ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

מטרת ההליך הבא היא לכמת במהירות ובאופן אוטומטי את השינויים במורפולוגיה של התא ואת הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים ספציפיים בעלי עניין במספר רב של תאים בתגובה לגירוי מסוים. זה מושג על ידי גירוי תאי ה-T תחילה עם סוגי הכימותרפיה המעניינים. בשלב השני, התאים מסומנים באופן פלואורסצנטי ולאחר מכן מנותחים על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה.

בשלב האחרון, ניתן להעריך את מספר הלימפוציטים המקוטבים מורפולוגית ואת כמות ההפרדה של הסמנים הפלואורסצנטיים על סמך המיקום ועוצמת הפיקסלים עבור כל מכתים, בהתאם למסכה שנבחרה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכנולוגיית ציטומטריית זרימת הדמיה זו כדי לכמת במהירות ובעוצמה את השינויים המורפולוגיים של לימפוציטים לאחר גירוי כימוקין, כמו גם את מיקומם של חלבונים ספציפיים בעלי עניין בתוך התאים המקוטבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שניתן לעבד מספר רב של תאים ולנתח אותם באופן אוטומטי, תוך הבטחת ניתוח חזק סטטיסטית של השינויים המורפולוגיים והתפלגות החלבון.

בלימפוציטים מסוג T מגורים כימוקין, גירוי מסוג בוצ'ה של תאי T מתחיל בשטיפה של חמש פעמים מרכז חמשת התאים למצב ניסוי ב-HBSS חם בתוספת צנטריפוגת HEPs של 10 מילי-מולרית למשך חמש דקות ב-340 פעמים G.At טמפרטורת החדר, להסיר את הסופינט ולהשעות מחדש את הכדורים ב-0.3 מיליליטר של HBSS חם הוא חתיכה לכל צינור. לאחר מכן העבירו את מתלי התאים לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים של 1.5 מיליליטר. הוסף 10 עד 500 ננוגרם למיליליטר כימוקין לכל שפופרת, ולאחר מכן הפוך את הצינורות מספר פעמים כדי לערבב.

דגרו על התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שמונה עד 10 דקות, עצרו את הקיטוב עם 0.3 מיליליטר חם, 2% פרלדהיד בתוספת 10 מילימולר. הוא אפונה.

לאחר מכן מערבבים את הצינורות עם עוד היפוך ודוגרים אותם למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לצבוע את התאים לניתוח אימונופלואורסצנטי. לאחר מכן, העבירו את תאי ה-T המגורים לצינורות ציטומטריית זרימה מתאימים. מלאו את הצינורות לחלוטין במאגר מכתים.

לאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של סרום עגל עוברי 5% ב-PBS. כעת הוסף חמישה מיקרוליטרים של ZI N-T-H-L-A-A-B-C לכל צינור. מערבלים אותם ודוגרים על התאים למשך 30 דקות של טמפרטורת החדר בחושך בסוף הדגירה.

שטפו את התאים פעמיים ואז דגרו אותם ב -500 מיקרוליטר של 1% פרה פורמלדהיד. לאחר 10 דקות, שטפו את התאים במאגר מכתים נוסף, ואז מלאו את הצינורות לחלוטין במאגר חלחול. לאחר שטיפת התאים פעמיים במאגר החדירה השאירו את הצינורות כדי להסיר את הסופינט ואז מערבל אותם כדי לנתק את כדורי התא.

כעת צבעו את הדגימות בנקודת אפס 25 מיקרוגרם למיליליטר, טריקסי למותניים, מערבל אותן ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. ואז בסוף תקופת הדגירה, יש לשטוף את התאים במאגר חלחול. שוב, החייאה.

השעו את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של PBS ולאחר מכן העבירו את התאים לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים כדי לקבוע את אחוז תאי ה-T המקוטבים לאחר גירוי כימוקין. ראשית הפעל את ציטומטר זרימת ההדמיה ותן לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן. צייר היסטוגרמות המכמתות את ערכי מעבר הצבע של RMS מהאוכלוסייה במוקד שנבחרה במעבר הצבע של RMS.

היסטוגרמה תוחמת את אוכלוסיית התאים הבודדים בהיסטוגרמה של האזור לאחר החדרת צינור המיקרו צנטריפוגה למכונה, התאמת הליכת כוח הלייזר על תאים בודדים ורוכשת 5,000 לימפוציטים T. בתוכנת ניתוח רעיונות. פתח את הקבצים שנרכשו, ולאחר מכן צור היסטוגרמה המציגה את ערך ה-RMS של השיפוע עבור תמונות השדה הבהיר המתקבלות עבור כל תא בודד, תוך ציור שער על התאים, המציג ערך שיפוע RMS מעל 57.

בתפריט הניתוח, צור מסכה חדשה בשם erode M1 two ממסכת המורפולוגיה בתמונות השדה הבהיר M אפס אחד נשחק משני פיקסלים. לאחר מכן, בתפריט תכונות הניתוח, צור תכונה חדשה של השטח המחושב על מסיכת השחיקה M1 מהתאים שנוצרו בשער הקודם. פתח היסטוגרמה המציגה את שטח התאים בעזרת המסכה החדשה שנוצרה, צייר שער על תאי ה-T הבודדים, למעט חרוזי הכיול והפסולת באזור הקטן, כמו גם הכפילים באזור הגדול.

לאחר מכן פתח א. בוט המורכב מהמקסימום הגולמי על צביעת H-L-A-A-B-C כפונקציה של הפיקסל המקסימלי הגולמי על צביעת הפין בתפריט מסכות הניתוח בחזרה למסכה חדשה הנקראת erode M שתיים שתיים ממסכת המורפולוגיה של תאי הכתמים H-L-A-A-B-C שנשחקו משני פיקסלים. לאחר מכן, בתפריט תכונות הניתוח, צור תכונה חדשה המורכבת מפרמטר המעגליות המחושב על השחיקה M שתיים שתיים.

לאחר מכן, צור היסטוגרמה נוספת כדי לדווח על הערכים של תכונת המעגליות מהתאים המגודרים קודם לכן. לאחר מכן מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור התאים הלא מגורים, אגת RO עבור התאים המקוטבים, החל מערך המעגליות הנמוך ביותר ועד לערך גבול המעגליות שבו רוב התאים הלא מגורים משורטטים כדי להעריך את הקיטוב של צביעת האקטין בתוך התאים. בנוסף היסטוגרמה לדמיון הפרטים הבהירים, ערך R שלוש להשוואה בין H-L-A-A-B-C לבין ה-FOID בצביעה.

לאחר מכן השתמש באותה אסטרטגיית שער כפי שהודגמה זה עתה, בתוספת GA על התאים הלא מגורים עבור הצביעה המופרדת הלא מקומית. לוח הסטטיסטיקה מציג כאן את אחוז תאי ה-T עם צביעת אקטין מקוטבת. מוצגות דוגמאות ללימפוציטים T מגורים CCL 19 הנופלים בשער התאים הלא מקוטבים או המקוטבים.

ניתן להבחין בבירור בהבדלים במורפולוגיה בין שתי תת-האוכלוסיות. ניתן להשתמש באסטרטגיית השער שהודגמה זה עתה גם כדי לשרטט את אחוז התאים הנופלים בשער המקוטב בהיעדר נוכחות של CCL 19. כצפוי, ברור שגירוי כימוקין מגדיל את אחוז תאי ה-T המקוטבים.

ניתן לשרטט גם את מדד המעגליות הממוצע של כל אוכלוסיית התאים המתקבלת בשני התנאים. ואכן, גירוי CCL 19 מעורר ירידה במדד זה. עם זאת, מכיוון שרק מחצית מהתאים מקוטבים, השינוי במדד המעגליות הממוצע שנצפה בגירוי CCL 19 הוא קטן.

בניסוי זה, תאי ה-T הועברו ל-cot עם GFP יחד עם פלסמידים המקודדים למוטציות השליליות הדומיננטיות של קומפלקס הקוטביות par six. PKC zeta. ההיסטוגרמה עבור התאים הלא מועברים אפשרה שער ספציפי עבור תאי ה-T החיוביים הרלוונטיים של GFP המציין שחלק קטן מאוכלוסיית התאים כולה עבר טרנספטציה.

מידת הקיטוב המורפולוגי של תאים אלה כומתה לאחר מכן על ידי מדידת מדד המעגליות של התאים החיוביים GFP בלבד והליכה נוספת לתאי T. הצגת ערכים נמוכים של מעגליות נוצרה כדי להעריך את אחוז התאים המקוטבים בכל תנאי שנלקח. יחד, נתונים אלה מדגימים כי שיבוש התפקוד של ה-PK CZ par 6 למסלול האיתות מעכב את הקיטוב של תאי T המושרה על ידי כימוקינים CCL 19 ו-c Xcl 12.

בהתאם לממצאים קודמים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לעבוד תמיד ב-37 מעלות צלזיוס לאורך שלב גירוי המשפחה בתמיסות והקיבוע הבא כדי להבטיח קיטוב מורפולוגי חזק ואמין של הלימפוציטים.