מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה In vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג נוירונים חושי ריח in vivo כדי לדמיין מורפולוגיה והתפתחות אקסונלית. זה מושג על ידי נקבוביות פלואורו ארבע דקסטרן מצומד לתאי עצב חושי ריח יחידים. השלב השני הוא להמתין 24 שעות כדי לאפשר לצבע להתפשט לתהליכים האקסונליים של תאי העצב החושיים.

לאחר מכן, ראשן מורדם וערימת תמונה תלת מימדית של נורת הריח נרכשת באמצעות מיקרוסקופ רב פוטונים. השלב האחרון הוא לבחון שוב ושוב את הנוירון המסומן באותה חיה לאחר מרווחי זמן מוגדרים. בסופו של דבר, שחזור של מורפולוגיה תאית מאפשר הדמיה של שינויים במורפולוגיה אקסונלית.

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד אקסונים גדלים לעבר אזורי המטרה במוח הקדמי וכיצד נוצרות סינפסות. לפני הניסוי. ודא שמערך האלקטרופורציה מורכב ממיקרוסקופ סטריאו עם מרחק עבודה גדול ומצויד בתאורת פלורסנט וערכות מסננים לצבע.

משמש לאלקטרופורציה השתמש באלקטרופורציה ייעודית של תא בודד או במחולל דופק מרובע גנרי המחובר לאוסצילוסקופ. חבר את יציאות האלקטרופורציה למחזיק פיפטה ואלקטרודת אמבטיה. ודאו שגם מחזיק הפיפטה וגם אלקטרודת האמבטיה מכילים חוטי כסף המצופים בשכבה דקה של כלוריד כסף

לאחר מכן, הרכיב את מחזיק הפיפטה על מיקרו מניפולטור כדי לאפשר מיקום מדויק. לאחר מכן, יש לייצר את המיקרו פיפטות לאלקטרופורציה עם נימי זכוכית בו סיליקט עם נימה פנימית. הגדר את הפרמטרים של מיקרו פיפטה קוטבית כדי לייצר שוק ארוך יותר ומיקרו פיפטה הנפתחת בקצה קטן יותר עם התנגדות גבוהה לפיפטה לאלקטרופורציה של תא בודד.

לאחר מכן מדוד את התנגדות הפיפטה ישירות עם התא היחיד הייעודי האלקטרופור. בהליך זה, ממיסים פלואורו ארבעה דקסטרן מצומד בצלצול הצפרדע בריכוז של שלוש מילימולר. חלקו את תמיסת המלאי הזו למנות קטנות ואחסנו את זו לשימוש עתידי במקפיא.

לאחר מכן, מלאו מחדש את המיקרו פיפטה באחד עד חמישה מיקרוליטר של תמיסת דקסטרן. החלק בזהירות את המיקרו פיפטה כדי להסיר שאריות בועות אוויר מקצה הפיפטה. לאחר מכן הרכיב את המיקרו פיפטה במחזיק הפיפטה.

ודא שחוט הכסף בתוך הפיפטה נמצא במגע עם תמיסת הצבע. כעת, הניחו חתיכת טישו קטנה בצלחת פטרי וכסו אותה בכמות קטנה של מים המכילה 0.02% טריקה. לאחר מכן, יש להרדים ראשן טרום מטמורפי במים המכילים 0.02% טריקה.

ודא הרדמה נכונה על ידי נגיעה בה וודא שהיא אינה מגיבה. לאחר מכן העבירו בזהירות את הראשן לצלחת הפטרי המכוסה ברקמות. ודא שהאלקטרודה נמצאת במגע עם הרקמה הרטובה, ומקם את קצה המיקרו פיפטה קרוב לאיבר הריח של הראשן באמצעות מניפולטור מיקרו

לאחר מכן, יש לחדור לעור המכסה את איבר הריח. בעזרת קצה הפיפטה, קדם בזהירות את הקצה לשכבת הנוירונים החושית הממוקמת במרכז של אפיתל הריח הראשי או אפיתל האף MRO. כעת הפעל את פולסי המתח הריבועי החיובי על מנת להעביר את הצבע לתאי העצב החושיים על ידי הפעלת עמוד מתח יחיד או רכבות של פולסים מרובים.

לאחר מכן דמיין את שחול הצבע והאלקטרופורציה המוצלחים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. הצבע מתפשט במהירות לגוף התא ולדנדריטים לאחר אלקטרופורציה מוצלחת. לאחר חזרה על ההליכים עבור איבר הריח השני של הראשנים, העבירו את הראשן לכוס מלאה במים מתוקים לצורך התאוששות, ואפשרו לצבע האלקטרופוטרי להתפשט לתאי העצב החושיים ולפקעת הריח.

לפחות 24 שעות לאחר האלקטרופורציה, יש להרדים את הראשן במים המכילים 0.02% טריקה. לאחר מכן, העבירו בזהירות את הראשן לתא הדמיה. חותכים מלבן קטן מרצועת פרם.

לאחר מכן מכסים את הראשן בפרם, ומשאירים את קפלון הזנב הקדמי דרך חלון החתוך. תקן את הפראם עם מחטים על הכלי מבלי לפגוע בראשן, וודא שהראשן שקוע במים המכילים 0.02% טריקה. לאחר מכן הרכיב את תא ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ רב פוטונים זקוף או מיקרוסקופ קונפוקלי.

רכוש ערימה תלת מימדית של תמונות של נורת הריח וודא שהליך ההדמיה לא יעלה על 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, החזר את הראשן למים רגילים במיכל נפרד ומנע ממנו חשיפה לאור. בתמונה זו, ארבעה גדילי סיפון המחוברים לרביעיות פלואורו שונות עברו אלקטרופוטציה בארבעה מיקומים מרוחקים של איבר הריח, לרוחב מסומן בירוק, ביניים מסומן בצהוב מדיאלי המסומן באדום, ואיבר האף הוומר מסומן בכתום.

זה מאפשר הדמיה של נורת הריח האביזר ושלושת שדות ההקרנה העיקריים של נורת הריח הראשית. תמונה זו מציגה שחזורים תלת מימדיים של דפוסי צמיחה אקסונליים שונים של נוירונים חושיים של חוש הריח היחיד המונחים על גבי מבנה פקעת הריח, והנה דוגמה לאקסון נוירון חושי ריח יחיד המקרין לתוך פקעת הריח ויוצר ארבוריזציה ציצית בגלומרולרי כדורי. כפי שניתן לראות כאן באופוס לוו, האקסונים הללו מתפצלים באופן קבוע לפני שהם מתחברים לאחד, שניים או מרובים.

זוהי דוגמה מייצגת לנוירון חושי ריח בודד שנחקר שוב ושוב על ידי הדמיית Time lapse in vivo המראה שינויים מתמשכים במורפולוגיה אקסונלית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג נוירונים חושי ריח באמצעות אלקטרופורציה וכיצד לעקוב אחר התפתחותם באמצעות הדמיית TimeLapse in vivo.