דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדגמן קנדידה רירית באמצעות דג הזברה הצעיר. זה מושג על ידי העמסת תמיסה המכילה אלביקנים חיים לתוך מחט זעירה. בשלב השני, נפח מוגדר של תאי השמרים מוזרק לשלפוחית השחייה של דג זברה צעיר.

לאחר מכן, הדגים נבדקים לחיסון הומוגני ומודגרים לזמן הרצוי. בשלב האחרון, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לעקוב אחר האינטראקציה הדינמית של הפתוגן עם מערכת החיסון של דג הזברה. בנוסף, ניתן לנתח את שלפוחית השחייה במיקרוס כדי לקבל תמונות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה יותר.

השיטה שאנו מציגים כאן עונה על שאלות מפתח של אימונולוגיה פטרייתית כמו גם מיקרוביולוגיה, כגון מהו רצף האירועים המדויק המוביל לתגובה חיסונית כושלת לפתוגן הפטרייתי ולמשואות קנדידליות על פני הרירית. לפני תחילת ההליך יש לחמם צלחת הזרקה המכילה 2% באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להסיר 100 מיליליטר של המדיה E Three בתוספת PTU מצלחת של היום הרביעי, לאחר ההפריה של דגי זברה, הקפד לא לשאוב אף אחד מהדגים, והוסף שני מיליליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר.

טריקה מתאן סולפונאט מלאי לתקשורת כדי להרדים את בעלי החיים. לאחר 15 דקות, השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לזהות את הדגים עם שלפוחית שחייה מנופחת והשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר 30 דגי זברה לצלחת ההזרקה החמה מראש. הסר את המדיה העודפת, ואז החזק את המנה בזווית והשתמש בחוט דיג בקוטר 0.012 אינץ 'המודבק סופר לנימים של בורו סיליקט כדי ליצור שלושה קווים של 10 דגים מיושרים אנכית כל אחד הבא מערבולת יסודית של צינור של אלביקן ים טרי שהוכנו בריכוז של 1.5 כפול 10 ל- CFUs השביעי למיליליטר.

ואז טען שלושה מיקרוליטר מתמיסת השמרים למיקרו-מחט קצוצה EC. הגדר את משך הדופק להגדרה המתאימה. לאחר מכן סובב את צלחת ההזרקה כדי להגיע לזווית של 20 מעלות בין המיקרו-מחט לראש הדג המכוון לכיוון החלק האחורי של שלפוחית השחייה.

כעת דחף את המיקרו-מחט לתוך שלפוחית השתן, וודא שקדח המחט נמצא בלומן ולחץ על השלולית. לאחר שאימות אילו דגים הוזרקו הוא קל יחסית, מכיוון שהבולוס עוקר את בועת האוויר והחלק האחורי של שלפוחית השחייה מתמלא לאחר מכן במדיה, הזרקה משותפת של פנול אדום עם הבולוס יכולה להקל עוד יותר על הדמיה של הזרקה מוצלחת. לאחר הזרקת כל 30 הדגים, יש להציף את המנה ב-E שלוש מדיה ולאחר מכן לרוקן את הדג לתוך צלחת ההתאוששות.

העבירו 10 בעלי חיים לתוך צינור צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של E שלוש מדיה והמתת חסד של הדגים עם 200 מיקרוליטר טריקה. לאחר מכן, עבור כל חיה, מסדרים ארבע טיפות שומן ואקום בריבוע, במרחק של סנטימטר אחד זה מזה על שקופית מיקרו, ומוסיפים שתי טיפות של התכה טרייה ונמוכה של 2% לאמצע הריבוע. לאחר מכן, הניחו דג אחד על מגלשת זכוכית נפרדת מתחת למיקרוסקופ מנתח וכדי לוודא שליבו של בעל החיים הפסיק לפעום, והסירו את עודפי המים.

כעת השתמש בזוג אחד של פינצטה עדינה כדי להחזיק את הראש במצב קבוע ואחר כדי למשוך כלפי מטה את המעי הקדמי. הרם את שלפוחית השחייה בצינור הפנאומטי, הפריד אותה ממערכת העיכול, והנח אותה במרכז אחת ממגלשות המיקרו המוכנות לפני שהאגרו מתמצק. לבסוף, הניחו כיסוי על הרקמה ודחפו בעדינות כלפי מטה עד שהיא נוגעת בשומן הוואקום ובאגרוז ודמו את שלפוחית השחייה תוך 10 דקות מרגע הקטיף.

הזרקת ארבעה ננוליטרים של אלביקן ים באחד עד 1.5 כפול 10 מהשביעית. CFU למיליליטר נותן את הנתונים העקביים ביותר וכתוצאה מכך טווח של 10 עד 50 תאי שמרים לדג. צמצום החיסון ל-15 עד 25 תאי שמרים נותן פנוטיפ ותגובה הדוקים עוד יותר.

נויטרופילים ממלאים תפקיד מפתח בעמידות לקנדידה בעכברים ובבני אדם, והזיהום של שלפוחית השתן של דג הזברה באלביקנים חיים מוביל לגיוס מהיר ומתמשך של נויטרופילים. זה לא קורה כאשר מזריקים תאי שמרים הורגים חום. חוטים מתפתחים במהירות לאחר הזרקת תאי השמרים עם צמיחה חוטית הנמשכת במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההזרקה, ולאחר מכן מספר זה מתחיל להפחית את היכולת לעקוב אחר דגים בודדים באופן לא פולשני מאפשר מחקרי אורך אלה ומדגיש את ההבדלים הפרטניים בהתקדמות המחלה ובתגובות המארח.

פרוטוקול ניסיוני שנותר לא מעשי בהדמיית עכברים, האינטראקציות של תאים חיסוניים או אפיתל עם c albicans קל יחסית במודל המוצג כאן. עם זאת, ניתוח שלפוחית השחייה כפי שהודגם זה עתה משפר משמעותית את איכות ההדמיה. זה שימושי במיוחד כאשר מדמיינים קווי דגים טרנסגניים שבהם הקרינה באה לידי ביטוי בכל מקום, ויש פלואורסצנטיות זרה ברקמה שמסביב כפי שנצפה בתמונות אלה של שלפוחית שחייה מנותחת מקו דגי אלפא קאטין.

בצע הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות שנאמרו כגון טכנולוגיית מורף או טיפול בעיכוב כימי כדי לענות על שאלות כמו, מה תפקידו של תא חיסוני מסוים או מסלול איתות מסוים בקנדידה רירית.