Regioselective Biolistic המיקוד בOrganotypic פרוסות המוח באמצעות אקדח ג'ין השתנה

מטרת הליך זה היא להעביר או לתייג במהירות וביעילות אזורים מובחנים של פרוסות אורגנוטיפיות באמצעות אקדח גנים. זה מושג על ידי הכנת פרוסות אורגנוטיפיות ברות קיימא של המוח או רקמות אחרות. השלב השני הוא לייצר DNA או חלקיקי זהב מפוענחים לאספקה ביוטית.

לאחר מכן, הפרוסה האורגנוטיפית ממוקמת מתחת לתושבת אקדח גנים מיוצבת והחלקיקים המצופים יורים לתוך הרקמה או טרנספורמציה אפיזומלית או תיוג. השלב האחרון הוא התבוננות או ניתוח ההשפעה של גנים הטרולוגיים המועברים לאזורים המבודדים. בסופו של דבר, גישה זו מאפשרת למשתמש להעביר במדויק אזורים מובחנים של פרוסות האיברים עם גנים הטרולוגיים שונים.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהביולוגיסטיקה מאפשרת לתאים המומיינים באופן טרנספקטי, כמו גם מגבילה את רדיוס הפעולה לקוטר קטן. שיטה זו יכולה לסייע בהבנת שאלות נוירוביולוגיות מרכזיות, כגון הבנת התרומה האזורית של גן בודד. התחל הליך זה על ידי הנחת מוח טרי לתוך תבנית נמען קטנה.

מכסים אותו בתמיסת ARO, שנקראה מעט מעל טמפרטורת החדר. לאחר מכן מצננים במהירות את התבנית לארבע מעלות צלזיוס על ידי הנחתה על קרח. כשהארוס התייצב.

לאחר חמש עד 10 דקות, הסר את המוח המוטבע של aros מהתבנית. לאחר מכן, הדביקו אותו לפלטפורמת פורס הפיברו. לאחר מכן העבירו את הפלטפורמה לתא הפורס Vibra המכיל PBS קר קר כקרח.

לאחר החיתוך, הניחו בעדינות את הפרוסות על תוספות תרבית התאים במגש רב בארות עם שש בארות עם אמצעי תרבית בצד החיצוני של התוספת. דגרו אותם בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. בהליך זה, הכינו את קליעי הננו באמצעות חלקיקי זהב בקוטר 40 ננומטר על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של 0.05 זרע מולארי, ו-10 מיקרוליטר DNA במיליגרם אחד למיליליטר עד 10 מיליגרם של חלקיקי זהב.

לאחר מכן הוסיפו סידן כלורי לתערובת התמיסה כדי לסייע בקשירת מולקולות ה-DNA לננו-חלקיקי הזהב. לאחר מכן, משוך את התמיסה לתוך הצינור בעזרת מזרק. הנח את הצינור בתחנת הכנת הצינורות.

הניחו לחלקיקי הזהב להתייצב. ואז הסר את השכיבה על ידי שאיפה בעזרת מזרק. סובב את הצינור כדי לפזר באופן שווה את חלקיקי הזהב.

לאחר מכן יבש את החלקיקים תחת זרימת חנקן קבועה בחמישה ליטר לדקה. כדי ליצור כדורי DNA, חותכים את הצינור לחתיכות סנטימטר אחד באמצעות חותך צינורות. לאחר מכן הכנס אותם מיד למחסנית שגדלה בגנים או שמור אותם מיובשים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש במכסה זרימה סטרילי של למינה, טען את המחסנית המכילה את הזהב המצופה DNA לתוך מחזיק המחסנית.

לאחר מכן טען את המחזיק לאקדח הגנים. חבר אליו את קנה אקדח הגנים המותאם באמצעות מלקחיים סטריליים. מניחים תוספת פילטר המכילה פרוסה אורגנוטיפית בכלי פלסטיק סטרילי.

הסר את המדיה מהפרוסה האורגנוטיפית. לאחר מכן, הגדר את לחץ הגז על 50 PSI באמצעות התושבת. הנח את אקדח הגנים במרחק של 10 מילימטרים מעל האזור הרצוי של הפרוסה להעברה גנטית.

לאחר מכן כוון בזהירות למרכז הקנה ויורה את החלקיקים המצופים לתוך הרקמה. לאחר ההעברה הביוטית, שטפו את הפרוסה בעדינות פעמיים עם PBS. לאחר מכן תקן את הפרוסה על ידי דגירה ב-4% PFA קר כקרח ב-PBS למשך 20 דקות.

לאחר מכן יש לשטוף את הפרוסה פעמיים ב- PBS. שוב, חותכים בעדינות את הממברנה מהתוספת באמצעות אזמל מבלי להפריע לפרוסה. לאחר מכן הניחו את תמיכת הממברנה על שקופית מיקרוסקופ בעזרת מלקחיים ואפשרו לפרוסה האורגנוטיפית לנוח עליה.

לאחר מכן, הוסף טיפה אחת של מדיית הרכבה על הפרוסה. הנח החלקת כיסוי בעדינות ללא כל כוח במגע ישיר עם הרקמה. לאחר מכן, אבטח את החלקת הכיסוי בשכבה דקה של לכה לציפורניים.

איור זה מראה את האספקה הביוטית של DNA מקודד חלבון פלואורסצנטי לתוך הפרוסה האורגנוטיפית של עכבר בן שישה שבועות. כפי שניתן לראות כאן, נוירון ביקיני עם נמל דנדריטי יוצא דופן שנמצא בממשק של שכבת הביקיני והשכבה המולקולרית של המוח הקטן מראה תיוג בולט לאחר טרנספיקציה ביוטית חולפת עם P-E-G-F-P-N. הנה הגדלה גבוהה יותר של הדנדריטים עם הקוצים, והנה תא פרמטאלי שנמצא באזור האחד של ההיפוקמפוס.

לאחר האספקה הביוטית של ננו-חלקיק זהב מצופה PDS Red FP לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות בלבד במהלך תקופה של שלושה עד ארבעה ימים לאחר הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד נוירונים מסוימים מחוברים לאזורים שכנים.