Name: מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של Wnt5a גורם ציסטות בכליות דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: חקור מודל של מחלת כליות פוליציסטיות בדגי זברה באמצעות knockdown של wnt5a ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקיד הגן ביצירת ציסטות כליות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (DK093625 לLH, וDK069909 וDK047757 לJHL) ו( פרס הצטיינות I01BX000820 לJHL) VA. ברצוננו להודות לד&quot;ר מיכאל חבילת וד&quot;ר Jie הוא באוניברסיטת פנסילבניה דג הזברה Core למתן תמיכה חיונית.

הצהרת אתיקה:: הערה כל ניסויי דג הזברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר לרפואת וירג&#39;יניה מזרח. 1. הכנת Morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב ולסנתז תרגום חסימה (AUG-) וoligonucleotides morpholino אנטי תחושת עיכוב אחוי (Splice-) (MO) לגן של עניין בהתאם להוראות יצרן (איור 1 א). אנא ראה מידע של היצרן בטבלה 1. הערה: MOS נשלחים כמניות lyophilized בבקבוקי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים סטריליים בדרגה גבוהה לבקבוקי הזכוכית מחדש להשעות MOS לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / μl. ודא שoligonucleotide הוא נמס לגמרי. אם כמה שרידים מוצקים, לחמם את הבקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניה על 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות ובקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את פתרון מניות MO ב RT. אין לאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס או -20 °; C בגלל טמפרטורות נמוכות עלולות לגרום לoligonucleotide MO להיקשר לקיר מיכל. למדוד את הריכוז של פתרון המניות באמצעות ספקטרופוטומטר (עיין טבלת 1) בכל פעם שפתרון מניות MO חדש הוא עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון עובד MO ביום ההזרקה על ידי דילול פתרון המניות עם מים סטריליים בדרגה גבוהה למינון הרצוי. הוסף 0.5% פנול-אדום כדי להגיע לריכוז של 0.05%. לדוגמא, כדי להפוך את הפתרון עובד 5 μl עם ריכוז של 15 ng / NL, להוסיף 3 פתרון מניות μl MO ופנול-אדום 0.5 μl 0.5% לרמה של 1.5 μl מים. הערה: עם ריכוז עבודה זו, כל טיפה (500 pl) של הזרקה מכילה 7.5 ננוגרם של MO ושתי טיפות מכילות 15 ng של MO. </li></ol> 2. הכנת מכשירי ההזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית רכישה מראש משכה מחטים (ראה טבלת מס &#39;1 למידע מפורט). לחלופין, למשוך את wi מחט זריקת הכוסth חולץ מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מדחס האוויר ולהתאים את לחץ הגדרה ל -50 psi. הפעל את המקור לנתח מיקרוסקופ אור ומשאבת הזרקת מיקרו פיקו ולהתאים את ההגדרות באופן הבא: החזק את לחץ 20 psi, להוציא לחץ 10 psi, ערך תקופה של טווח 2.5 ו -100 μsec של gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את זכוכית מחט מראש משכה-עם 5 μl של פתרון ההזרקה ולמקם את המחט במצב אנכי עם הקצה כלפי מטה. חכה עד שכל הפתרון מגיע קצה המחט ללא בועות אוויר נראות לעין. מניחים את בעל המחט בעמדה מתאימה בסמוך למיקרוסקופ ולהכניס את מחט הזכוכית לתוך המחזיק. כוון את זווית הזריקה ל -45 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את קצה המחט לעין מתחת למיקרוסקופ, גבוהה מהבמה, ולהתמקד באזור הדק ביותר של הקצה. לשבור את קצה המחט עם פינצטה נקודה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שליט וצינור נימים עם קוטר פנימי של צד מ&quot;מ 0.15 על ידי צד מתחת למיקרוסקופ;להזריק את התמיסה לתוך קצה אחד של צינור הנימים לעשות עמודת נוזל. התאם את זמן השליפה להגיע לכל 17 טיפות לכל עמודת נוזל אורך 1 מ&quot;מ, ולאחר מכן את עוצמת הקול של כל טיפה היא nl 1 (ירידה = π x רדיוס 2 אורך x (/ ספירה (טיפות) נפח של טור נוזלי). הערה: ירידה בקוטר של 0.1 מ&quot;מ נותנת נפח הזרקה של כ -500 pl (ירידת נפח = 4/3 x π x רדיוס 3). </li></ol> 3. הכנת מופרת עוברי דג הזברה והזרקה עם Morpholinos <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את Tg (wt1b: GFP) זוגות רבייה דג הזברה מהונדסים על פי פרוטוקולים שפורסמו לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה. איסוף עובר אחרי שרצים טבעי, ולשמור אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטרים מלאים במי E3 (5 מ&quot;מ NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4). התחל הזרקת MO מייד 13. צג מורפולוגיה עובר מתחת למיקרוסקופ ולעשות הזרקת MO בטוחה היא בחדשלב תא, או לא יאוחרו משלב ארבעה התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם טריז בצורה אגר שקתות. לשאוב המים E3 נוספים ולחץ בעדינות את העוברים לשקתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניפולציות עובר עם micropipette לדמיין עובר שלב 1-תא מתחת למיקרוסקופ לנתח. לחדור סיסית ואז החלמון להזריק טיפה אחת או שתיים של MO בחלמון (הירידה של 1 = 500 pl). מעביר את העוברים הוחדרו לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם מים E3 ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזריקות, להסיר את העוברים המתים ולהקליט את מספר העוברים מוזרקים. החלף את המים E3 בצלחת בכל 24 עד 48 שעות. </li></ol> 4. ניסויי הפנוטיפ הצלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר orthologue ממין אחר שיש לו מבנה זוג בסיס העיקרי שונה (בדרך כלל 3-7 חוסר התאמה זוג בסיס), והוא, לכן, עמיד לMO, להצלה. לדוגמא, בניסוי זה, בחרנועכבר בגלל רצף העכבר Wnt5a mRNA שונה מרצף דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פריימר שנקבע עם פריימר קדימה מתחיל באתר translational ופריימר ההפוכה בסמוך לסוף אזור קידוד mRNA. הוסף רצף אמרגן T7 ב5&#39;- סוף רצף פריימר קדימה. בניסוי זה, השתמשנו ברצפי פריימר הבאים; קדימה: 5&#39;- TAA מיקס GAC TCA תג CTA GGA CTA TGA TGC TGC TGA TGA AGC a- 3 &#39;ולהפוך: 5&#39;- TCA CTT GCA GAC gta CTG gtc- 3&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תגובת 50 μl שרשרת פולימראז (PCR) עם סט פריימר (0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד) נועד לעיל ו0.1 מיקרוגרם תבנית ה- DNA המכיל את רצף עכבר Wnt5a cDNA עם תכנית ה- PCR הבאה: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° C (30 שניות), 58.5 ° C (30 שניות), 72 ° C (1 דקות); וצעד ​​ארכה סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיימתי את tהוא מעגל, לרוץ 2 μl של מוצר ה- PCR על 1% agarose ג&#39;ל כדי לוודא את הלהקה היא בגודל הנכון. לטהר את מוצר ה- PCR עם ערכת טיהור PCR על פי הוראות יצרן. בדוק ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר. אחסן את מוצר ה- PCR מטוהר ב -20 ° C או להשתמש ישירות בשעתוק RNA כתרים בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז במבחנה כתרים mRNA עם ערכת סינתזת RNA כתרים על פי הוראות היצרן. לדלל את mRNA ב -20 מים חופשיים RNase μl ולקבוע את הריכוז. Aliquot RNA ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההזרקה, להכין פתרון עבודה של mRNA עם מים סטריליים חופשיים RNase. שים לב כי 40 pg הוא בדרך כלל מינון RNA הגבוה ביותר שבי השפעות ספציפיות או רעילות של RNA אינן מתרחשות. שמור את הפתרון עובד על קרח. להזריק את העובר עם MO ולאחר מכן mRNA ההצלה, או שיתוף להזריק את שניהם יחד. לדוגמא, אם הריכוז של prepar mRNAed בשלב 4.5 הוא 0.6 מיקרוגרם / μl, להוסיף 0.67 μl של mRNA (0.4 מיקרוגרם) ל4.33 μl של מים חופשיים RNase לעשות ריכוז סופי של 0.08 מיקרוגרם / μl, אז טיפה אחת (500 pl) של כל זריקה מכילה 40 pg של mRNA. הכן MO כמתואר בשלב 3. </li></ol> 5. הכנת עוברים מוזרקים להדמית פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה על 28.5 מעלות CO / N, להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים E3 כדי למנוע melanization, אשר משפיע על תצפית של מבנה כִּליַת רֵאשִׁית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אל תוסיף PTU לפני gastrulation, כי זה משפיע על התפתחות עוברית מוקדמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 48 hpf, dechorionate ידני את העוברים עם פינצטה בסדר. קח תמונות של 48 ו -72 עוברים hpf תחת מיקרוסקופ לנתיחה אור. הערה: ניתן לצלם תמונות אלה ללא הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 10 דקות לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להרדים את העוברים על ידי הצבת אותם לצלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה 160 מיקרוגרם / מיליליטר Tricaine נאגר. חכה למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן באורח קל לגעת בדג הזברה כדי לוודא שהם לא זזים ולכן ההרדמה עובדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העוברים מורדמים, לעגן אותן ב- 3% תאית מתיל ומכוון אותם במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתח (אנא עיינו בטבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למבנה כִּליַת רֵאשִׁית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אנא עיין בטבלת 1) ולצלם בהגדלה שונה (10X ו20X). </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li>
<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מחלת כליות פוליציסטיות (PKD) היא אחד מהגורמים העיקריים למחלת כליות סופנית בבני אדם ומאופיין בהיווצרות מתקדמת ציסטה, הרחבת כליות, ופיתוח אבובית נורמלי 14. PKD אוטוזומלית הדומיננטי (ADPKD) הוא מחלה גנטית שבו מוטציה של שני PKD1, קידוד polycystin-1 (PC1), או PKD2, קידוד polycystin-2 (PC2), תוצאות בכליות פוליציסטיות. גנים רבים אחרים, במיוחד אלה קידוד חלבונים הנמצאים בcilium העיקרי, הם חשבו להיות מעורבים בפיתוח של ציסטות בכליות, ועד כה אין כלי אידיאלי לסינון גנים אלה. אנו מתא...

עוברי דג הזברה (Danio rerio) היו בשימוש נרחב כמודל ללימוד פיתוח כליות ומחלת כליות פוליציסטיות. ישנם יתרונות רבים לשימוש דג הזברה כמודל חיה: את הכדאיות של חקר אינטראקציות גנטיות, את היכולת להשתמש בmorpholinos antisense (MO) למציאת חלבון, הזדמנות assay במהירות מספר גדול של עוברים, ואת הקלות של צפייה פנוטיפים איבר ב חיים זחלים 1. כִּליַת רֵאשִׁית היא הכליה הראשונה לפתח בבעלי חוליות ופונקציונלי בדג הזברה זחל 2. המבנה של דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית בהשוואה פשוט יחסית לmetanephros היונקים, הכליות שלישי ואחרונה להתפתח ביונקים. נפרון הוא יחידת העבודה של הכליות, עם כל כליה אנושית המכילה בין 500,000-1,000,000 nephrons 3,4 וכל כליה עכבר יש כ -13,000 nephrons 5, ולכן קשה להבחין מבנה נפרון יחיד in כליות אדם או לעכבר. יש דג הזברה רק שני nephrons, וכל נפרון דג הזברה מכיל את כל הרכיבים העיקריים נמצאים בglomerulus והצינוריות של עכברים ובני אדם 6 וסוגי תאים דומים מתמחים כליות. בהשוואה לדגמי חוליות אחרות כגון Xenopus, נפרון דג הזברה דומה יותר נפרון היונקים כי יש לו מערכת סגורה 7. בשנים האחרונות, הגנום דג הזברה כבר רצף, המאפשר היכרות הרחבה של כלים גנטיים, מוטציה משאבים נרחבים, ואוספים של קווי כתב מהונדסים בדגמי דג הזברה. כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה הצורות בין 12-72 לאחר שעה ההפריה (hpf) וניתן דמיינו בקלות בעוברים השקופים. חלבון הגידול של וילם WT1 הוא גורם חיוני להתפתחות כליות. קווי דג הזברה מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן wt1b Tg (wt1b: GFP) להראות expre GFPssion ממוקם דווקא באזורי pronephric בעוברי דג הזברה, החל מ -17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), מחלת כליות פיברוזיס אוטוזומלית רצסיבית, נגרמת על ידי מוטציות של גני NPHP 9. NPHP4 מציאה על ידי morpholino גרם היווצרות ציסטה בTg (wt1b: GFP). דגי 10 לכן, דג מהונדס זה הוא מודל מתאים להתבוננות מבני כליות והיווצרות ציסטה במהלך התפתחות כליות. חשוב לציין, את ההשפעה של מאפננים של פיתוח כליות ניתן ללמוד באמצעות זן זה בזמן ובאופן יעיל עבודה. העיתון שלנו מתאר את השימוש בTg (wt1b: GFP) דגים כמודל לדמיין היווצרות ציסטה בכליות לאחר אפנון הגן. אנחנו השתמשנו נגד תחושה-אתר שחבור ההתחלה וMOS להפיל את גן wnt5a בדג זברה. Wnt5a הוא גליקופרוטאין מופרש הלא קנוניה של משפחת Wnt שממלא תפקיד חשוב בהתפתחות איברים ולאחר לידה סלולרית שוניםפונקציה 11. Wnt5a עובד דרך מסלולי Wnt הלא קנוניות, כוללים מסלול קוטבי תא מישוריים (PCP), שכבר נמצא לשחק תפקיד בחלוקת תא אוריינטציה במהלך התארכות צינורי כליות. Wnt5a מסדיר את המסלול / PCP Wnt על ​​ידי יצירה מורכבת עם קולטן כמו טירוזין קינאז (ריק), אשר transduces איתות Wnt5a נוסף על ידי יצירה מורכבת עם חלבוני VANGL קוטביות תא מישוריים 2 (Vangl2), ובכך לקדם יציבות Vangl2 12. פגמים במסלול PCP יכולים לגרום לחלוקת תא אקראית ולגרום להיווצרות ציסטה בכליה. אנחנו השתמשנו Tg (wt1b: GFP) קו דג הזברה להתבונן היווצרות ציסטה בכליות הבאות מציאה wnt5a. Tg (wt1b: GFP) מודל דג הזברה מאפשר הדמיה חיה ותצפית בזמן של מבנה כליות. לאחר מציאה wnt5a, היווצרות ציסטה בכליות נמצאה מתחילה ב 24 hpf; בגיל 72 hpf, ניתן היו למצוא ציסטות בglomeruli וtubules הפרוקסימלי. שיטה זו יכולה לשמש גם ליםקרין גנים אחרים שעלולים לגרום להיווצרות ציסטה בכליות.

<table><tbody><tr><td>0.5% פנול-אדום</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>מחוון צבע להזרקה</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(מותאם אישית)</td> <td>מותאם אישית מעוצב לגן המעניין</td></tr><tr><td>מחט נמשכת מראש</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>אם נדרשת כמות גדולה של מחט, אתה יכול גם לרכוש מושך מחט ולהכין את המחט במעבדה</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>לשעתוק במבחנה להכנת mRNA מכוסה לניסוי הצלה</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>למניעת מלניזציה</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>נקרא גם אתיל 3-אמינובנזואט, להרדמת דג הזברה</td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>סיגמא</td><td>M-0387</td><td>למיקום דג הזברה&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>לטיהור מוצר PCR לסינתזת RNA של כובע.</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>תג DNA פולימראז</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>למדידת מורפולינו וריכוז RNA</td></tr><tr><td>מדחס אוויר</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>מקור אוויר להזרקה</td></tr><tr><td>משאבת מיקרו הזרקה Pico</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>ניתן להשתמש בסוגים אחרים של מערכת מיקרו-הזרקה.</td></tr><tr><td>מיקרו-manuplator</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>ימני (MMJL לשמאליים)</td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>להחזיק מחט למיקרומניפולציה</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Dumont Fine Surgical Tools</td><td>11253-20</td><td>לשבירת קצה המחט</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>לתצפית והדמיה של עוברי דג הזברה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>להדמיית דג הזברה pronephros</td></tr><tr><td>צינור נימי (מזהה 0.15 מ"מ)</td> <td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>למדידת הנפח של כל טיפה מוזרקת</td></tr></tbody></table>

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של wnt5a גורם ציסטות בכליות דג הזברה

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

מחלת כליות פוליציסטית (PKD) היא אחד הגורמים השכיחים ביותר למחלת כליות סופנית, מחלה הרסנית שאין לה תרופה. המנגנונים המולקולריים המובילים להיווצרות ציסטות ב-PKD נותרו מעט לא ברורים, אך נחשבים גנים רבים מעורבים. Wnt5a הוא גליקופרוטאין לא קנוני המווסת מגוון רחב של תהליכי התפתחות. Wnt5a פועל דרך מסלול קוטביות התאים המישוריים (PCP) המווסת את חלוקת התאים המכוונת במהלך התארכות תאים צינוריים בכליות. פגמים במסלול ה-PCP נמצאו כגורמים להיווצרות ציסטה בכליות. המאמר שלנו מתאר שיטה לפיתוח מודל מחלת כליות ציסטית של דג הזברה על ידי הפלת הגן wnt5a עם אוליגונוקלאוטידים של wnt5a antisense morpholino (MO). דגי זברה טרנסגניים Tg(wt1b:GFP) שימשו להדמיית מבנה הכליות וציסטות בכליות לאחר נוקדאון wnt5a. נעשה שימוש בשני MOs אנטי-סנס נפרדים (AUG - ו-splice-site) ושניהם הביאו לפנוטיפ זנב מתולתל והיווצרות ציסטה לאחר נוקדאון wnt5a. הזרקת mRNA Wnt5a של עכבר, עמיד ל-MOs עקב הבדל במבנה זוג הבסיסים הראשוני, הצילה את הפנוטיפ החריג, והוכיחה שהפנוטיפ לא נבע מהשפעות "מחוץ למטרה" של המורפולינו. עבודה זו תומכת בתוקף השימוש במודל דג זברה לחקר תפקוד wnt5a בכליה.

Wnt5a להפיל הושג על ידי החדרת תרגום חסימת MO (אוגוסט-MO) או אחוי גבול אקסון / אינטרון MO (אחוי-MO) לעוברי דג הזברה בשלב תא אחד. האוג-MO מטרות קודון ההתחלה, ולכן, מעכב שניהם הודעת wnt5a האימהית וzygotic. אחוי-MO מטרות אתר תורם אחוי השלישי ומעכב את תמליל zygotic רק של wnt5a (איור 1 א). AUG- וmorphants splice- phenocopied אחד את השני עם מומים מרובים, כוללים ציר מתולתל זנב למטה גוף ובצקת קרום הלב (איור 1). עכבר Wnt5a mRNA חלקית מציל ...

אנו מתארים שיטה ליצירת מודל אפשרי של דג זברה למחלת כליות פוליציסטית. השתמשנו בדגי Tg(wt1b:GFP) כדי לדמיין את מבנה הכליות. הפלה של wnt5a הייתה על ידי הזרקת מורפולינו. היווצרות ציסטה פרונפרית לאחר נוקדאון wnt5a נצפתה בדג הזברה הטרנסגני GFP הזה.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של Wnt5a גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מודל אפשרי של דג זברה למחלת כליות פוליציסטית. זה מושג על ידי הזרקת מורף כנגד רוח חמש A בעוברי דג זברה טרנסגני WT אחד BGFP בשלב התא האחד. לאחר מכן, ניסוי הצלה מבוצע על ידי הזרקת מיקרו של עכבר Wint five A Mr.Nna, כאשר ה-Wint 5 הוא מורפו.לאחר מכן העוברים המוזרקים מורדמים ומוטמעים 48 ו-72 שעות לאחר ההפריה על מנת לעקוב אחר מבנה הכליות והיווצרות הציסטה. לאחר נוקדאון רוח חמש A, התוצאות מראות כי רוח חמש A נוקדאון גורם להיווצרות ציסטה בכליות ב- WT טרנסגני דג זברה אחד BG FP המבוסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מבני כליות מועדים. ההשלכות של טכניקה זו מתרחבות לבניית מודל של מחלת כליות מכיוון שהשקיפות של תסחיף הדגים המכוסה בשימוש בחלבון פלואור ספציפי לכליה מאפשרת מבט ישיר על מבני הכליות באורגניזם AL.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ניצחון חמש נוקדאון הגורם להיווצרות ציסטה בכליות של דגי זברה. ניתן ליישם אותו גם לבדיקת גנים רבים אחרים החשודים כגורמים להיווצרות ציסטה בכליות. פרוטוקול זה פשוט וגוזל פחות זמן.לאחר תכנון וסינתזה של מורפוסים בהתאם להוראות היצרן, הוסיפו מים סטריליים בדרגה גבוהה לבקבוקי הזכוכית כדי להשעות ביסודיות לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם למיקרוליטר. השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הריכוז ולאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר ביום ההזרקה, השתמש במים סטריליים בדרגה גבוהה כדי לדלל את המורפוס לריכוז הרצוי, וב-0.5% פנול אדום לריכוז סופי של 0.05%לאחר מכן הפעל את מדחס האוויר והתאם את הגדרת הלחץ ל-50 si. לאחר מכן הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ המנתח ואת משאבת הזרקת המיקרו פיקו והתאם את ההגדרות באופן הבא.השתמש בחמישה מיקרוליטר של תמיסת הזרקה כדי לטעון מחט זכוכית שנמשכה מראש והנח את המחט במצב אנכי עם קצה הפונה כלפי מטה כאשר אין בועות אוויר גלויות, הכנס את המחט למחזיק. כוונן את זווית ההזרקה ל-45 מעלות. הביאו את קצה המחט לעין מתחת למיקרוסקופ, גבוה מהבמה, והתמקדו באזור הדק ביותר של הקצה.לאחר מכן השתמש בפינצטה עדינה כדי לנתק את המחט. טיפ, הניחו צינור נימי בקוטר פנימי של 0.15 מילימטרים מתחת למיקרוסקופ. הזרקו את התמיסה לקצה אחד.התאמת זמן הפליטה במשאבת המיקרו-הזרקה של פיקו עד ש -17 טיפות יוצרות עמוד נוזלי באורך מילימטר אחד. זה הופך את הנפח של כל טיפה לננוליטר אחד. הגדר זוגות גידול דגי זברה טרנסגניים WT אחד BG FP על פי פרוטוקולים שפורסמו לגידול ותחזוקה סטנדרטיים של דגי זברה.לאחר השרצה טבעית, אספו עוברים והעבירו אותם לצלחת פטרי עם E שלושה מים. בעזרת העוברים בין שלב התא האחד לארבעה, העבירו אותם לצלחת פטרי של 10 סנטימטר עם שקתות מקדחה בצורת טריז. לאחר שאיבת המדיום לחץ בעדינות את העוברים לתוך השקתות מתחת למיקרוסקופ הניתוח, כוון את העוברים כדי לדמיין את התא.ואז בעזרת מחט ההזרקה חודרים לקוריאן ואז לחלמון כדי להזריק טיפה אחת או שתיים של מורפו לחלמון. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי של 10 סנטימטר עם E שלושה מים ודוגרים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. רשום את מספר העוברים המוזרקים ברי קיימא לביצוע ניסוי הצלה פנוטיפי.בחר אורתולוג מגן של מין אחר שיש לו מבנה זוג בסיסים ראשוני שונה ולכן עמיד למורפו. בדוגמה זו, העכבר הלך חמש נבחר A. תכנן ערכת פריימר עם הפריימר הקדמי המתחיל באתר ההתחלה התרגומי והפריימר ההפוך קרוב לסוף אזור הקוד MR NA.הוסף רצף מקדם T שבע בקצה החמישי של רצף הפריימר הקדמי עם הפריימרים ומיקרוגרם אחד של DNA תבנית המכיל את רוח העכבר. חמישה רצפי A-C-D-N-A. הגדר תגובת PCR של 50 מיקרוליטר והפעל באמצעות התוכנית המוצגת כאן.לאחר אימות גודל תוצר ה-PCR, טיהורו ובדיקת הריכוז, השתמש בערכת סינתזת RNA מכוסה כדי לסנתז mRNA מכוסה במבחנה. על פי הוראות היצרן, השתמש ב-20 מיקרוליטר של מים ללא RNA כדי לדלל את ה-MR NA ולקבוע את הריכוז ולאחסן את ה-RNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ביום ההזרקה. הכן תמיסת עבודה של MR NA שתספק מינון של 40 פיקוגרם או פחות כדי למנוע השפעות לא ספציפיות או רעילות על העובר.שמירה על תמיסת ה-MNA על קרח מזריקים מורפוזות ולאחר מכן mRNA לעוברים או מזריקים את התמיסות. למחרת, הוציאו עוברים מתים ובדקו שהעוברים עברו גזים. לאחר מכן הוסף 0.003% סוף פניל THREA או PTU למי E שלוש כדי למנוע מלון ב-48 שעות לאחר ההפריה.השתמש בפינצטה עדינה כדי לצפות את העוברים באופן ידני לפני השימוש במיקרוסקופ חיתוך כדי לצלם תמונות מיד ו-72 שעות לאחר ההפריה כ-10 דקות לפני ההדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הרדם את העוברים על ידי הנחתם בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה 160 מיקרוגרם למיקרוליטר של טריקה חוצצת. השתמש ב-3% מתיל צלולוז כדי להרכיב את העוברים ותחת מיקרוסקופ מנתח, כוון אותם במצב שכיבה. לאחר מכן שימוש בתמונת הגדלה פי 10 ופי 20.העוברים תחת רוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי חמש נוקדאון הושג על ידי הכנסת מורפו חוסם תרגום, הנקרא גם מורפו UG או מורפו חיבור גבול אקסון, הנקרא גם מורפו אחוי לעוברי דג הזברה. בשלב התא האחד, מורפו A UG מכוון לקודון ההתחלה ולכן מעכב הן את הניצחון האימהי והן את הביטוי הזיגוטי. צורת החיבור מכוונת לאתר תורם החיבור השלישי ומעכבת רק את התעתיק הזיגוטי של זכייה בחמש A כפי שמודגם כאן, ה-A UG ו-splice morphines pheno העתיקו זה את זה עם פגמים מרובים כולל זנב מתולתל, ציר הגוף למטה ובצקת קרום הלב.איור זה מראה שעכבר עבר חמש mRNA מציל חלקית את פנוטיפ המורף, ומדגים שזה לא נובע מהשפעות מחוץ למטרה המוצגות כאן. דג ה-WT הטרנסגני אחד BGFP מבטא GFP המונע על ידי מקדם WT one B ומתאר את המבנה המקצועי. הדג הראה היווצרות ציסטה גלומרולרית לאחר הרוח חמש נוקדאון 48 שעות לאחר ההפריה.דגי הביקורת שהוזרקו רק עם פנול אדום הראו התפתחות פרי נוטה נורמלית ליצירת גלומרולרי מאוחה בצורת U עם צינוריות הנמשכות לרוחב 72 שעות לאחר ההפריה. המבנים הגלומרולרים התפתחו עוד יותר עם לולאות כלי דם וגם העוברים המוזרקים A UG ו-splice morph פיתחו ציסטות בגלומרולי ובצינורות הפרוקסימליים כפי שניתן לראות באיור זה צביעת HNE של החתכים ההיסטולוגיים הרוחביים של 72 שעות לאחר ההפריה, עוברים מוראנטים חשפו היווצרות ציסטות, מבנים גלומרולרים משובשים וצינורות כליה מורחבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח מודל שלב גרי אפשרי של מחלת כליות ציסטית על ידי הפלת הזדקנות הרוח ולצפות בהיווצרות המערכת עם קו הפנים של דוח השפעת.לאחר שהוכח כי מוטציה גנטית גורמת להיווצרות ציסטה בכליות בדג הזברה, ניתן לערוך ניסויים נוספים כדי לחקור את המנגנונים המפורטים של היווצרות ציסטה בכליות.

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.

ניתוח התנהגותי ופיזיולוגי במודל דגי זברה של אפילפסיה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

חקור מודל של מחלת כליות פוליציסטיות בדגי זברה באמצעות knockdown של wnt5a ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקיד הגן ביצירת ציסטות כליות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של Wnt5a גורם ציסטות בכליות דג הזברה

גלה סרטונים נוספים