Name: דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: חקור מודל של קנדידיאזיס רירית בזחל דג הזברה באמצעות הזרקת Candida albicans לשלפוחית השחייה. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות פתוגן-מערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר Le טרין וד&quot;ר טובין לנדיבות מתן α-קטנין: קו דגי סיטרין וביל ג&#39;קמן על שאפשר לנו לעשות את הצילומים במעבדה שלו. המחברים מודים מקורות מימון המכון הלאומי לבריאות (המענקים 5P20RR016463, 8P20GM103423 וR15AI094406) ומשרד חקלאות אמריקאי (פרויקט # ME0-H-1-00517-13). כתב יד זה מתפרסם כחקלאות וראשי ניסוי יערנות מספר פרסום התחנה 3371.

הערה: כל פרוטוקולי טיפול דג הזברה והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות NIH תחת מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) A2012-11-03 פרוטוקול. 1. דג הזברה גידול עד 4 ימי הפריה הודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דג הזברה AB, או כל קווים מהונדסים אחרים, תוך שלאחר ההפריה 3 שעות הראשונות, כפי שמוצג בסרטון אחר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 120 ביצים ב-15 סנטימטרים צלחות פטרי המכילות 150 מיליליטר של תקשורת E3 (5 mM NaCl; 0.17 מ&quot;מ KCl; 0.33 מ&quot;מ CaCl 2; 0.33 מ&quot;מ MgCl 2; 2 מ&quot;מ HEPES; pH 6.8) עם מתילן הכחול (מיקרוגרם 0.3 סופי / ml ריכוז) בחממה C ° 33 עם 12/12 האור / photoperiod כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת לאחר שעה 6 עם E3 + PTU (1-פניל-2-thiourea, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) ולהסיר את הביצים מתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 ימים על 33 מעלות צלזיוס, החלפת מדיה עם E3 הטרי + PTU לאחר 2 ימים. </li></ol> 2. בjection מיקרו-מחט הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי בורוסיליקט (1.2 מ&quot;מ OD, מ&quot;מ ID 0.69) למייקרו-מחט באמצעות חולץ מחט עם ההגדרות הבאות (550 חום; 0 Pull; 130 Velocity; 110 זמן). הערה: ההגדרות תשתנה מחוט הלהט לחוט להט להשיג מיקרו-מחטים בצורה דומה (ראה איור 1) ויהיה צורך בכל פעם שסדרה את נימה חדשה מותקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט עם 3 μl של 0.4 מיקרומטר מלוח מסונן-חיץ פוספט (PBS; 137 מ&quot;מ NaCl; 2.7 מ&quot;מ KCl; 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4; 1.8 מ&quot;מ KH 2 PO 4; pH 7.4) בעזרת פיפטה microloader 20 μl טיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרו-המחט על בעל micropipette על micromanipulator המחובר למערכת הזרקה בלחץ. הגדר את לחץ ההזרקה עד 30 PSI ומשך הדופק ליום 30 באלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת פטרי עם מים מזוקקים, להוריד את מיקרו-המחט עד 1/5 של המחט הוא במים. קליפ wi מיקרו-המחטth פינצטה בסדר, ממש מתחת למפלס המים. להביא מיקרו-המחט מחוץ למים וללחוץ על הדוושה מספר פעמים עד בולוס מופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הקוטר של בולוס ידי הורדת מיקרו-המחט על hemocytometer שכבתי עם ירידה של סוג אחד שמן טבילה. התאם את משך הדופק כדי לקבל את העצמה הרצויה (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את backpressure לבולוס להישאר יציב בשמן (להוריד את הלחץ אם בולוס מגביר את עוצמת השמע ולהגדיל את backpressure אם בולוס הנפח קטן). רשום את משך הדופק לכל מיקרו-מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ממייקרו-המחט על ידי aspirating אותו באמצעות קצה פיפטה microloader ולגרש את השמאל על PBS על ידי הצבת אותו בחזרה על המזרק ומדליק את הדופק הרציף. שומר כל מיקרו-מחט. </li></ol> 3. הכנת קנדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנדידה אלביקנס Streak הפך עם אופטימיזציה קודון dTomato, GFP, BFP, EOS או רחוקאדום ממניות קפוא (-80 ° C המניה ב -25% גליצרול) באמצעות מסמרת עץ סטרילי על דקסטרוז שמרי peptine (YPD) צלחת אגר (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L , אגר L / 20 g; autoclaved ושפכתי 25 מיליליטר בצלחות פטרי) ודגירת הלילה בשעה 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת באמצעות מסמרת עץ סטרילי ולחסן 5 מיליליטר של נוזל YPD (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L, autoclaved וaliquotted סביבה נקי מחיידקים ב5 מיליליטר בתרבות זכוכית 16 x 150 מ&quot;מ צינורות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 30 ° C בתוף רולר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 1 מיליליטר של ג תרבות אלביקנס והעברה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.7 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 5000 במשך כמה שניות. רוקן את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של סטרילית PBS, מערבולת ביסודיות. חזור פעמיים זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת המושבות באמצעות hemocytometer על ידי דילול מניות 1 מיליליטר 1: 1,000 בPBS סטרילי. </li></ol> 4. הזרקת דג הזברה בSwimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם צלחת הזרקה (agarose 2%) למשך 30 דקות בחממה C ° 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 100 של 150 מיליליטר של E3 + PTU מ -15 סנטימטרים צלחת פטרי המכילה דגים להזריק בעזרת פיפטה 25 מיליליטר ללא aspirating כל דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 4 DPF דג הזברה על ידי הוספת 2 מיליליטר של 4 מ&quot;ג / מיליליטר שנאגרו tricaine מניות מתאן sulfonate (TR) לנותרה 50 מיליליטר התקשורת (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) ולהמתין במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, בחר דגים עם swimbladder מנופח. דגים גם יכולים להיות מוקרנים באותו הזמן לפנוטיפ הומוגנית, כגון הפצת נויטרופילים בMPO: קו GFP באמצעות epifluorescence לנתח מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ג מניית אלביקנס מריכוזו המקורי (שלב 3.8) 1.5 x 10 7 מושבה להרכיב יחידות למ&quot;ל (CFU / ml) בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דג הזברה על צלחת ההזרקה באמצעות צינור העברת פלסטיקטטי ולהסיר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי דיג-חוט (חוט דיג קוטר 0.012 אינץ &#39;סופר-דבוק לנימי ורוסיליקט), לעשות 3 שורות של 10 דגים, על ידי הלחיצה על צלחת ההזרקה אנכית ולהתמצא הדגים אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות מערבולת הצינור עם 1.5 x 10 7 CFU / ml ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט אחת עם 3 μl של ג אלביקנס באמצעות קצה פיפטה microloader חדש ולהגדיר את משך הדופק להגדרה המתאימה (ראה שלב 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת ההזרקה לעשות זווית של 20 מעלות בין מיקרו-המחט והראש של הדג, מכוון לכיוון חלק האחורי של swimbladder (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מיקרו-המחט לתוך swimbladder, כדי לוודא שנשאת של המחט הוא בלומן, ולחץ על הדוושה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל דגים ולהעביר לצלחת התאוששות (25 מיליליטר E3 + PTU) על ידי הצפת המנה עם E3ד לרוקן אותה לתוך צלחת ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דגים אחר לצלחת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה חוזרת עם מיקרו-מחט חדשה מלאה ביסודיות vortexed ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיום על ידי הזרקת שליטת PBS, במידת צורך, באמצעות צלחת הזרקה שונה, כדי למנוע זיהום ולהעביר לצלחת נפרדת התאוששות (שלב 4.10). </li></ol> 5. הקרנת הדגים לבידוד רצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של 0.4% נמוכים להמיס פתרון agarose (אה&quot;ע) על ידי הוספת 160 מ&quot;ג של נמוך להמיס agarose 40 מיליליטר של E3, רותח על ידי במיקרוגל עד שהיא נמסה, וקירור עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 400 μl של TR (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) מקורר פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות התאוששות, לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מ&quot;ל E3 + PTU, 200 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 30 דגים (עם תקשורת קטנה ככל האפשר) עד 2 מיליליטר של LMA בסירה במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים לשאוב בודדים עם טפטפת העברה וצלחת הדגים עם טיפות 1 של LMA לתוך צלחת הדמיה 96-היטב, רק באמצעות 10 x 6 הבארות מרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד שכל הדגים למסך נטענים לצלחת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התקשורת לגבש בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגים בצד שלהם, כדי לוודא שהם נמצאים בקשר עם תחתית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 20X על epifluorescence / מיקרוסקופ confocal הפוך והמסנן המתאים, לרשום את המספר של ג תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של כל דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הדג עם 15-25 תאי שמרים בswimbladder (או הבידוד רצוי), להרדים לא נבחרו-דגים (800 / מיליליטר מיקרוגרם של TR בE3) ולחזור דגים נבחרו לצלחת פטרי עמוקה 50 מיליליטר של E3 + PTU עם על ידי הוספת 3 טיפות של E3 לבארות שנבחרו צלחת ההדמיה וaspirating הדגים עם טפטפת העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 33 מעלות צלזיוס למשך הרצוי. </li></ol> 6. הדמיה הדגים Post-ההקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 25 של 50 מיליליטר של תקשורת E3 + PTU מהצלחת העמוקה פטרי המכילה דגים לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מיליליטר E3 + PTU שנותר, מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הדגים לצלחת 96-היטב הדמיה ומיקום הולם (שלבים 5.3-5.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על ידי סריקה מיקרוסקופית confocal באמצעות הלייזרים המתאימים ומסנני פליטה. מוקד ראשון על הדגים באמצעות מטרת 4X תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ולרכוש תמונות של האזור של עניין באמצעות מטרת 20X עם לייזרי confocal במצב סריקה עם 2 מהירות μsec / פיקסל ו1024 x 600 פיקסל יחס ממדים. לרכוש Z- ערימות עם גודל צעד מיקרומטר 1, החלת מצב מסנן קלמן של 3 מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל צלחת פטרי עמוקה עם 50 מיליליטר E3 + PTU או לindividuaבארות l (צלחת 24 גם תרבות, 3 מיליליטר E3 + PTU) ולדגור על 33 מעלות צלזיוס. </li></ol> 7. ביתור Swimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LMA 2% (שלב 5.3 עם 160 מ&quot;ג של התכה נמוכה agarose ב 8 מיליליטר של E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, לטשטש את הדגים (שלב 5.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 10 דגים לצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות עם 1 מיליליטר של E3 ולהרדים על ידי הוספת 200 μl של 4 מ&quot;ג / מיליליטר Tricaine (מיקרוגרם / מיליליטר סופי ריכוז 800) לצינור צנטריפוגות ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות זכוכית הדמיה על ידי הצבת 4 טיפות של שומן ואקום בכיכר, מלבד 1 סנטימטר על microslide (75 x 25 מ&quot;מ, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 טיפות של 2% LMA באמצע הכיכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דג אחד בשקופית זכוכית נפרדת תחת מיקרוסקופ לנתח ולוודא שהלב הפסיק מכות, להסיר את עודפי המים. </li><li&gt; שימוש בפינצטה בסדר לנתח swimbladder על ידי שמירה על הראש בתנוחה קבועה עם פינצטה השמאל ומושך את הבטן הקדמית עם פינצטה תקין (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את swimbladder על ידי צינור פנאומטי עם פינצטה השמאל, מפריד אותה ממערכת העיכול, ולמקם אותו במרכזה של LMA 2% לפני שהוא מבצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כיסוי להחליק (18 x 18 מ&quot;מ) על גבי שקופית זכוכית הדמיה ולדחוף אותו עד שהוא נוגע גריז הוואקום, כמו גם את אה&quot;ע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בתוך 10 דקות של נתיחה כמתואר בשלב 6.4. חזור על שלב 7.7-7.11 עם הדגים האחרים. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התקדמות ומגבלות מודל המחלה microinjection swimbladder המודל שהוצג כאן הוא הרחבה של מודל טבילת פטרת הרירי המתואר בGratacap et al (2013).; זה מוסיף את היתרונות של זמן זיהום בשליטה, במינון מאוד לשחזור זיהום, ושיפור יעילות ולכן. אנו מדגימים כאן שיטות חדשות המאפשרות תיעוד לא פולשנית זמני של דינמיקת זיהום בפירוט רב, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר vivo לשעבר של swimbladder. נהלים אלה צריכים להקל על המח...

זיהומים ברירית עלולים להוביל לזיהומים מסכני חיים בזרם הדם עקב הנזק של מחסום האפיתל, המאפשר לפתוגנים גישה לסביבה המערכתית1,2. בנוסף, זיהומים ברירית יכולים גם לגרום לאימונופתולוגיה משמעותית גם כאשר הם כלולים חיצונית3-5. הפטרייה החד-תאית קנדידה אלביקנס קיימת ברוב האוכלוסייה בחלל הפה ובאתרים ריריים אחרים6-9. למרות שבדרך כלל מוכלים על ידי תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות, פגמים חיסוניים מולדים והתערבויות רפואיות עלולים להוביל לקנדידה רירית חמורה. ההתקפה על מחסום האפיתל מביאה לסיכון מוגבר למחלה מפושטת מסכנת חיים כמו גם לאימונופתולוגיה, כמו במקרה של קנדידה בולוו-נרתיקית, בנוסף קולוניזציה של C. albicans נקשרה להומאוסטזיס חיסוני ריאות10,11. קנדידה מפושטת היא כעת הזיהום הרביעי בשכיחותו בזרם הדם ביחידות טיפול נמרץ12 ותמותה של עד 40% הופכת אותה לדאגה גדולה. בשל הגידול בטיפולים אימונומודולטוריים לחולים עם מחלות אוטואימוניות, סרטן או השתלות איברים, חובה להבין את האינטראקציה בין פתוגן זה לתא החיסון הרירי.
רוב ההתקדמות הביולוגית של התאים בנוגע לאינטראקציות בין C. albicans לתאים ברמת הרירית מגיעה ממודלים במבחנה13-15 ועכברים16-18. לשתי הגישות הללו יש יתרונות ברורים, אך היכולת לדמות תאים חיים ברזולוציה גבוהה במארח שלם הגבילה את האפיון הזמני והמרחבי של הזיהום. עבור מחקרים אלה, יש צורך במודל in vivo שבו ניתן לדמיין את האינטראקציה של פתוגן, תאי חיסון ואפיתל מולדים במארח חוליות שלם.
דג הזברה התגלה ככלי רב ערך להבנת מחלות אנושיות, בעיקר בשל השקיפות שלו ויכולתו למניפולציה גנטית. התפתחות תאים ואיברים צולמה בפירוט מעולה, מה שהוביל לתיאור התנהגויות חדשות של תאי חיסון, כגון התנהגות תאי T בתימוס19 המתפתח או הקרב בין מיקובקטריות תוך-תאיות לפגוציטים20-22. עבודה אחרונה תיארה אינטראקציות בין חיידקי מעיים למארח בדגי הזברה והראתה כי קולוניזציה מיקרוביאלית של מערכת העיכול משפיעה על הפיזיולוגיה של המעי המארח ועל עמידות לזיהומים אחרים23,24. יתר על כן, זיהום דרך אפיתל המעי תואר עבור מספר פתוגנים.
בניגוד למערכת העיכול, שלפוחית השחייה מייצגת מודל רירי מבודד ומשלים יותר. איבר זה הוא הרחבה של צינור המעי המתפתח ונוצר קדמית לכבד וללבלב25,26. הוא מייצר פפטידים פעילי שטח, ריר ואנטי-מיקרוביאלים27,28 ומבחינה אנטומית, כמו גם מבחינה אונטוגנטית, איבר זה נחשב להומולוג של ריאת היונקים29,30. מכיוון שהצינור הפנאומטי נשאר מחובר למעי בדג הזברה, הדבר מאפשר לזיהום טבילה להתרחש באופן טבעי. למרבה הפלא, הזיהומים הטבעיים היחידים הידועים של דגים עם מיני קנדידה הם זיהומי C. albicans בכיס השחייה31. לאחרונה תיארנו מודל זיהום טבילה ניסיוני שבו C. albicans מדביק את שלפוחית השתן, ומצאנו שזיהום זה מסכם כמה מסימני ההיכר של אינטראקציה בין C. albicans לאפיתל במבחנה32,33. 
בשיטה המוצגת כאן, מודל הזיהום המקורי בטבילה משופר על ידי הזרקה ישירה של C. albicans לכיס השחייה של דג הזברה 4 ימים לאחר ההפריה (dpf). זה מאפשר שליטה זמנית מדויקת בזיהום כמו גם חיסון בעל יכולת שחזור גבוהה. זה מאפשר הדמיה תוך-חיונית מפורטת, יחד עם הרבגוניות של דגם דג הזברה. כדוגמה למה שניתן לעשות בשיטה זו, אנו מציגים את הדינמיקה המרחבית-זמנית של גידול C. albicans יחד עם גיוס נויטרופילים לאתר ההדבקה. מכיוון שרקמת שלפוחית השחייה של דג הזברה מאתגרת להדמיה תוך-חיונית, אנו מציגים גם טכניקת דיסקציה מהירה של שלפוחית השחייה המשפרת את אות הקרינה והרזולוציה המיקרוסקופית. שיטות אלה מרחיבות את ארגז הכלים למחקר פטרייתי, אימונולוגי וחקלאות ימית, כמו גם מתארות מסלול זיהום חדש שעשוי להיות מתורגם למודל זיהומים פטרייתיים, חיידקיים או נגיפיים אחרים של משטחים ריריים.

<table><tbody><tr><td>צינורות 1.7 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי עמוק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה משובחת (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>דיבלים מעץ</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה חום בוער</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט נימי</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 מערכת הזרקה</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>יחידת לחץ אחורית</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מחזיק מיקרופיפטה</td><td>מכשור מדעי יישומי</td> מתג רגל <td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>יישומי מדעי מכשור</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>בסיס מגנטי</td><td>מכשור מדעי יישומי בסיס</td><td></td><td>מגנטי</td></tr><tr><td>טריקאין מתאן סולפונאט</td><td>ווסטרן כימיקלים בע"</td>מ<td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZ61 למעלה SZX-ILLB2-100 בסיס</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>IX-81 עם מערכת סריקת לייזר FV-1000 מערכת קונפוקלית</td> 20X מיקרוסקופ אובייקטיבי אולימפוס UPlanSApo 20x/0.75 תוף רולר ניו ברונסוויק מדעי TC-7 קצות פיפטה מיקרו-מעמיס <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית זכוכית (16 x 150 מ"מ)</td> <td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>חימר ילדים (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר ( Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה מסוג A</td><td>מוצרי שיש כחול</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>חוט דיג</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת הדמיה באר (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום גבוה (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שקופית (25 x 75 מ"מ)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי (18 x 18 מ"מ), מס' 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 15 ס"מ (פלסטיק אולימפוס)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול (כימיקלים EMD)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות (פלסטיק אולימפוס)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>סירות משקל (8.9 ס"מ)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת swimbladder

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

הגנה מוקדמת מפני פתוגנים רירית מורכבת משני מחסום האפיתל ותאי חיסון מולדים. Immunocompetency של שניהם, ואינטרקום, הם בעל חשיבות עליונה להגנה מפני זיהומים. האינטראקציות של תאי מערכת חיסון המולדים אפיתל ועם הפתוגן נחקרות הטובות ביותר in vivo, שבו התנהגות מורכבת נפרש על פני זמן ובמרחב. עם זאת, מודלים קיימים אינם מאפשרים הדמיה מרחב ובזמן קלה של הקרב עם פתוגנים ברמה הרירית. המודל שפותח כאן יוצר זיהום ברירית על ידי הזרקה ישירה של הפתוגן פטרייתי, קנדידה אלביקנס, לswimbladder של דג הזברה לנוער. הזיהום כתוצאה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אפיתל והמולד התנהגות תא חיסונית לאורך התפתחות מחלת רירית. הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת לחקירה של המארח כדי לחקור את הרצף המפורט של אירועים חיסוניים המובילים לphגיוס agocyte ולבחון את תפקידם של סוגי תאים מסוימים ומסלולים מולקולריים בהגנה. בנוסף, ההתנהגות של הפתוגן כפונקציה של התקפה חיסונית ניתן הדמיה בו זמנית על ידי שימוש בג-להביע חלבון פלואורסצנטי אלביקנס. רזולוציה מרחבית מוגברת של האינטראקציה מארח הפתוגן ניתן גם להשתמש בטכניקה לנתיחה swimbladder המהירה תיארה. מודל הזיהום ברירית שתואר כאן הוא פשוט ושחזור מאוד, מה שהופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פטרת ברירית. מערכת זו יכולה להיות גם באופן רחב הניתנות לתרגום לפתוגנים ריריים אחרים כגון חיידקים mycobacterial, חיידקים או ויראלי, כי בדרך כלל להדביק באמצעות משטחי אפיתל.

Microinjection בswimbladder האחורי השיטה הניסיונית שהוצגה כאן מתארת ​​את ההזרקה של מינון של ג עקבי תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של 4 DPF דג הזברה. עבודה קודמת עם מודל הטבילה עולה כי התגובה החיסונית swimbladder לג אלביקנס דומה לפטרת ברירית יונקים 32. כאן אנו מדגימים שיטת זיהום שונה שהיא יותר פשוט, לשחזור ומהיר; כמה מאות דג הזברה יכולות להיות מוזרקים והוקרנו בתוך כמה שעות. <p...

in vivo אינטראקציות מרחביות-זמניות של פתוגן והגנות חיסוניות ברמת הרירית אינן ניתנות להדמיה בקלות במארחים קיימים של בעלי חוליות. השיטה המוצגת כאן מתארת פלטפורמה רב-תכליתית לחקר קנדידה רירית בבעלי חוליות חיים תוך שימוש בכיס השחייה של דג הזברה הצעיר כאתר זיהום.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדגמן קנדידה רירית באמצעות דג הזברה הצעיר. זה מושג על ידי העמסת תמיסה המכילה אלביקנים חיים לתוך מחט זעירה. בשלב השני, נפח מוגדר של תאי השמרים מוזרק לשלפוחית השחייה של דג זברה צעיר.לאחר מכן, הדגים נבדקים לחיסון הומוגני ומודגרים לזמן הרצוי. בשלב האחרון, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לעקוב אחר האינטראקציה הדינמית של הפתוגן עם מערכת החיסון של דג הזברה. בנוסף, ניתן לנתח את שלפוחית השחייה במיקרוס כדי לקבל תמונות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה יותר.השיטה שאנו מציגים כאן עונה על שאלות מפתח של אימונולוגיה פטרייתית כמו גם מיקרוביולוגיה, כגון מהו רצף האירועים המדויק המוביל לתגובה חיסונית כושלת לפתוגן הפטרייתי ולמשואות קנדידליות על פני הרירית. לפני תחילת ההליך יש לחמם צלחת הזרקה המכילה 2% באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להסיר 100 מיליליטר של המדיה E Three בתוספת PTU מצלחת של היום הרביעי, לאחר ההפריה של דגי זברה, הקפד לא לשאוב אף אחד מהדגים, והוסף שני מיליליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר.טריקה מתאן סולפונאט מלאי לתקשורת כדי להרדים את בעלי החיים. לאחר 15 דקות, השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לזהות את הדגים עם שלפוחית שחייה מנופחת והשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר 30 דגי זברה לצלחת ההזרקה החמה מראש. הסר את המדיה העודפת, ואז החזק את המנה בזווית והשתמש בחוט דיג בקוטר 0.012 אינץ 'המודבק סופר לנימים של בורו סיליקט כדי ליצור שלושה קווים של 10 דגים מיושרים אנכית כל אחד הבא מערבולת יסודית של צינור של אלביקן ים טרי שהוכנו בריכוז של 1.5 כפול 10 ל- CFUs השביעי למיליליטר.ואז טען שלושה מיקרוליטר מתמיסת השמרים למיקרו-מחט קצוצה EC. הגדר את משך הדופק להגדרה המתאימה. לאחר מכן סובב את צלחת ההזרקה כדי להגיע לזווית של 20 מעלות בין המיקרו-מחט לראש הדג המכוון לכיוון החלק האחורי של שלפוחית השחייה.כעת דחף את המיקרו-מחט לתוך שלפוחית השתן, וודא שקדח המחט נמצא בלומן ולחץ על השלולית. לאחר שאימות אילו דגים הוזרקו הוא קל יחסית, מכיוון שהבולוס עוקר את בועת האוויר והחלק האחורי של שלפוחית השחייה מתמלא לאחר מכן במדיה, הזרקה משותפת של פנול אדום עם הבולוס יכולה להקל עוד יותר על הדמיה של הזרקה מוצלחת. לאחר הזרקת כל 30 הדגים, יש להציף את המנה ב-E שלוש מדיה ולאחר מכן לרוקן את הדג לתוך צלחת ההתאוששות.העבירו 10 בעלי חיים לתוך צינור צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של E שלוש מדיה והמתת חסד של הדגים עם 200 מיקרוליטר טריקה. לאחר מכן, עבור כל חיה, מסדרים ארבע טיפות שומן ואקום בריבוע, במרחק של סנטימטר אחד זה מזה על שקופית מיקרו, ומוסיפים שתי טיפות של התכה טרייה ונמוכה של 2% לאמצע הריבוע. לאחר מכן, הניחו דג אחד על מגלשת זכוכית נפרדת מתחת למיקרוסקופ מנתח וכדי לוודא שליבו של בעל החיים הפסיק לפעום, והסירו את עודפי המים.כעת השתמש בזוג אחד של פינצטה עדינה כדי להחזיק את הראש במצב קבוע ואחר כדי למשוך כלפי מטה את המעי הקדמי. הרם את שלפוחית השחייה בצינור הפנאומטי, הפריד אותה ממערכת העיכול, והנח אותה במרכז אחת ממגלשות המיקרו המוכנות לפני שהאגרו מתמצק. לבסוף, הניחו כיסוי על הרקמה ודחפו בעדינות כלפי מטה עד שהיא נוגעת בשומן הוואקום ובאגרוז ודמו את שלפוחית השחייה תוך 10 דקות מרגע הקטיף.הזרקת ארבעה ננוליטרים של אלביקן ים באחד עד 1.5 כפול 10 מהשביעית. CFU למיליליטר נותן את הנתונים העקביים ביותר וכתוצאה מכך טווח של 10 עד 50 תאי שמרים לדג. צמצום החיסון ל-15 עד 25 תאי שמרים נותן פנוטיפ ותגובה הדוקים עוד יותר.נויטרופילים ממלאים תפקיד מפתח בעמידות לקנדידה בעכברים ובבני אדם, והזיהום של שלפוחית השתן של דג הזברה באלביקנים חיים מוביל לגיוס מהיר ומתמשך של נויטרופילים. זה לא קורה כאשר מזריקים תאי שמרים הורגים חום. חוטים מתפתחים במהירות לאחר הזרקת תאי השמרים עם צמיחה חוטית הנמשכת במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההזרקה, ולאחר מכן מספר זה מתחיל להפחית את היכולת לעקוב אחר דגים בודדים באופן לא פולשני מאפשר מחקרי אורך אלה ומדגיש את ההבדלים הפרטניים בהתקדמות המחלה ובתגובות המארח.פרוטוקול ניסיוני שנותר לא מעשי בהדמיית עכברים, האינטראקציות של תאים חיסוניים או אפיתל עם c albicans קל יחסית במודל המוצג כאן. עם זאת, ניתוח שלפוחית השחייה כפי שהודגם זה עתה משפר משמעותית את איכות ההדמיה. זה שימושי במיוחד כאשר מדמיינים קווי דגים טרנסגניים שבהם הקרינה באה לידי ביטוי בכל מקום, ויש פלואורסצנטיות זרה ברקמה שמסביב כפי שנצפה בתמונות אלה של שלפוחית שחייה מנותחת מקו דגי אלפא קאטין.בצע הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות שנאמרו כגון טכנולוגיית מורף או טיפול בעיכוב כימי כדי לענות על שאלות כמו, מה תפקידו של תא חיסוני מסוים או מסלול איתות מסוים בקנדידה רירית.

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

מקור: Li, J. et al. פיתוח מודל זיהום של דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את האספקה המבוססת על מיקרו-הזרקה של Clostridioides difficile המסומן פלואורסצנטי ללומן המעי של זחל דג זברה מורדם. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנת זחלים, הזרקת חיידקים ואישור מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של לוקליזציה של חיידקים במעי.

אספקה מקומית של חיידקים ללומן המעי של זחל דג זברה באמצעות מיקרו-הזרקה

מקור: פלורס, א. ואחרים. שימוש בפרוטוזואן Paramecium caudatum ככלי לזיהומים המועברים במזון בזחלי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את השיטה לקביעת מודל זיהום חיידקי במעי המועבר במזון לזחלי דגי זברה על ידי האכלה בפרמסיה הנגועה ב-E. coli פלואורסצנטי.

מידול זיהום במעי בזחלי דגי זברה באמצעות חיידקים המועברים במזון

מקור: לי, ג'. ואחרים. פיתוח מודל זיהום דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את הליך המיקרוגבאז', שבו זחל דג זברה מורדם משותק באגרוז ומוזרק דרך הפה לחיידק פתוגני באמצעות מחט מונחית על ידי טרייסר. המשלוח הלא פולשני מדמה זיהום טבעי, ומאפשר ניתוח של שכפול חיידקים, שחרור רעלים ונזק אפיתל במעי.

פיתוח מודל זיהום זחל בדג זברה באמצעות מיקרוגאבאז'

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

ב פרוטוקול זה, שכותרתו fluorescently ט cruzi הוזרקו לזחלים דג זברה שקוף, טפיל תנועתיות נצפתה ויוו באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון זריחה.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

חקור מודל של קנדידיאזיס רירית בזחל דג הזברה באמצעות הזרקת Candida albicans לשלפוחית השחייה. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות פתוגן-מערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

גלה סרטונים נוספים