Name: בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: חקור ייצור אוטומטי של מצעי תרבית רקמה עם מברשות PEG ממוקדות מיקרוסקופית. השיטה מאפשרת קיבוע מרחבי מדויק של ליגנדים ביולוגיים באמצעות הדפסת מיקרו-מגע רובוטית ופולימריזציה רדיקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון לעבודה זו, GTK, TK ו-JDM סופקו על ידי מכון ויסקונסין לגילוי וקרן המחקר של בוגרי ויסקונסין.

<ol><li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology%3A+Current+Applications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li>
<li>Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li>
<li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Pursuit+of+Zero%3A+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li>
<li>Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click%E2%80%9D+Chemistry+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Click” Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li>
<li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li>
<li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li>
<li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD%E2%80%94Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li>
<li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li>
<li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Self-Assembled+Monolayers%3A+Efficient%2C+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li>
<li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Fouling%E2%80%9D+Oligo%28ethylene+glycol%29-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li>
<li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li>
<li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).</li>
<li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+robotic+microcontact+printing+%28R-%CE%BCCP%29+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li>
<li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo%28ethylene+glycol%29+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li>
<li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li>
<li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283%2B2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

מצעים אידיאליים עבור הנדסת רקמות יהיו bioinspired ובכך לשחזר את ההתפלגות המרחבית של ביו הליגנדים קריטיים נמצאים בתוך הרקמות המקומיות. הם גם היו בעלי תכונות דינמיות המאפשרות התאמות זמניות של הליגנדים ודפוסי המרחב שבו הם מוצגים כדי לאפשר המורפוגנזה רקמה ביימה ומרחבית מוגבלת אינדוקציה של גורל תא. ייצור של מצעים כזה דורש הקיבוע של רמזים ביוכימיים רבים בכיוונים מורכבים והורה מאוד על מצעים. בעוד מדמים את כל הגורמים במשק של הנישה של תאים במבחנה אינו סביר, מערכת R-μCP המתוארת כאן...

היכולת של משטחים מורכבים-PEG להציג הליגנדים ביוכימיים קוולנטית כרוכים בו-זמנית, תוך שמירה על מאפייני עכירות שאינן טבועים להפוך אותם בחירה אידיאלית עבור סביבות מיקרוסקופיות מותאמות אישית הנדסה על מצעי תרבות 1,2,3. אינטראקציות biospecific מתווכות על ידי מברשות PEG יגנד מצומדות מאפשרת ניתוח מצמצם של ההשפעות של יוכימיים רמזים שנמצאו בתוך מתחם במייקרו-סביבות רקמות vivo על פנוטיפים תא בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש chemistries &quot;לחץ&quot; ביו-מאונך כדי להקל על חוסר תנועה כיוונית של הליגנדים, כך שהם מוצגים בתצורות ילידי 4-6. כך, דפוסים מרחביים מיקרוסקופים של PEG מברשות הוא כלי תכליתי ליצירת מעצב בנישות מבחנה לחקור איתות תא הנגרמת על ידי רמזים ביוכימיים משותקים 6,7. שיטה נפוצה ליצירת תבניות המרחביות של מ&quot;ק ביוכימייםes כרוך מצעים מצופים זהב הדפסת microcontact (μCP) עם דפוסי alkanethiols מצומדות PEG. ואז, monolayers micropatterned העצמי התאספו (טילי הקרקע-האוויר) של alkanethiols ylated-PEG מגביל ספיחה פיזית של מולקולות ביוכימיות, למשל, חלבונים, רק לאזורים בדוגמת שאינה של המצע 8,9. עם זאת, טילי הקרקע-האוויר שנוצרו על ידי טכניקה זו הן רגישות לחמצון בתרבית תאי תקשורת לטווח ארוך. כך, μCP&#39;d alkanethiol טילי הקרקע-האוויר לעתים קרובות מורכב עוד יותר עם ​​מברשות פולימר PEG באמצעות פילמור הרדיקלי העברת אטום ביוזמת פני השטח (SI-ATRP) כדי להגביר את היציבות שאינה מזהמת את האזור 10. באופן ספציפי, μCP של יוזם פילמור alkanethiol, bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl, על משטחים מצופים זהב ואחריו SI-ATRP של פולי (אתילן גליקול) methacrylate אתר מתיל (PEGMEMA) מונומרים יוצר משטחים עם טווח ארוך micropatterned, יציב, ושאינה עכירות PEG מברשות. יתר על כן, אלה<html> הם מסוגלים להיות שונה יותר להציג moieties הכימית מגוון 11. ניצול של נכס זה, שא et. אל. פיתח שיטה להנדס מצעי תרבות עם מברשות PEGMEMA multicomponent הצגת chemistries &quot;לחץ&quot; מאונך. בשיטה זו, הם משתמשים בסדרה של צעדי μCP / SI-ATRP ביניהם אזיד הנתרן רציף, ethanolamine, וpropargylamine החלפות nucleophilic ליצור מצעי תרבות מציגים דפוסים מיקרוסקופים של הליגנדים משותקים מרובים 6. בעוד שהפוטנציאל של שימוש chemistries כזה בשיתוף עם μCP מדריך ללהנדס מצעי תרבות רומן הוא עצום, הוא מוגבל על ידי הדיוק ואת הדיוק שבה ניתן ליישר צעדי μCP מרובים על מצע אחד. רמה גבוהה של דיוק ודיוק היה נדרשת לייצור reproducibly מורכב בנישות מבחנה תוך שימוש בטכניקות מגוונות אלה. e_content &quot;&gt; כדי לטפל במגבלה זו, מספר מערכות μCP אוטומטית וחצי אוטומטי שנוצרו. צ&#39;אקרה et. al. פיתחו מערכת μCP בי בולים מותאמים אישית מונחים על מערכת רכבות והביאו במגע קונפורמי עם מגלשות מצופים זהב באמצעות מפעיל פנאומטי מבוקרת מחשב. עם זאת, שיטה זו דורשת ייצור המדויק של עיצובי בולים מותאמים אישית ומדווח 10 מיקרומטר דיוק ללא דו&quot;ח של הדיוק שהושג בעת ביצוע μCP מרובה השלבים 12. לאחרונה, שיטת ניצול מערכת צימוד kinematic משולבת דיוק שדווח להלן 1 מיקרומטר באמצעות דפוס בודד, אבל לא הצליחו ליישר במדויק דפוסים מרובים בשל חוסר השליטה מדויקת של תכונות חותמת מעובש לעצב 13. בנוסף, בשתי השיטות הקודמות דורשים מצע ליישארו קבועים בין צעדי דפוסים , וכך להגביל את מגוון chemistries שינוי פני השטח שיכול להיות משמעותימנוצל. כאן, אנו מתארים מערכת R-μCP אוטומטית מסוגל יישור מדויק ומדויק של צעדי μCP מרובים תוך מתן גמישות מירבית בעיצוב בולים וייצור. יתר על כן, מצעים בדוגמת ניתן להסיר שוב ושוב מהמערכת בין stampings, ובכך לאפשר את שימוש בchemistries שינוי המצע מגוון, כוללים החלפות nucleophilic רציפות. מצעים שהונדסו בשיטות chemistries כזה כבר נעשו שימוש בתרבית תאים בעבר על ידי שנינו 6,14 ואחרים 7. כך, יש לנו התמזגו R-μCP ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות לפתח שיטה לייצור להרחבה של מצעי תרבות עם רמזים ביוכימיים מורכבים וmicropatterned.

<table><tbody><tr><td>סקארה&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>דגמים מתקדמים יותר עם דיוק מוגבר זמינים במידת הצורך.&nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי. בעת סילאן ופלים, אף אחד לא צריך להיכנס למכסה המנוע עד שכל הסילאן התאדה.</td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>מסירה תמיסות באמצעות חשיפה בוואקום לפני השימוש. ערכות חלופיות כגון ערכה 182 מקובלות.</td></tr><tr><td>24 מ"מ x 50 מ"מ #1 כיסוי זכוכית שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>48393106</td><td>ניתן לרכוש אותם ממספר ספקים במידות משתנות בהתאם לצורך.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark מאייד קרן אלקטרונים</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>דרישות הכשרה מיוחדת.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יוזמי ATRP אחרים עשויים לשמש כ-R-&mu זה; פלטפורמת CP ישימה לכל שיטות המיקרו-דפוס.</td></tr><tr><td>בקבוק צינור שלנק 50 מ"ל</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>דורש פקקי גומי עם דיאפרם.</td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר מתאקרילט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>447943</td><td>נשלח המכיל מעכבי קריאה ללא MEHQ ו-BHT.</td></tr><tr><td>מתנול (מאושר ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>נחושת (II) ברומיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>437867</td><td>זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.</td></tr><tr><td>נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל בקבוקוני נצנוץ זכוכית בורוסיליקט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2002</td><td>זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.</td></tr><tr><td>N,N-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>398136</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>טריאתילאמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T0886</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>276855</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>פרופרג'ילמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P50900</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>200 הוכחת אתנול</td><td>שירותי הפצת חומרים של אוניברסיטת ויסקונסין</td><td>2292</td><td>זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>מסיס ב-DMF</td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C1297</td><td>זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>פריטים מזוהמים בסרום חמור נחשבים לחומר מסוכן ביולוגית ויש להשליך אותם בהתאם. תרכובות שונות אחרות (למשל BSA) זמינות ומשרתות מטרה זו.</td></tr><tr><td>צלחת פוליסטירן 12 בארות</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>ניתן לרכוש צלחות ממספר ספקים במידות שונות.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-ביוטין</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>מסיס ב-DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>מסיס ב-PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>מסיס ב-PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon Nikon</td><td>Eclipse Ti, A1R</td><td>מספיק מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לדמות מצעים מיקרו-דפוסיים פונקציונליים.</td></tr></tbody></table>

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (r-μcp) והתמר נוקלאופילית סדרתית

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

בהנדסת רקמות, רצוי להפגין שליטה מרחבית במורפולוגיה של רקמות וגורל תאים בתרבית בקנה מידה מיקרוני. ניתן להשתמש במצעי תרבית המציגים מברשות פולי (אתילן גליקול) (PEG) מושתלות כדי להשיג משימה זו על ידי יצירת אזורים עמידים להידבקות תאים בקנה מידה מיקרו, שאינם עכירות והידבקות תאים, כמו גם אזורים שבהם תאים משתתפים באינטראקציות ביו-ספציפיות עם ליגנדים קשורים קוולנטית. כדי להנדס רקמות מורכבות באמצעות מצעים כאלה, יהיה צורך לעצב ברצף מברשות PEG מרובות המתפקדות כדי להעניק ביו-אקטיביות דיפרנציאלית ומיושרות בכיוונים מיקרו-סקאליים המחקים נישות in vivo. הדפסת מיקרו-מגע (μCP) היא טכניקה רב-תכליתית לעיצוב מברשות PEG מושתלות כאלה, אך לא ניתן לבצע μCP ידני בדיוק בקנה מידה מיקרו. לפיכך, שילבנו רובוטיקה מתקדמת עם טכניקות ליתוגרפיה רכה ותגובות כימיות מתפתחות של פני השטח כדי לפתח שיטה רובוטית בסיוע הדפסת מיקרו-מגע (R-μCP) לייצור מצעי תרבית עם דפוסים מורכבים, מיקרו-סקאליים ומסודרים מאוד של מברשות PEG המציגות כימיה אורתוגונלית של 'קליק'. כאן, אנו מתארים בפירוט את זרימת העבודה לייצור מצעים כאלה.

השימוש בטכניקות μCP היישור ידניים להנדס מצעי תרבות עם מערכים של מברשות שהושתלו PEG פונקציונליות עם מאונך "לחץ" chemistries הוכח בעבודות קודמות 6. עם זאת, זה מציע שליטה מינימאלית של התמצאות דפוס ולעתים קרובות תוצאות חפיפה של התחומים פונקציונליות. כאן, מערכת R-μCP רומן משמשת כדי להתגבר על מגבלה זו, ואת יכולתו בצורה מדויקת תבנית מערך של annuli מברשת PEG עם 300 מיקרומטר מזהה ו -600 OD מיקרומטר הצגת קבוצות alkyne מסוף בתוך מערך נפרד של annuli מברשת PEG עם 600 מיקרומטר OD ID ...

למצעי תרבית תאים המתפקדים עם דפוסים בקנה מידה מיקרו של ליגנדים ביולוגיים יש תועלת עצומה בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מדגימים את הייצור הרב-תכליתי והאוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי (אתילן גליקול) מרובות ומיקרו-דפוסיות המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים.

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מצעי תרבית רקמות עם מברשות PEG מרובות בתבנית מיקרו, המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים. זה מושג על ידי מערכי תצהיר של acan thiol, יוזם TRP על ידי הדפסת מיקרו מגע רובוטית על מצעים מצופים זהב. כשלב השני SI, TRP מבוצע על מצעי דפוס המיקרו, היוצר מברשות PEG עם קבוצות ברום סופיות.לאחר מכן, קבוצות הברום הסופיות מתפקדות עם קבוצה ריאקטיבית כימית אחת או שתיים על מנת לאפשר ניוד IM של ליגנדים ביולוגיים שהוכנו כראוי. ואז כל התהליך חוזר על עצמו כדי לתפקד עם קבוצה כימית שנייה. התוצאות מראות מיקרו-מערכים של שתי מברשות PEG מתפקדות אורתוגונלית המונחות על גבי דיוק של 10 מיקרון.זה מאומת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מותאמת אישית לאחר צימוד של הקבוצות התגובתיות עם מולקולות פלואורסצנטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות כמו הדפסת מיקרו מגע ידנית הוא שהדפסת מיקרו מגע רובוטית מסוגלת להניח שלבי הדפסה מרובים בדיוק מיקרון, תוך מתן גמישות מרבית ועיצוב מצע. הדיוק שמעניקה שיטה זו, יחד עם תגובות החלפה נוקלאופיליות עוקבות, מאפשר לנו ליצור מצעי תרבית רקמה המתפקדים עם ליגנדים ביולוגיים מרובים המסוגלים להפעיל שליטה זמנית ומרחבית על סולפט בקנה מידה מיקרוני.לפני S-I-A-T-R-P, שקופית כריכה מצופה זהב הייתה צריכה להיות מעוצבת על ידי חותמת A-P-D-M-S. הליך נפוץ יחסית זה מוסבר בפרוטוקול טקסט. התחל בהסרת שקופית כיסוי הפטנט מהרובוט על ידי שחרור הוואקום.לאחר מכן העבירו אותו לבקבוק באורך 50 מיליליטר sch, אטמו את הבקבוק ומרחו שואב שלילי של 30 PSI. לאחר מכן, הוסף 5.5 מיליליטר של תערובת תגובת TRP לבקבוק באמצעות מזרק ואחריו הוספת 0.5 מיליליטר של L נתרן אסקורבט במים גם באמצעות מזרק. שימו לב לשינוי הצבע של התגובה מירוק בהיר לחום כהה.אפשר לתגובה להימשך 16 שעות תחת גז אינרטי. בסיום התגובה, הסר את שקופית הכיסוי ושטוף אותה באתנול, ואז במים ולאחר מכן שוב באתנול. ואז יבש אותו בעדינות עם חנקן.המיקרו-מערך של מברשות P-E-G-M-E-M-A המושתלות צריך להיות גלוי לעין בלתי. השתמש במיקרוסקופיה כדי לחשוף את השינויים הללו בפירוט כדי לתפעל את Azad, שרשראות P-E-G-M-E-M-A. העבירו את שקופית כיסוי התבנית לבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר והוסיפו שישה מיליליטר של DMF המכיל 100 מילי-מולרי נתרן אזיד.הניחו לתגובה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את שקופית כיסוי הפטנט באתנול וייבשו אותה תחת זרם חנקן עדין כדי להרגיע את שרשראות ה-P-E-G-M-E-M-A שנותרו מתפקדות ברום. העבירו את שקופית הכיסוי של דפוס המיקרו לבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר והוסיפו שישה מיליליטר של DMSO המכיל 100 מילי-מולרי אתנול אמין, ו-300 מילי-מולרי טריאתיל אמין.אפשר לתגובה זו להימשך 24 שעות ב-40 מעלות צלזיוס למחרת. שוטפים את שקופית כיסוי התבנית באתנול ומייבשים אותה בעדינות מתחת לזרם חנקן. השלב הבא הוא לחזור על הדפסת מיקרו מגע הרובוט באמצעות חותמת PDMS שנייה ולאחר הטבעה.השתמש שוב ב-SI A TRP כדי לשרטט את מברשת ה-PEG השנייה של מערך המיקרו. אז הגיע הזמן לתפעל את מערך המיקרו השני P-E-G-M-E-A שרשראות פרנסואה. כיסוי דפוס המיקרו.החלק לתוך בקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר עם שישה מיליליטר של 100 מילי-מולארי פרופג אמין ב-DMF. תן לתגובה להימשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את שקופית כיסוי הפטנט באתנול וייבשו תחת זרם חנקן עדין.שקופית עטיפת הפטנט מוכנה אז להתרוממות ביוטין. התחל בהנחת שקופית כיסוי המיקרו פטנט בבקבוקון תגובת זכוכית של 20 מיליליטר. ראשית, ביוטין אכל את שרשראות האצטילן.הוסף שישה מיליליטר של סולפט נחושת עם אזיד PEG ארבע מצומד ביוטין לבקבוקון התגובה, ואחריו 1.2 מיליליטר של 0.15. חומצה רבית מילי-מולרית במים כדי לאתחל את התגובה, מבעבעים את התגובה בחנקן למשך 10 שניות. לאחר מכן אטמו את הבקבוקון עם פרפורם והניחו לתגובה למשך 24 שעות.בטמפרטורת החדר למחרת, שטפו את שקופית הכיסוי במים והעבירו אותה לכלי פוליסטירן 12 בארות. ואז בטמפרטורת החדר ב-DPBS עם סרום חמור במשך שעה לאחר מכן, כתם בקבוצות הביוטין עם סטרפטוקוס DEIN 5 46 מצומד בשני מיקרוגרם למיליליטר בכתמי DPBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר שעתיים לאחר מכן. שטפו את שקופית הכיסוי ב-DPBS חמש פעמים עם צמחייה עדינה.טובי ITIN aate את השרשראות שהסתיימו. הכניסו את החלקת הכיסוי לבאר של צלחת פוליסטירן בת שש בארות ומרחו שני מיליליטר של DPBS המכילים 20 מיקרו-מולרי D-B-C-O-P-G ארבעה ביוטין. לאחר מכן דגרו על מגלשת הכיסוי למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר 24 שעות לאחר מכן.שוטפים את שקופית הכיסוי כמו לפני ארבע ומכתימים אותה בסטרפטווידין 4 88. מצומד בשני מיקרוגרם למיליליטר ב-DPBS. שעתיים לאחר מכן.שטפו שוב את שקופית הכיסוי ולאחר מכן צלמו אותה במיקרוסקופיה. שימוש בפרוטוקול הדפסת מיקרו מגע רובוט זה. מערך מעוצב במדויק של ממשק משתמש ANN של מברשת PEG עם קבוצות אלקין טרמינליות עוצב בתוך מערך נפרד של ממשק משתמש ANN של מברשת PEG גדולה יותר עם קבוצות azi מסוף.ההתפלגות המרחבית של קבוצות אזיד ואלקין נצפתה באמצעות כימיית הקליק וקשירת סטרפטווידין של בדיקות פלואורסצנטיות. שכבת-על של שני ערוצי הפלואורסצנט מראה כיצד הבולים לא חופפים. דיוק היישור חושב כפחות מ-10 מיקרון, שהוא בגבולות ה-SCAR.מערכת המשמשת להדפסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מצעי תרבית רקמות מותאמים אישית באמצעות הדפסת מיקרו מגע רובוטית כדי לכסות מערכי מברשות יתד מרובים. פונקציונלי עם כימיה אורתוגונלית.

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 יכול להיות מונחה על ידי CRNA RNA (CRRNA) שתוכנן במיוחד כדי לדבוק DNA כפול תקועים באתרים הרצוי, יצירת הקצוות דביקים. בהתבסס על מאפיין זה, תקן DNA הרכבה (C-Brick) הוקמה, ופרוטוקול המפרט את השימוש שלה מתואר כאן.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

במאמר זה, אנו מציגים ולדון התפתחויות חדשות סינתזה ויישומים של חומצות גרעין מיקרומערכים מפוברק באתרו. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד הפרוטוקולים לסינתזה DNA ניתן להרחיב RNA וכיצד מיקרו מערכים ניתן להשתמש כדי ליצור לאחזור ספריות גרעין של חומצה.

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

חקור ייצור אוטומטי של מצעי תרבית רקמה עם מברשות PEG ממוקדות מיקרוסקופית. השיטה מאפשרת קיבוע מרחבי מדויק של ליגנדים ביולוגיים באמצעות הדפסת מיקרו-מגע רובוטית ופולימריזציה רדיקלית.

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

גלה סרטונים נוספים