כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את תפוקת התימוס ומח העצם על ידי כימות מעגלי כריתת קולטני תאי T או REX ו-K, מחיקת מעגלי כריתת רקומבינציה או תיקונים בבדיקה אחת. זה מושג על ידי בניית פלסמיד משולש המכיל שברים של רצף ה-DNA של תיקוני TRX ושל גן ייחוס עותק יחיד על מנת לשמור על יחס אחד לאחד לאחד בין שלושת המטרות לאחר הגברת ה-DNA. לאחר מכן, עקומה סטנדרטית נבנית על ידי ביצוע דילול סדרתי של פלסמיד ההכנסה המשולש, המאפשר כימות מוחלט של שלושת רצפי המטרה על ידי PCR בזמן אמת

לבסוף, בדיקת PCR בזמן אמת מופעלת המובילה לכימות מוחלט של סדקים וסדקים. התוצאות המדווחות מראות את השינויים בתפוקת בלוטת התימוס ומח העצם עם גיל ומין בילדים ומבוגרים בריאים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר היינו צריכים לנתח גם את מח העצם וגם את תפוקת התימוס בילודים או תינוקות, בהתחשב בכך שכמות הדם הנשאבת בדרך כלל נדירה בהשוואה למבוגרים.

לכן, החלטנו לשלב את שתי השיטות של מעקב ותיקון כימות לבדיקה אחת על מנת לייעל את עלויות הכנת הדגימה והריאגנטים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון של חסרים חיסוניים ראשוניים ונרכשים, אך ניתן להשתמש בשיטה גם בכל המחלות הכרוכות באובדן תאי TMB וכן לחקר בנייה מחדש לאחר השתלת מח עצם באמצעות שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלות אנושיות. ניתן ליישם אותו גם במחקר בסיסי, בעיקר זה הכרוך בהומאוסטזיס לימפוציטים.

היתרון העיקרי של הוא על ידי שימוש בעודף משולש באמצע יש צורך רק בתרופה סטנדרטית אחת, ובכך להפחית את השונות הניסיונית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל ההליך הארוך הנדרש להכנת הפלסמיד המשולש או בגלל הבעיות הקשורות להכנת עקומה סטנדרטית. כדי להתחיל להשיג דגימה המכילה תאים בעלי סבירות גבוהה ל-TRX וסדקים הניתנים לזיהוי על ידי PCR, כגון דם היקפי של נבדק צעיר ובריא שנאסף לצינורות EDTA בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות סטנדרטית.

הפרד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי לאחר חילוץ ה-DNA מהתאים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפריימרים ספציפיים ל-Fort TRX REX וגן קבוע אלפא TCR כדי להגביר את אות רקס, מפרק אות רקס משותף ושברי גן קבוע אלפא TCR. הכנס את תוצר ה-PCR של מפרק אות Trax לאתר מקבל TA של וקטור הטופו PCR 2.1 והשתמש ב-DNA הפלסמיד כדי להפוך XL אחד תאים כחולים בעלי יכולת כימית על ידי הלם חום לבודד מושבות לבנות עמידות לאמפיצילין שאיבדו את השלמת הבטא לקטאז על צלחת מאסטר חדשה והשתמש ב-PCR כדי לזהות את המושבות המכילות את שבר הטרק. לאחר גידול אחת המושבות החיוביות לטרק ובידוד ה-DNA, השתמש ב-SP one כדי לעכל את הפלסמיד ואת התוצר המוגבר של גן קבוע אלפא TCR ולחבר את שבר הגן קבוע אלפא TCR לתוך הפלסמיד.

חזור על טרנספורמציה, בחירת מושבה והתרחבות ובידוד DNA כדי להכניס את השבר הנכון, השתמש בשלוש האחוריות ולא ב-SP אחד כדי לעכל את הפלסמיד ואת שבר ה-PCR הנכון וחזור על התהליך כדי לקשור ולבודד את ה-DNA. לאחר אימות הרצפים של שלושת התוספות, הרחב את המושבה וטהר את ה-DNA של הפלסמיד על ידי הכנת MIDI לפי פרוטוקול הטקסט להכנת עקומה סטנדרטית. לאחר חישוב המסה והריכוז של הפלסמיד כפי שמוצג כאן, הפשירו אליקוט של הפלסמיד ותראו אחד ליניארי של שני מיקרוגרם עם העלייה הליניארית של ה-DNA.

השתמש בנוסחה C אחד V אחד שווה C שתיים V שתיים. כדי לחשב את נפח הדילול הדרוש להכנת נקודת העקומה הסטנדרטית הראשונה של הסדרה כפי שמוצג כאן, הכן סדרה של 1 עד 10 דילולים כדי לקבל את נקודות העקומה הסטנדרטיות הנותרות. אחסן את דילול הפלסמיד ב-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לשימוש כדי להכין דגימות ל-PCR בזמן אמת סדר לוחית PCR הכוללת לפחות שני שכפולים עבור כל דגימה לניתוח באופן הבא עם שני צינורות נפרדים, אחד לרקס וסדקים, ואחד נוסף עבור קבוע אלפא TCR.

הכן את תערובות המאסטר למספר הכולל של הבארות הדרושות. הוסף 20 מיקרוליטר לבארות הצלחת. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של DNA גנומי המופק מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי או P BMCs.

הוסף חמישה מיקרוליטר מים לבארות הבקרה ללא תבנית לפני השימוש בכיסוי דבק אופטי כדי לאטום את לוחית התגובה. לאחר מכן הפשירו את דילול העקומה הסטנדרטית של ה-DNA של הפלסמיד והכינו את הדילול הגבוה ביותר. גלה רק את הבארות הממוקמות בין שורות A עד H ועמודות 1 עד 4.

ולאחר מערבולת קצרה, הוסף חמישה מיקרוליטר מכל נקודת דילול למטרה שלה. ובכן, וודאו כי אין בועות בתחתית הבארות וכי הריאגנטים מיושבים בתחתית. השתמש במערכת PCR בזמן אמת כדי להפעיל את הבדיקה עם הפרוטוקול הבא.

50 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות וחימום ראשוני ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. ובדיקה משולבת של פריימר e כריעה והתארכות ב-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. כדי לנתח את נתוני ה-PCR בזמן אמת, פתח את קובץ התוצאות השמור בתוכנה ולחץ על לשונית התוצאות בחלק העליון של החלון.

לחץ על תפריט הניתוח ובחר הגדרות ניתוח. תן לתוכנה לקבוע את הסף באופן אוטומטי על ידי בחירת כל הגלאים ו-CT אוטומטי למחזור סף. תן לתוכנה להגדיר קו בסיס אוטומטי להסרת רקע כברירת מחדל.

לחץ על הכרטיסייה בשם עלילת הגברה, ובחלק הימני ביותר של החלון, בחר אחד משלושת הגלאים בתפריט הנפתח המתאים. ממש מתחת לבחירת CT ידני כדי להגדיר ידנית סף בחלק התחתון של החלון, בחר את הבארות המתאימות לנקודות דילול העקומה הסטנדרטיות של הגלאי הנבחר כדי להציג את עלילות ההגברה על ידי לחיצה וגרירה של העכבר מעל התאים המתאימים בטבלה. כדי לכוונן את הסף באופן ידני, גרור את קו הסף האדום למעלה ולמטה ולאחר מכן לחץ על נתח כדי לנתח מחדש את התוצאות.

כדי לבדוק כיצד הגדרת הסף משפיעה על התוצאות, בחר בכרטיסיית הדוח וראה את ה-CT המתקבל של נקודות דילול העקומה הסטנדרטית המתאימות. בעת הזזת הסף כדי לקבל מיקום אופטימלי בלשונית עלילת ההגברה, ודא שהסף נמצא באזור של הגברה אקספוננציאלית מספיק מעל רעש הרקע, אך מתחת לשלב הרמה. אם עלילת ההגברה אינה מוצגת בקנה מידה לוגריתמי, לחץ לחיצה ימנית על העלילה כדי לזכור את הגדרות הגרף ולהגדיר את הגדרת Y ais לאחר ההפעלה כיומן.

הגדר את הסף באמצע הדרך בחלק הליניארי של העלילה והתבונן בעקומות ההגברה המקבילות זו לזו בקירוב. לחץ על לשונית הדוח כדי לראות את תוצאות ה-CT. ודא שמיקום הסף הניב תוצאות שממקסמות את הדיוק של שני השכפולים של כל עקומה סטנדרטית.

נקודות דילול. בדוק שהסף ממוקם בנקודה המשקפת בצורה הטובה ביותר את סדרי הגודל הקיצוניים של נקודות דילול העקומה הסטנדרטיות תחת לשונית הדוח. גרור את העכבר שוב בטבלה בחלק התחתון של החלון כדי לבחור את התאים המתאימים לבארות של העקומה הסטנדרטית עבור כל הגלאים, ודא שה-CT המתקבל של שלושת היעדים דומה מאוד באותן נקודות דילול.

לדוגמה, הפרש, לא יותר מ-0.5 CT התאם מחדש את הסף במידת הצורך, ובדוק שוב תחת לשונית הדוח בחלק התחתון של החלון. בחר בארות NTC ובדוק שאין הגברה בבארות NTC, המתאימה ל-CT של לא נקבע. בחר את לשונית העקומה הסטנדרטית ומימין לחלון העלילה, בחר גלאים מהתפריט הנפתח ובדוק אם שיפוע העקומה הסטנדרטי המדווח נע בין שלילי 3.55 לשלילי 3.32, המתאים ליעילות PCR של 91 עד 100%ודא שמקדם הקביעה או R בריבוע גבוה מ-0.998 על ידי בדיקת ערכו ממש מתחת לשיפוע ויירוט.

לחץ על לשונית הדוח ובתאים המתאימים של הטבלה מתחת לתרשים, ודא שה-CT של הבקרה החיובית תואם את תוצאות הבדיקות הקודמות באותו בקרה חיובית ידועה. לחץ על תפריט קובץ, שמור ולאחר מכן ייצא לקובץ CSV כדי לייצא את הכמויות של כל הבארות בקובץ טקסט המכיל ערכים מופרדים בפסיקים. לבסוף, ייבא את קובץ ה-CSV בתוכנת גיליון אלקטרוני וחשב את מספר הרצועות או התיקונים לכל 10 לששת ה-PBM על ידי הגדרת הנוסחה הבאה בהתאם.

הבדיקה המתוארת בסרטון זה בוצעה על מדגם מייצג של 87 בקרות בריאות. 42 ילדים בגילאי אפס עד 17 ו-45 מבוגרים בגילאי 24 עד 60. כפי שמוצג כאן, מספר הטרקים ירד בחדות עם הגיל עקב התפתחות בלוטת התימוס מאפס לשלוש עד ארבע שנים אצל מבוגרים.

מספר הטרק תלוי גם במגדר מכיוון שהוא יורד מהר יותר אצל גברים מאשר אצל נשים, מה שיכול להשפיע על היכולת לקבוע טווחי ייחוס מתאימים. גרפים אלה מראים שמספר הסדקים ירד עם הגיל, בדומה לדפוס שנראה עם T TREXs רק בילדים. ואילו אצל מבוגרים, תפוקת מח העצם יציבה למדי לאורך החיים ואינה תלויה במין.

הכנת הפלסמיד המשולשת בהכנסה דורשת כשבועיים-שלושה, אך לאחר מכן, הקצאות הפלסמיד המאוחסנות יחזיקו מעמד שלוש שנים. החלק הנותר של הטכניקה יכול להיעשות תוך ארבע עד חמש שעות בלבד אם מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לבצע את כל המניפולציות הקשורות לפלסמיד באזור ייעודי כדי למנוע זיהום צולב של ה-DNA.

כמו כן, חיוני לוודא את יציבות הצינור הסטנדרטי בעת ניתוח תוצאות לאחר פיתוחו. טכניקה זו סיפקה לחוקרים בתחום האימונולוגיה הקלינית או המטולוגיה, כלי משופר לזיהוי ליקויים חיסוניים ראשוניים כדי לנטר את התוצאה של בנייה מחדש של מערכת החיסון, לאחר השתלת מח עצם, או פשוט לחקור הומאוסטזיס לימפוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג את המשולש בפלסמיד, להכין את העקומה הסטנדרטית, להריץ את ניסוי ה-PCR בזמן אמת ולבצע את החישובים הדרושים כדי להשיג כימות מוחלט הניתן לשחזור של trax וסדקים.