההדמיה cytometry, אסטרטגית gating מהירה ואינפורמטיבי לנתח אירועים תאיים ומולקולריים הנגרמים על ידי גירוי chemokine מוצג. מניסוי בודד, ניתן לקבל שני סוגים עיקריים של מידע: השינויים במורפולוגיה של תאים הנגרמים על ידי גירוי chemokine והפצת subcellular של חלבונים שונים בתהליך הקיטוב. מעניין, ראיות היא גם סיפקו לאפשרות לנתח מספר גדול של תאים, המאפשר חוסן סטטיסטי וניתוח רלוונטי של חלק קטן של האוכלוסייה כל התא. כפי שדווח, טכניקה זו יכולה לשמש גם לניתוח ...

כמוקינים הם חלבונים מסיסים קטנים שמושכים תאים למקומות מיוחדים 1. לכן, הם משתתפים במיקום הנכון של תאים ברקמות, תפקיד מכריע בפיתוח ופיזיולוגיה. המערכת החיסונית היא לא יוצאת מכלל זה כפי שהוא מסתמך על הפעולה של סוגי תאים שונים הפועלים בתיאום לעלות תגובה חיסונית יעילה. על ידי שליטה על המיקום הספציפי של סוג תא חיסון אחד במצב נתון, כמוקינים הם-נדרש מראש לפני שניתן להבחין אנטיגנים זרים ונטרלו. בלימפוציטים מסוג T בפרט, כמוקינים להיקשר לקולטנים ספציפיים משטח ש, על אירוסין, לעורר רבים אותות תאיים (עליית סידן, זירחון ERK, הפעלת GTPases Rho, עלייה בשינויי זיקת integrins וcytoskeletal) שמעדיפים תנועתיות תאי T 2,3. ברמה התאית, ניתן לראות שינויים מורפולוגיים שהושרו על גירוי chemokine.שינויים אלה בצורות תא הם דרמטיים במיוחד בתאי T: יש לי תאי T נחים מורפולוגיה עגולה כמו חרוז-בעת נסיעה בזרם הדם. עם זאת, החישה של הנוכחות של כמוקינים באתרים דלקתיים או בקרבתו של איברי הלימפה הולכת לשנות את הצורה של תאי T אשר כעת לאמץ מורפולוגיה טיפוסית &quot;יד-ראי&quot; בהיקף של צורה דו-קוטבית: קצה מוביל בחזית ונגרר לקצה, או uropod, בחלק האחורי 4. בנוסף, רכיבים תאיים יכולים להפריד לשני אזורים מנוגדים אלו של תאי T מקוטבים כדי לקיים הגירה. לדוגמא, עליית פילמור הסיבי אקטין על גירוי chemokine 5 ויקטין polymerized מצטברת בחלק הקדמי של תא T מקוטב 2. מצד השני, כמה חלבונים, כגון חלבוני phosphorylated של משפחת Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) המקשרת את קרום הפלזמה לשלד תא F- אקטין קליפת המוח, מחדש בתרגום בuropod של מקוטבתאי T 6. מעניין, אנחנו ואחרים הראינו שנדרש תהליך קיטוב זה לנדידת תאי T. ואכן, כל טיפול שמפריע לקיטוב ימנע תנועתיות סלולרית. לדוגמא, עיכוב של הפעילות של החברים של החלבון טיפוסי קינאז C (PKC) משפחה, קיטוב תא לוקי PKCζ וPKCι T ותהליך סריקת הנדידה שלהם של תאים דנדריטים 7. קיטוב תא T גם מוסדר על ידי Rho GTPases. הראינו כי האפנון של פעילות RhoA על ידי חלבון Fam65b תאר לאחרונה מפריע T שינויי תא במורפולוגיה והיכולת שלהם להעביר בassay Transwell 6. כקיטוב הוא צעד תנאי מוקדם לתנועתיות סלולרית, זה קריטי ובכך להיות מסוגל לכמת את זה כקריאה העיקרית של תגובות chemokine. שינויי צורת תא נמדדו בעבר באופן ידני 8. עם זאת, בכימות סוג זה הוא זמן רב מאוד, כך שבדרך כלל רק כמהעשרות תאים נלקחים בחשבון. כאן, שיטה חדשה מוצגת לכמת את מידת שינויי צורה של לימפוציטים מסוג T נחשף לchemokine גירוי במהירות. זרימת הדמיה cytometry הטכנולוגיה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) משמש, המשלב את היתרונות של cytometer זרימה ומיקרוסקופ 9 לכמת ביעילות את כמות תאים מקוטבים בתנאים שונים של גירוי chemokine. בנוסף לכימות של השינויים מורפולוגיים שאפשר למדוד וחסונה עם הטכנולוגיה הזו, אפשר גם להעריך שינויים בלוקליזציה subcellular של חלבונים מסוימים על איתות chemokine.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>יש לחמם מראש כדי להשבית את המשלים.</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>יש לחמם מראש כדי לנטרל את המשלים.</td></tr><tr><td>ערכת נוקלאופקטור של תאי T אנושיים</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>עכברים IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>עכברים CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים.</td></tr><tr><td>CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots אנושיים מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים.</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots אנושיים מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים. ניתן להשתמש בכימוקין זה גם על תאי T של עכברים.</td></tr><tr><td></td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>PFA 157-8-100</td><td>זוהי תמיסת PFA של 8% במים. ערבבו נפח לנפח עם 2x PBS כדי לקבל תמיסת PFA של 4% ב-PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן FITC-anti-HLA-ABC</td> שיבוט <td>בקמן קולטר</td><td>IM1838</td><td>B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>אמניס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

תאים מגיבים לגירוי chemokine ידי לאבד הצורה העגולה שלהם בתהליך הנקרא קיטוב, ועל ידי שינוי לוקליזציה subcellular של חלבונים רבים. טכניקות הדמיה קלאסית שימשו לחקר תופעות אלה. עם זאת, הם נדרשים הרכישה הידנית של תאים רבים ואחריו כימות של המורפולוגיה ושיתוף הלוקליזציה של ההכתמה של עשרות תאים זמן רב. כאן, שיטה מהירה וחזקה מתוארת ללמוד תופעות אלה על דגימות מורכבות מכמה אלפי תאים באמצעות זרימת הדמיה cytometry טכנולוגיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ עם אלה של cytometer. באמצעות לימפוציטים מסוג T מגורה עם CCL19 וצביעה למולקולות MHC Class I ויקטין פילמנטיות, אסטרטגית gating מוצגת למדוד בו זמנית מידת שינויי צורה והמידה של שיתוף לוקליזציה של סמנים שמושפעים מאיתות CCL19. יתר על כן, אסטרטגית gating זה אפשרה לנו observדואר ההפרדה אקטין פילמנטיות (בחזית) וEzrin-Radixin-Moesin פוספורילציה (phospho-ERM) החלבונים (בחלק האחורי) בתאי T מקוטבים לאחר גירוי CXCL12. טכניקה זו הייתה שימושית גם כדי לבחון את השפעת החסימה על קיטוב של שני אלמנטים שונים: עיכוב של פילמור אקטין ידי מעכב וביטוי תרופתי של מוטציות של / מסלול PKC איתות לא טיפוסי Par6. לפיכך, ראיות הראו כי טכניקה זו שימושית כדי לנתח את שני שינויים מורפולוגיים והפצה מחדש חלבון.

הדוגמא הראשונה שנבחרה כאן נוגעת לשימוש בלימפוציטים מסוג T האנושי העיקרי מגורה עם CCL19. עם זאת, באותה האסטרטגיה ניתן להשתמש בתאי עכבר העיקרי T, שורות תאי T או כל סוג תא אחר מגיב לגירוי chemokine. אסטרטגית gating מוצגת כאן כוללת סדרה של חלונות שבחר את האירועים ממוקדים, אז תאים בודדים. לבסוף הטווח של עוצמת הקרינה ואחריו כאן כדוגמא על שני סמנים: MHC Class I HLA-ABC ויקטינו פילמנטיות למנוחה (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T. <p cl...

איתות כימוקין מעורר שינויים ניכרים במורפולוגיה התאית וכמה הפצות מחדש חשובות של חלבונים תוך-תאיים. כאן, ניתן פרוטוקול מהיר ומפורט לחקר אירועים אלה.

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

מטרת ההליך הבא היא לכמת במהירות ובאופן אוטומטי את השינויים במורפולוגיה של התא ואת הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים ספציפיים בעלי עניין במספר רב של תאים בתגובה לגירוי מסוים. זה מושג על ידי גירוי תאי ה-T תחילה עם סוגי הכימותרפיה המעניינים. בשלב השני, התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי ולאחר מכן מנותחים על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה.בשלב האחרון, ניתן להעריך את מספר הלימפוציטים המקוטבים מורפולוגית ואת כמות ההפרדה של הסמנים הפלואורסצנטיים על סמך המיקום ועוצמת הפיקסלים עבור כל מכתים, בהתאם למסכה שנבחרה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכנולוגיית ציטומטריית זרימת הדמיה זו כדי לכמת במהירות ובעוצמה את השינויים המורפולוגיים של לימפוציטים לאחר גירוי כימוקין, כמו גם את מיקומם של חלבונים ספציפיים בעלי עניין בתוך התאים המקוטבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שניתן לעבד מספר רב של תאים ולנתח אותם באופן אוטומטי, תוך הבטחת ניתוח חזק סטטיסטית של השינויים המורפולוגיים והתפלגות החלבון.בלימפוציטים מסוג T מגורים כימוקין, גירוי מסוג בוצ'ה של תאי T מתחיל בשטיפה של חמש פעמים מרכז חמשת התאים למצב ניסוי ב-HBSS חם בתוספת צנטריפוגת HEPs של 10 מילי-מולרית למשך חמש דקות ב-340 פעמים G.At טמפרטורת החדר, להסיר את הסופינט ולהשעות מחדש את הכדורים ב-0.3 מיליליטר של HBSS חם הוא חתיכה לכל צינור. לאחר מכן העבירו את מתלי התאים לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים של 1.5 מיליליטר. הוסף 10 עד 500 ננוגרם למיליליטר כימוקין לכל שפופרת, ולאחר מכן הפוך את הצינורות מספר פעמים כדי לערבב.דגרו על התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שמונה עד 10 דקות, עצרו את הקיטוב עם 0.3 מיליליטר חם, 2% פרלדהיד בתוספת 10 מילימולר. הוא אפונה.לאחר מכן מערבבים את הצינורות עם עוד היפוך ודוגרים אותם למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לצבוע את התאים לניתוח אימונופלואורסצנטי. לאחר מכן, העבירו את תאי ה-T המגורים לצינורות ציטומטריית זרימה מתאימים. מלאו את הצינורות לחלוטין במאגר מכתים.לאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של סרום עגל עוברי 5% ב-PBS. כעת הוסף חמישה מיקרוליטרים של ZI N-T-H-L-A-A-B-C לכל צינור. מערבלים אותם ודוגרים על התאים למשך 30 דקות של טמפרטורת החדר בחושך בסוף הדגירה.שטפו את התאים פעמיים ואז דגרו אותם ב -500 מיקרוליטר של 1% פרה פורמלדהיד. לאחר 10 דקות, שטפו את התאים במאגר מכתים נוסף, ואז מלאו את הצינורות לחלוטין במאגר חלחול. לאחר שטיפת התאים פעמיים במאגר החדירה השאירו את הצינורות כדי להסיר את הסופינט ואז מערבל אותם כדי לנתק את כדורי התא.כעת צבעו את הדגימות בנקודת אפס 25 מיקרוגרם למיליליטר, טריקסי למותניים, מערבל אותן ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. ואז בסוף תקופת הדגירה, יש לשטוף את התאים במאגר חלחול. שוב, החייאה.השעו את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של PBS ולאחר מכן העבירו את התאים לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים כדי לקבוע את אחוז תאי ה-T המקוטבים לאחר גירוי כימוקין. ראשית הפעל את ציטומטר זרימת ההדמיה ותן לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן. צייר היסטוגרמות המכמתות את ערכי מעבר הצבע של RMS מהאוכלוסייה במוקד שנבחרה במעבר הצבע של RMS.היסטוגרמה תוחמת את אוכלוסיית התאים הבודדים בהיסטוגרמה של האזור לאחר החדרת צינור המיקרו צנטריפוגה למכונה, התאמת הליכת כוח הלייזר על תאים בודדים ורוכשת 5,000 לימפוציטים T. בתוכנת ניתוח רעיונות. פתח את הקבצים שנרכשו, ולאחר מכן צור היסטוגרמה המציגה את ערך ה-RMS של השיפוע עבור תמונות השדה הבהיר המתקבלות עבור כל תא בודד, תוך ציור שער על התאים, המציג ערך שיפוע RMS מעל 57.בתפריט הניתוח, צור מסכה חדשה בשם erode M1 two ממסכת המורפולוגיה בתמונות השדה הבהיר M אפס אחד נשחק משני פיקסלים. לאחר מכן, בתפריט תכונות הניתוח, צור תכונה חדשה של השטח המחושב על מסיכת השחיקה M1 מהתאים שנוצרו בשער הקודם. פתח היסטוגרמה המציגה את שטח התאים בעזרת המסכה החדשה שנוצרה, צייר שער על תאי ה-T הבודדים, למעט חרוזי הכיול והפסולת באזור הקטן, כמו גם הכפילים באזור הגדול.לאחר מכן פתח א. בוט המורכב מהמקסימום הגולמי על צביעת H-L-A-A-B-C כפונקציה של הפיקסל המקסימלי הגולמי על צביעת הפין בתפריט מסכות הניתוח בחזרה למסכה חדשה הנקראת erode M שתיים שתיים ממסכת המורפולוגיה של תאי הכתמים H-L-A-A-B-C שנשחקו משני פיקסלים. לאחר מכן, בתפריט תכונות הניתוח, צור תכונה חדשה המורכבת מפרמטר המעגליות המחושב על השחיקה M שתיים שתיים.לאחר מכן, צור היסטוגרמה נוספת כדי לדווח על הערכים של תכונת המעגליות מהתאים המגודרים קודם לכן. לאחר מכן מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור התאים הלא מגורים, אגת RO עבור התאים המקוטבים, החל מערך המעגליות הנמוך ביותר ועד לערך גבול המעגליות שבו רוב התאים הלא מגורים משורטטים כדי להעריך את הקיטוב של צביעת האקטין בתוך התאים. בנוסף היסטוגרמה לדמיון הפרטים הבהירים, ערך R שלוש להשוואה בין H-L-A-A-B-C לבין ה-FOID בצביעה.לאחר מכן השתמש באותה אסטרטגיית שער כפי שהודגמה זה עתה, בתוספת GA על התאים הלא מגורים עבור הצביעה המופרדת הלא מקומית. לוח הסטטיסטיקה מציג כאן את אחוז תאי ה-T עם צביעת אקטין מקוטבת. מוצגות דוגמאות ללימפוציטים T מגורים CCL 19 הנופלים בשער התאים הלא מקוטבים או המקוטבים.ניתן להבחין בבירור בהבדלים במורפולוגיה בין שתי תת-האוכלוסיות. ניתן להשתמש באסטרטגיית השער שהודגמה זה עתה גם כדי לשרטט את אחוז התאים הנופלים בשער המקוטב בהיעדר נוכחות של CCL 19. כצפוי, ברור שגירוי כימוקין מגדיל את אחוז תאי ה-T המקוטבים.ניתן לשרטט גם את מדד המעגליות הממוצע של כל אוכלוסיית התאים המתקבלת בשני התנאים. ואכן, גירוי CCL 19 מעורר ירידה במדד זה. עם זאת, מכיוון שרק מחצית מהתאים מקוטבים, השינוי במדד המעגליות הממוצע שנצפה בגירוי CCL 19 הוא קטן.בניסוי זה, תאי ה-T הועברו ל-cot עם GFP יחד עם פלסמידים המקודדים למוטציות השליליות הדומיננטיות של קומפלקס הקוטביות par six. PKC zeta. ההיסטוגרמה עבור התאים הלא מועברים אפשרה שער ספציפי עבור תאי ה-T החיוביים הרלוונטיים של GFP המציין שחלק קטן מאוכלוסיית התאים כולה עבר טרנספטציה.מידת הקיטוב המורפולוגי של תאים אלה כומתה לאחר מכן על ידי מדידת מדד המעגליות של התאים החיוביים GFP בלבד והליכה נוספת לתאי T. הצגת ערכים נמוכים של מעגליות נוצרה כדי להעריך את אחוז התאים המקוטבים בכל תנאי שנלקח. יחד, נתונים אלה מדגימים כי שיבוש התפקוד של ה-PK CZ par 6 למסלול האיתות מעכב את הקיטוב של תאי T המושרה על ידי כימוקינים CCL 19 ו-c Xcl 12.בהתאם לממצאים קודמים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לעבוד תמיד ב-37 מעלות צלזיוס לאורך שלב גירוי המשפחה בתמיסות והקיבוע הבא כדי להבטיח קיטוב מורפולוגי חזק ואמין של הלימפוציטים.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

סרטון זה מדגים בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים בשיטת All-on-Chip. השיטה מאפשרת בידוד ישיר של נויטרופילים מהדם כולו על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית ואחריה בדיקת כימוטקסיס על שבב מיקרופלואידי.

שיטה מיקרופלואידית מבוססת שבב לניתוח מהיר של כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות דם מלא

דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

למדו לכמת שינויים במורפולוגיה ובלוקליזציה של חלבונים בתאי T לאחר גירוי כימוקין באמצעות ציטומטריית זרימה עם דימות. שיטה זו מאפשרת ניתוח סטטיסטי מהיר וחזק של אוכלוסיות תאים גדולות.

ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

גלה סרטונים נוספים