שימוש בנוקלאוטידים פסיקת זרימת הקרינה ותווית לניתוח מחזור מחזור ATP של Kinesins

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הקינטיקה של קשירת נוקלאוטידים ודיסוציאציה במהלך מחזור תחלופת A TP של קינזין. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של חלבון הקינזין, ללא נוקלאוטיד או עמוס בנוקלאוטיד עם תווית פלואורסצנטית. לאחר מכן, הקינזין המוכן מעורבב עם נוקלאוטיד באמצעות פלואוריומטר זרימה נעצרת ונצפה השינוי בקרינה הקשור לקשירה או דיסוציאציה של נוקלאוטיד המסומן בפלואורסצנט.

אז השינוי בקרינה מתאים לפונקציה מעריכית כדי לקבל קבוע קצב. לבסוף, קבועי הקצב הנמדדים מואצלים וקבועי הקצב מיוחסים למעברים מסוימים של מחזור התחלופה A TP. בסופו של דבר, השילוב של נוקלאוטיד עם תווית פלואורסצנטית ופלואורסצנציה של זרימה עצורה משמש למדידת הקינטיקה של קשירת נוקלאוטידים ודיסוציאציה.

CIN ידגימו את ההליך ג'ניפר פאטל, פוסט-דוקטורנטית וחנה בלץ', סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר קביעת עוצמת הקרינה של קינזין בעת קשירה של נוקלאוטיד המסומן באדם כמתואר בפרוטוקול הטקסט לתמיסה של עד 20 קינזין מיקרו-מולרי במאגר נטול מגנזיום במילימולרית אחת של EDTA ומילימולרית אחת של DTT דגרו את התמיסה למשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, הגדירו עמודת סינון ג'ל בזרימת הכבידה G 25 SX ושיווי משקל עם לפחות שלושה נפחי עמודות ללא מגנזיום מאגר. לאחר מכן טען את תמיסת ה-essin לעמודה כדי להפריד נוקלאוטידים חופשיים ו-EDTA מהקינזין.

תקן צינור איסוף על ידי הוספת נפח של תמיסת מגנזיום כלוריד 100 מילימולרית לצינור הריק, כך שהריכוז הסופי של מגנזיום כלוריד הוא מילימול אחד. לאחר איסוף תמיסת הקינזין, שימוש במאגר מתאים ללא מגנזיום מסלק במהירות את הקינזין. נוכחותו של מגנזיום כלוריד בצינור האיסוף עוזרת לייצב את הקינזין מיד לאחר שאיאן מהעמוד לאחסן את הקינזין על קרח ולהשתמש בו תוך שעה עד שעתיים.

בינתיים, הכינו לאדם סדרת ריכוז TP. בחר את טווח הריכוזים בהתאם לריכוז הזמין של קינזין. עבור כל ריכוז של מנט, TP מכין ריכוז מתאים של קינזין כך שהאדם המסומן בנוקלאוטיד נמצא בעודף מולארי פי חמישה עד עשרה על אתרי קשירת נוקלאוטידים של קינזין.

הגדר את אורך גל העירור על פלואורמטר הזרימה העצירה 365 ננומטר ואת אורך גל הפליטה מעל 400 ננומטר עם מסנן מעבר ארוך. לאחר מכן, החל מהריכוז הנמוך ביותר של מנטה TP, השתמש בפלואוריומטר הזרימה המופסקת כדי לערבב את המנטה TP והקינזין נטול הנוקלאוטידים ביחס נפח לנפח של אחד לאחד. שימוש בנוסחה הבאה מתאים את השינוי במדד עוצמת הקרינה כדי ללמד את ריכוז המנט A TP לפונקציה מעריכית, בתוספת קו של שיפוע שלילי קבוע כדי להסביר את ההלבנה הפוטולוגית של קבוצת המנט.

מהתאמות אלה קובעים קבוע קצב בכל ריכוז של מנט. לאחר מכן TP מאציל את שיעורי האסוציאציה והדיסוציאציה על ידי שימוש בחוט דנטלי כנגד ריכוז המנט. A TP לאחר מכן התאם את הנתונים הללו לפונקציה ליניארית כדי להשיג את יירוט השיפוע וציר ה-y.

השיפוע מייצג את קבוע הקצב עבור אדם קשר TP עם יחידות לטוחנת לשנייה. היירוט מייצג את קצב הדיסוציאציה הקבוע עם היחידות לשנייה. כדי למדוד את קבוע קצב הדיסוציאציה יש לתסוס DP לתמיסה של שני קינזין מיקרו-מולרי במאגר מתאים ב-50.

מיקרומולר פירושו אינקובטור DP 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שימוש בעמודת Sedex G 25 כדי להסיר פרמנט, DP מהקינזין, טעון במנט A DP, והגדרת פלוטר זרימת העצירה כמתואר קודם לכן בסרטון זה, השתמש בזרימה המופסקת כדי לערבב את קומפלקס מנט A DP Kinine עם עודף מולרי פי 50 או יותר של A TP ללא תווית ביחס נפח לנפח של אחד לאחד. הירידה בעוצמת הקרינה נצפתה לאורך זמן לפונקציה מעריכית אחת, בתוספת קו של שיפוע שלילי קבוע כדי לאפשר פוטו-הלבנה של הקבוצה.

הקופס שנקבע מהתאמה זו הוא קבוע הקצב לדיסוציאציה של מנט A DP עם יחידות של לשנייה. גודל שינוי האות בעת קשירה או דיסוציאציה של נוקלאוטיד עץ מנטלי תלוי בקינזין המסוים. לכן, כדאי לבצע תחילה מדידות שיווי משקל כדי לאשר הן את הנוכחות והן את הגודל של שינוי עוצמת הפלואורסצנט.

ספקטרום פלואורסצנטי מתסיס TP ופירושו DP הן בתמיסה והן בקומפלקס של קינזין M CAC מוצגים כאן. איור זה מתאר את התגובה המתרחשת בעת ערבוב אדם TP עם קינזין נטול נוקלאוטיד. העלייה בעוצמת הקרינה המתרחשת בעת קשירה של אדם A TP ל-M CAC מוצגת כאן, המתאימה לקבוע הקצב לעומת האדם.

ריכוז TP לפונקציה ליניארית כפי שניתן לראות כאן מאפשר דה-קונבולוציה של קבוע הקצב התורם לקופס ומספק את עמדת קצב האסוציאציה והדיסוציאציה תסיסה A TP. איור זה מציג את הירידה בעוצמת הקרינה שנצפתה בתסיסה A DP בעת דיסוציאציה מ- M CEC כפי שמוצג כאן. קבוע הקצב לדיסוציאציה של מנט A DP מ-Kinesin נקבע על ידי התאמת נתונים אלה לפונקציה מעריכית. לאחר שליטה, ניתן להשלים כל אחד מהפרוטוקולים הללו תוך פחות משלוש שעות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קינזין, ניתן ליישם אותה גם על חלבונים קושרי נוקלאוטידים אחרים, כגון חלבוני מיוזין ו-G. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בנוקלאוטידים המסומנים בפלורסנט ובמד זרימת עצירה כדי למדוד את הקינטיקה של קשירת נוקלאוטידים ודיסוציאציה עבור קינזין.