בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית
October 31st, 2014
למצעי תרבית תאים המתפקדים עם דפוסים בקנה מידה מיקרו של ליגנדים ביולוגיים יש תועלת עצומה בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מדגימים את הייצור הרב-תכליתי והאוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי (אתילן גליקול) מרובות ומיקרו-דפוסיות המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מצעי תרבית רקמות עם מברשות PEG מרובות בתבנית מיקרו, המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים. זה מושג על ידי מערכי תצהיר של acan thiol, יוזם TRP על ידי הדפסת מיקרו מגע רובוטית על מצעים מצופים זהב. כשלב השני SI, TRP מבוצע על מצעי דפוס המיקרו, היוצר מברשות PEG עם קבוצות ברום סופיות.
לאחר מכן, קבוצות הברום הסופיות מתפקדות עם קבוצה ריאקטיבית כימית אחת או שתיים על מנת לאפשר ניוד IM של ליגנדים ביולוגיים שהוכנו כראוי. ואז כל התהליך חוזר על עצמו כדי לתפקד עם קבוצה כימית שנייה. התוצאות מראות מיקרו-מערכים של שתי מברשות PEG מתפקדות אורתוגונלית המונחות על גבי דיוק של 10 מיקרון.
זה מאומת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מותאמת אישית לאחר צימוד של הקבוצות התגובתיות עם מולקולות פלואורסצנטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות כמו הדפסת מיקרו מגע ידנית הוא שהדפסת מיקרו מגע רובוטית מסוגלת להניח שלבי הדפסה מרובים בדיוק מיקרון, תוך מתן גמישות מרבית ועיצוב מצע. הדיוק שמעניקה שיטה זו, יחד עם תגובות החלפה נוקלאופיליות עוקבות, מאפשר לנו ליצור מצעי תרבית רקמה המתפקדים עם ליגנדים ביולוגיים מרובים המסוגלים להפעיל שליטה זמנית ומרחבית על סולפט בקנה מידה מיקרוני
.לפני S-I-A-T-R-P, שקופית כריכה מצופה זהב הייתה צריכה להיות מעוצבת על ידי חותמת A-P-D-M-S. הליך נפוץ יחסית זה מוסבר בפרוטוקול טקסט. התחל בהסרת שקופית כיסוי הפטנט מהרובוט על ידי שחרור הוואקום.
לאחר מכן העבירו אותו לבקבוק באורך 50 מיליליטר sch, אטמו את הבקבוק ומרחו שואב שלילי של 30 PSI. לאחר מכן, הוסף 5.5 מיליליטר של תערובת תגובת TRP לבקבוק באמצעות מזרק ואחריו הוספת 0.5 מיליליטר של L נתרן אסקורבט במים גם באמצעות מזרק. שימו לב לשינוי הצבע של התגובה מירוק בהיר לחום כהה.
אפשר לתגובה להימשך 16 שעות תחת גז אינרטי. בסיום התגובה, הסר את שקופית הכיסוי ושטוף אותה באתנול, ואז במים ולאחר מכן שוב באתנול. ואז יבש אותו בעדינות עם חנקן.
המיקרו-מערך של מברשות P-E-G-M-E-M-A המושתלות צריך להיות גלוי לעין בלתי. השתמש במיקרוסקופיה כדי לחשוף את השינויים הללו בפירוט כדי לתפעל את Azad, שרשראות P-E-G-M-E-M-A. העבירו את שקופית כיסוי התבנית לבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר והוסיפו שישה מיליליטר של DMF המכיל 100 מילי-מולרי נתרן אזיד.
הניחו לתגובה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את שקופית כיסוי הפטנט באתנול וייבשו אותה תחת זרם חנקן עדין כדי להרגיע את שרשראות ה-P-E-G-M-E-M-A שנותרו מתפקדות ברום. העבירו את שקופית הכיסוי של דפוס המיקרו לבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר והוסיפו שישה מיליליטר של DMSO המכיל 100 מילי-מולרי אתנול אמין, ו-300 מילי-מולרי טריאתיל אמין.
אפשר לתגובה זו להימשך 24 שעות ב-40 מעלות צלזיוס למחרת. שוטפים את שקופית כיסוי התבנית באתנול ומייבשים אותה בעדינות מתחת לזרם חנקן. השלב הבא הוא לחזור על הדפסת מיקרו מגע הרובוט באמצעות חותמת PDMS שנייה ולאחר הטבעה.
השתמש שוב ב-SI A TRP כדי לשרטט את מברשת ה-PEG השנייה של מערך המיקרו. אז הגיע הזמן לתפעל את מערך המיקרו השני P-E-G-M-E-A שרשראות פרנסואה. כיסוי דפוס המיקרו.
החלק לתוך בקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר עם שישה מיליליטר של 100 מילי-מולארי פרופג אמין ב-DMF. תן לתגובה להימשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את שקופית כיסוי הפטנט באתנול וייבשו תחת זרם חנקן עדין.
שקופית עטיפת הפטנט מוכנה אז להתרוממות ביוטין. התחל בהנחת שקופית כיסוי המיקרו פטנט בבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר. ראשית, ביוטין אכל את שרשראות האצטילן.
הוסף שישה מיליליטר של סולפט נחושת עם אזיד PEG ארבע מצומד ביוטין לבקבוקון התגובה, ואחריו 1.2 מיליליטר של 0.15. חומצה רבית מילי-מולרית במים כדי לאתחל את התגובה, מבעבעים את התגובה בחנקן למשך 10 שניות. לאחר מכן אטמו את הבקבוקון עם פרפורם והניחו לתגובה למשך 24 שעות.
בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את שקופית הכיסוי במים והעבירו אותה לכלי פוליסטירן 12 בארות. ואז בטמפרטורת החדר ב-DPBS עם סרום חמור במשך שעה לאחר מכן, כתם בקבוצות הביוטין עם סטרפטוקוס DEIN 5 46 מצומד בשני מיקרוגרם למיליליטר בכתמי DPBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר שעתיים לאחר מכן. שטפו את שקופית הכיסוי ב-DPBS חמש פעמים עם צמחייה עדינה.
טובי ITIN aate את השרשראות שהסתיימו. הכניסו את החלקת הכיסוי לבאר של צלחת פוליסטירן בת שש בארות ומרחו שני מיליליטר של DPBS המכילים 20 מיקרו-מולרי D-B-C-O-P-G ארבעה ביוטין. לאחר מכן דגרו על מגלשת הכיסוי למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר 24 שעות לאחר מכן.
שוטפים את שקופית הכיסוי כמו לפני ארבע ומכתימים אותה בסטרפטווידין 4 88. מצומד בשני מיקרוגרם למיליליטר ב-DPBS. שעתיים לאחר מכן.
שטפו שוב את שקופית הכיסוי ולאחר מכן צלמו אותה במיקרוסקופיה. שימוש בפרוטוקול הדפסת מיקרו מגע רובוט זה. מערך מעוצב במדויק של ממשק משתמש ANN של מברשת PEG עם קבוצות אלקין טרמינליות עוצב בתוך מערך נפרד של ממשק משתמש ANN של מברשת PEG גדולה יותר עם קבוצות azi מסוף.
ההתפלגות המרחבית של קבוצות אזיד ואלקין נצפתה באמצעות כימיית הקליק וקשירת סטרפטווידין של בדיקות פלואורסצנטיות. שכבת-על של שני ערוצי הפלואורסצנט מראה כיצד הבולים לא חופפים. דיוק היישור חושב כפחות מ-10 מיקרון, שהוא בגבולות ה-SCAR.
מערכת המשמשת להדפסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מצעי תרבית רקמות מותאמים אישית באמצעות הדפסת מיקרו מגע רובוטית כדי לכסות מערכי מברשות יתד מרובים. פונקציונלי עם כימיה אורתוגונלית.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הזה מדגים ייצור אוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי(אתילן גליקול) (PEG) מיקרו-מעוצבות. מברשות אלו מציגות כימיות אורתוגונליות המאפשרות קיבוע מרחבי מדויק ומיקומי של ליגנדים ביולוגיים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- חומרים ביולוגיים
- מחוללת מיקרו
רקע
- מצעי תרבית תאים חיוניים ליישומים בהנדסת רקמות.
- מיקרו-תבנית מאפשרת שליטה מדויקת על הצגת הליגנדים.
- מברשות PEG הם חומרים רב-תכליתיים לפונקציונליזציה.
- כימיות אורתוגונליות מאפשרות שינויים משטח מורכבים.
מטרת המחקר
- ליצור מצעי תרבית רקמות עם מברשות PEG מיקרו-מעוצבות מרובות.
- לאפשר קיבוע מיקומי של ליגנדים ביולוגיים.
- להדגים את אוטומציה של תהליך הייצור.
שיטות ששימשו
- הדפסה מיקרו-מגעית רובוטית של acan thiol על מצעים מצופים זהב.
- פולימריזציה רדיקלית של העברת אטומים בשיטת SI-ATRP רציפה כדי ליצור מברשות PEG.
- פונקציונליזציה של קבוצות ברום טרמינליות עם קבוצות כימיות תגובתיות.
- חזרה על התהליך להשגת פונקציונליזציה כפולה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של מיקרו-מערכים עם שתי מברשות PEG פונקציונליות אורתוגונליות.
- דיוק חפיפה של 10 מיקרונים הושג.
- הוכחה לרב-תכליתיות בפונקציונליזציה של מצעים.
- אפשר קיבוע ליגנדים מדויק מבחינה מרחבית.
מסקנות
- השיטה מאפשרת שינויים משטח מורכבים בהנדסת רקמות.
- תהליכים אוטומטיים משפרים את הניתנות לחזרה ואת היעילות.
- יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
