Name: ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למד כיצד לייצר ולהשתמש בלנטיוירוס לטרנסדוקציה סלקטיבית של תאי OPC מבשר לצורך מחקר מיאלינציה במבחנה. שיטה זו מאפשרת ביטוי יתר של חלבונים וניתוח תפקודם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי באוסטרליה (מלגת NHMRC #454330 ל-JX, מענק פרויקט #628761 ל-SM ו-APP1058647 ל-JX), מחקר טרשת נפוצה באוסטרליה (MSRA #12070 ל-JX), תוכנית התמיכה במענקי מחקר של אוניברסיטת מלבורן ומלגת CI למחקר מלבורן ל-JX וכן מלגות לתואר שני באוסטרליה ל-HP ו-AF. ברצוננו להכיר בתוכנית התשתית התפעולית של המחלקה לחדשנות, תעשייה ופיתוח אזורי, ויקטוריה אוסטרליה.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים בנוגע למחקר זה.

Myelination של אקסונים הוא תהליך חיוני לתפקוד האופטימלי של שני מערכות עצבים המרכזיות והיקפיות של בעלי חוליות. הייצור והתחזוקה של אקסונים myelinated הוא תהליך מורכב ומתואם מעורבים אינטראקציות מולקולריות בין תאי עצב, גליה (מתאי שוואן או oligodendrocytes) וחלבוני מטריצה ​​סלולריים נוספים. המשמעות ותחולתה של פרוטוקול זה היא שהיא מאפשרת מניפולציה של חלבונים בתאים מסוג ספציפי אחד בתוך הגדרות שיתוף התרבות המעורבות. כמספר סוגים של תאים מעורבים בmyelination שני in vivo ובמבחנת ass...

Myelination של אקסונים הוא חיוני להעברה מהירה ויעילה של פוטנציאל פעולה בשתי מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות. תאים מיוחדים, תאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית וoligodendrocytes במערכת העצבים המרכזית, לעטוף וensheathe האקסונים במיאלין, ביעילות בידוד העצב והקלת הולכה קופצנית 1. תהליך היווצרות של מעטפת המיאלין ניתן ללמוד במבחנה באמצעות נוירונים ברשתית גנגליון 2, nanofibers המהונדס 3, או נוירונים גנגליון שורש הגבי שיתוף תרבותי עם שני תאי שוואן 4 או oligodendrocytes 5-7. Assay myelination במבחנה הוא מודל הוקם לחקר myelination מערכת עצבים וזה משכפל רב של התהליכים הבסיסיים המתרחשים במהלך myelination in vivo 5-8. Assay כרוך coculture של אוכלוסיות מטוהרים של הגבי שורש גנגליון (DRG) נוירונים, עם OPCs (לגmyelination NS) או בתאי שוואן (לmyelination PNS). בתנאים מסוימים תאי myelinating אלה ensheathe אקסונים DRG במאומת מבני גיליון הורה, אולטרה, רב-שבשבת של בידוד קרום פלזמה המבטא את אותו משלים של חלבונים ספציפיים המיאלין הנוכחיים in vivo. מודל התא הנפוץ ביותר של לימוד myelination CNS במבחנה הוא שיתוף התרבויות של נוירונים DRG וOPCs, אשר שימשו בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה שגורמים אקסוגניים כגון neurotrophins להפעיל על myelination CNS במבחנה 5,6. גורמים אקסוגניים כגון גורמי גדילה או מעכבים תרופתיים מולקולה קטן היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את התפקיד של מסלולי איתות בmyelination באמצעות 7,9 מודל coculture DRG-OPC. עם זאת, בהגדרות שיתוף התרבות המעורבות המכילות שני תאי העצב וoligodendrocytes, הוא נשאר באופן רשמי ייתכן שגם גורמי גדילה או pharמעכבי macological יכלו הפעילו השפעות על שני נוירונים DRG וoligodendrocytes (OL). זה עושה מציע את היכולת לנתח באופן ספציפי התפקידים שהחלבונים לידי ביטוי רק על ידי DRGs או oligodendroglia מפעיל על myelination באמצעות מערכת תא הכפולה הזה. כדי לאשר באופן חד משמעי כי מסלול האיתות בoligodendroglial ישירות מסדיר myelination, התמרה lentiviral של OPCs, לפני זריעה על נוירונים DRG לassay myelination במבחנה, הוכיח להיות דרך אלגנטית לביטוי יתר שני wild-type וחלבוני מוטציה, כמו גם כביטוי מציאה של חלבונים הביעו constitutively ידי oligodendrocytes. כך גישה זו מציעה שדרת לחקור באופן ספציפי ולטפל מסלולי איתות תוך oligodendrocytes ללימוד myelination 9,10. במאמר זה, אנו מדווחים שיטות שפיתחנו לביטוי יתר של חלבון של עניין באופן סלקטיבי בoligodendrocytes באמצעות lentiviralגישה ללימוד myelination במבחנה. הטכניקה מתחילה עם הדור של וקטורי ביטוי המכילים את הגן של עניין, יהיה זה בסוג בר, צורה שלילית פעילה constitutively או דומיננטית אשר לאחר מכן משובטות לאחר מכן לתוך וקטור pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). וקטור זה (המכיל את הגן של עניין), תורם promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) וlentivector 2K7 משולבים בתגובת אנזים לייצר וקטור 2K7 מכיל אמרגן CMV, הגן של עניין, אתר פנימי ריבוזומלי כניסה וGFP (איור 1). מבנה זה Gateway המשובט 2K7 בשילוב עם מעטפת וירוס PMD2.G וחבילת וירוס pBR8.91 יכול להיות שותף transfected לתאי HEK293T ליצור lentivirus שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי transduce OPCs. ברגע שנדבק בlentivirus OPCs להביע רמה גבוהה של החלבון של עניין. אז יכול להיות שנזרע OPCs אלה על תרבויות נוירון DRG ועל ההשפעה שביטוירמות גבוהות של החלבון הרצוי מפעילה על myelination יכול להיחקר. שיתוף התרבויות מוערכות לביטוי חלבון המיאלין על ידי ניתוח כתם מערבי ומדמיינות ליצירת מגזרי axonal myelinated ידי immunocytochemistry.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentivector&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מתנה אדיבה מד"ר סוטר9</sup</td></tr><tr><td>>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עז נגד עכבר IgG (H+L)</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>: A11005</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 594, עיזים נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td>, <td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 תוסף עצבי</td><td>טכנולוגיות תאי גזע&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (אנושי)</td><td>פפרוטק</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין (d-ביוטין)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO מדיית הרכבה פלואורסנטית</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, סידן, מגנזיום</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>וקטורי כניסה למקדם וגן מעניין</td><td></td><td></td><td>צור לפי פרוטוקולים 1-2</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז (D-גלוקוז)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>אספקת כימיה</td><td>GL010-500M</td><td>ראה פתרונות מלאי</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>ראה פתרונות מלאי</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>ראה פתרונות מלאי</td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium Life Technologies של לייבוביץ</td><td></td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין - 200 מ"מ (פי 100) נוזלי</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus אנזים</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, ללא Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>עכבר ואלפא; ובטא; III טובולין&nbsp;</td><td>עכבר Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>ואלפא; MBP (חד שבטי)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvate&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal בינוני</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (עכבר)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן O1 - עכבר נגד O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>חלופה אם תאי היברידומה O1 אינם זמינים</td></tr><tr>תאי <td></td><td></td><td>היברידומה O1</td><td>מדיום מותנה המכיל נוגדן נגד O1 שישמש לחיסון</td></tr><tr><td>נוגדן O4 - עכבר אנטי-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>חלופה אם תאי היברידומה O4 אינם זמינים</td></tr><tr><td>תאי</td><td></td> <td>היברידומה O4</td><td>מדיום מותנה המכיל נוגדן נגד O4 שישמש לחיסון</td></tr><tr><td>תאים מוכשרים</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl תאים מוכשרים</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>תרחיף פפאין</td><td>וורת'ינגטון/קופר</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>מתנה אדיבה מד"ר דנהאם10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (אנושי)</td><td>פפרוטק</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פתרון פניצילין-סטרפטומיצין 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>408727-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>טבליה מעכב פרוטאז (מיני שלם)</td> <td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>מסופק עם אנזים קלונאז</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>ארנב ואלפא; נוירופילמנט</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ארנב ואלפא; MBP (פוליקלונלי)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 תאי היברידומה</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>מדיום מותנה המכיל נוגדן נגד Ran2 שישמש לחיסון</td></tr><tr><td>נוגדן נגד חולדה CD140A/PDGFRa BD</td><td>Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC מדיום</td><td></td><td></td><td>מסופק עם חיידקים</td></tr> <tr><td>מוכשריםנתרן סלניט&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH8</td><td></td><td></td><td>ראה פתרונות מלאי</td></tr><tr><td>TNE lysis buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>יסודות קורט B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>טרנספרין (אפו-טרנספרין אנושי)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מחלבון ביצת עוף</td><td>רוש</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום (0.05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>גריפוניה לא מצומד לקטין BSL-1</td><td>מעבדות וקטור&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>אורידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור ושימוש בlentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination הוא תהליך מורכב שכרוכים בשני תאי עצב ותאי גליה המיאלין יוצרים, oligodendrocytes במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (PNS). אנו משתמשים במבחנה assay myelination, מודל שנקבע ללימוד myelination CNS במבחנה. כדי לעשות זאת, תאי מבשר oligodendrocyte (OPCs) מתווספים לנוירונים המטוהרים גנגליון שורש הגבי מכרסם העיקרי (DRG) כדי ליצור שיתוף תרבויות myelinating. על מנת לחקור את אופן ספציפי התפקידים שחלבונים מסוימים שהביעו oligodendrocytes מפעילים על myelination פיתחנו פרוטוקולים שסלקטיבי transduce OPCs באמצעות lentivirus ביתר סוג בר, חלבונים שליליים פעילים constitutively או דומיננטיים לפני שזורע על נוירונים DRG. זה מאפשר לנו לחקור את אופן ספציפי את התפקידים של חלבוני oligodendroglial אלה בויסות myelination. יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים במחקר של otסוגי תאיה, ובכך לספק גישה המאפשרת מניפולציה סלקטיבית של חלבונים לידי ביטוי בסוג תא רצוי, כגון oligodendrocytes למחקר הממוקד של איתות ומנגנוני פיצוי. לסיכום, שילוב של assay myelination במבחנה עם OPCs lentiviral נגוע מספק כלי אסטרטגי לניתוח של מנגנונים מולקולריים המעורבים בmyelination.

מתויג הדגל תאי kinase 1 (Flag-Erk1) הקשורים לאות בונה הלמשמש לייצור lentivirus מאומת על ידי הגבלת אנזים עיכול של המבנים המשמשים, ביניהם שני מבני 2K7 ובונת האריזה ואבזר הנדרשת לייצור וירוס (איור 3) . <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> איור 3: אימות מבנה ה- DNA. כל מבני DNA הנדרשים לייצור lentivirus היו מטו...

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתפעל באופן ויראלי, תאי מבשר אוליגודנדרוציטים או OPCs כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים. עבור מחקר במבחנה של אומת המיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית, זה מושג על ידי שיבוט ראשון של וקטור לנטי-ויראלי. השלבים הבאים הם לייצר את ה-lentivirus ולקבוע את הריכוז הנגיפי האופטימלי לניסוי.לאחר מכן OPCs מנותחים ומתורבתים מועברים עם ה-lentivirus. השלב האחרון הוא לזרוע את ה-OPCs המומרים על נוירונים מתורבתים שנותחו מה-DRG. בסופו של דבר, תרביות המיאלין מוערכות לביטוי חלבון מיאלין על ידי ניתוח כתמים מערביים ומומחשות להיווצרות מקטעים אקסונליים מיאליניים על ידי צביעה חיסונית.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כלים פרמקולוגיים, הוא שהגישה הלנטי-ויראלית מאפשרת לנו לבטא יתר באופן סלקטיבי חלבונים מסוג פרא או מוטנטי בסוג התא הרצוי שלנו, כמו במקרה זה, אוליגודנדרוציטים בהכנה לשכפל את ה-2K שבעה וקטורים מושאלים הנדרשים כמתואר בפרוטוקול הטקסט בבוקר יום הטרנספקציה, להכין 32 מיליון תאי HEK 2 93 T בבקבוק T 1 75 המכיל 25 מיליליטר מדיה. באופן קריטי, יש לתקוע את התאים הללו לפני הטרנספקציה, אז יש להניח אותם מוקדם יותר במידת הצורך. בשפופרת פלקון של 50 מיליליטר, הכינו תערובת מאסטר להעברת בקבוק T 1 75 כמפורט בטבלה הראשונה, הוסיפו DNA למערבולת DMEM חמה, ולאחר מכן הוסיפו PEI סטרילי אחרון כדי למנוע משקעים מוקדמים.מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור שלוש או ארבע פעמים, ואז מדגרים את התערובת כ -15 דקות על הספסל. שנה את המדיה על התאים ולאחר מכן הוסף את תערובת הטרנספקציה. DROPWISE מערבבים בעדינות את המדיה על התאים ולאחר מכן דוגרים על התאים למשך הלילה.למחרת. ניתן לבדוק את ביטוי GFP על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את האצווה הראשונה של סופרנטנט ויראלי והוסיפו 25 מיליליטר של מדיה טרייה לתאים.צנטריפוגה הסופרנטנט הנגיפי ב-1, 140 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט הנגיפי ללא כדור פסולת התא לצינור חדש ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, 72 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את האצווה האחרונה של צנטריפוגת העל הנגיפית כדי להסיר את פסולת התא ולאגד עם המנה הראשונה של סופרנטנט ויראלי שסולק.לאחר מכן רכזו את הנגיף על ידי צנטריפוגה אולטרה של הסופרנטנט הנגיפי ב-170,000 גרם למשך 90 דקות. בארבע מעלות צלזיוס. פרקו את האולטרה צנטריפוגה ושפכו את הסופרנטנט, והשאירו חיך של PEI משקע והנגיף, שאינו נראה בתחתית צינור ה-30 מיליליטר.חזור על תהליך זה. צנטריפוגה של כל הסופרנט הנגיפי בקבוצות באותם צינורות של 30 מיליליטר כדי לרכז את הנגיף כדי להשעות מחדש את הנגיף בכל צינור אולטרה-צנטריפוגה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה סאטו וכסה את הצינור בסרט.לאחר מכן מערבל את הצינור למשך 30 שניות ועקור מכנית את הגלולה בעזרת קצה פיפטה. חזור על מחזור זה של מערבולת שנעקרה כשש פעמים כדי להבטיח שהגלולה תלויה במלואה במדיה סאטו. עכשיו אסוף את כל הנגיף המושעה בסאטו במיקרו צינור טרי.סובב לזמן קצר את הסופרנטנט המאוגד במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. כדי לגלול את ה-PEI, אסוף את הסופרנטנט המכיל את הנגיף וסנן על ידי העברת התמיסה דרך מסנן 0.45 מיקרון באמצעות מזרק לעטיפה. יש לצרף את הנגיף המטוהר בסדיה לנפחים של 2050 ו-100 מיקרוליטר ולאחסן את כולם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.עבור פרוטוקול זה, יש תאי מבשר אוליגודנדרוציטים ראשוניים. OPCs שגודלו בצלחות של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר סדיה המכילים את גורמי הגדילה הבאים, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT שלוש, ועבור התאים חייבים להיות מתורבתים במשך 24 שעות תחת 8% פחמן דו חמצני. התחל בשאיבת המדיה והסר אותה לחלוטין.לאחר מכן החלף אותו ב -10 מיליליטר מאותה מדיה עם גורמי הגדילה. הדביקו את ה-OPCs שלכם ב-lentivirus, ובטאו את החלבון המעניין על ידי הוספת הנפח הנדרש של הנגיף למדיה. כמו כן, בצלחת OPC נפרדת, ערבבו את וירוס הבקרה המבטא רק GFP לתוך תרבית המדיה, התאים למשך 48 שעות נוספות.לאחר מכן אספו את ה-OPCs מהצלחות לזריעה על תאי העצב של GRG המתורבתים. ראשית יש לשטוף כל צלחת בשמונה מיליליטר EBSS פעמיים. הרכיבו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA 0.05% עם תשעה מיליליטר EBSS חם.הוסף חמישה מיליליטר מהטריפסין המדולל לכל צלחת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד שתי דקות. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 30% FBS ב- EBSS.ואז באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר. שטפו את ה-OPCs ממשטח הצלחת. סובב את הצלחת ברבע סיבוב בכל פעם כדי לאסוף את כל התאים.העבר את מתלה התאים לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב -180 Gs.כעת שואבים את הסופרנטנט והחייאה. השעו את כדור התא במיליליטר של מצע סאדו חם ללא גורמי גדילה וספרו את התאים.לאחר מכן, הכינו את תאי העצב DRG שמתורבתים על החלקות הכיסוי של 22 מילימטר על ידי שאיבת המדיה לחלוטין מהצלחת שלהם. לאחר מכן זרע בעדינות 200,000 OPCs טיפה לכל החלקת כיסוי. נפח הזריעה חייב להיות פחות מ -200 מיקרוליטר לכל החלקת כיסוי.תנו לתאים להתיישב מבלי להזיז את הצלחת לאחר 10 דקות, מעל כל באר מיליליטר חם. עכשיו שחק שוב את שאר ה-OPCs האחיות. עם גורמים המכילים גורמי גדילה, ניתן להשתמש בהם מאוחר יותר כדי לאמת את ביטוי החלבון המעניין.דגל המתויג קינאז הקשור לאות חוץ-תאי. מבנה אחד שימש להגבלת ייצור נגיף הלנטי אנזימים שימשו לאימות מבנה האריזה ומבנה האביזר כדי לקבוע את דילול הנגיף האופטימלי לשימוש ב-OPCs. נגיף ה-IR 1 עבר טיטרציה בתאי HEK 2 93 T בטווח של דילול ויראלי לתאי HEK 2 93 T.רמות הביטוי של הגן המעניין עלו עם הזמן. לאחר מכן, OPCs מטוהרים נדבקו ותרבו במשך יומיים לפחות כדי להבטיח ביטוי טרנסגנים. רמות FLAG ו-GFP אושרו ב-OPCs אחיות.לאחר מכן הושבו ה-OPCs על נוירונים של DRG. לאחר מכן ה-OPCs התמיינו לאוליגודנדרוציטים, וכפי שהוערך על ידי המערבונים, הם החלו לבטא חלבוני מיאלין. כמה אוליגודנדרוציטים בוגרים שעברו מיאלין, אשר הודגמו על ידי אקסונים מצביעים MBP, נצבעו על ידי נוירופילמנט או בטא שלוש טובולין כדי להבטיח שצפיפות האקסונים נלקחה בחשבון.כאשר מנתחים את רמות המיאלינציה לאחר זריעת ה-OPCs, חשוב לתרבית. הנגמ"שים האחיות. בדרך זו, החלבון המעניין או התג על החלבון המבוקש, ניתן לאמת את הביטוי הזה ב-APCs האחיות אם לא ניתן לאמת אותו בתרבית המשותפת.

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

הסרטון מדגים פרוטוקול להבחנה של תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) לאוליגודנדרוציטים וגרימת מיאלינציה בתרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG). ה-OPCs מומרים עם וקטורים לנטי-ויראליים המקודדים חלבון איתות המווסת את המיאלינציה. ה-OPCs המומרים מתורבתים יחד עם נוירוני DRG כדי להעריך את ההתמיינות לאוליגודנדרוציטים ואת המיאלינציה הנגרמת על ידי חלבון איתות.

בדיקת מיאלינציה הנגרמת על ידי התמרה חוץ גופית עבור תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

למד כיצד לייצר ולהשתמש בלנטיוירוס לטרנסדוקציה סלקטיבית של תאי OPC מבשר לצורך מחקר מיאלינציה במבחנה. שיטה זו מאפשרת ביטוי יתר של חלבונים וניתוח תפקודם.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

גלה סרטונים נוספים