Name: שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו שיטה ניתוחית לאוזן הפנימית לשם משלוח ויראלי ישיר דרך ממברנת החלון העגול בעכבר. טכניקה זו ממזערת איבוד דם ותמותה, ומאפשרת טיפול גנטי בקוכליאה עם ביטוי טרנסגן מוצלח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק R21 מהמכונים הלאומיים לבריאות ועל ידי מענק מ-Hearing Research, Incorporated.

הערה: כל טיפול הנהלים ובעלי חיים עמד בהנחיות האתיקה NIH ודרישות פרוטוקול שאושרו בוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. 1. הכנת בעלי החיים לכירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוחים בחלל נקי, מסור. החיטוי כל מכשירי הניתוח, לעקר עם מעקר חרוזי זכוכית לפני הניתוח. הערה: בפרוטוקול זה, להשתמש ביום לידה 10-12 עכברי FVB (P10-12). גילים וזנים של עכברים שונים יכולים לשמש כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. עכברים מבוגרים יותר מP40 יכולים להיות מאתגרים, כי עצם הבולה נהיה קשה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ&quot;ג / קילוגרם), hydrochloride xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם), וacepromazine (2 מ&quot;ג / קילוגרם). בגין הכנה כירורגית רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן. אם necessary, לנהל מנת דחף (חמישית במינון המקורי) של קוקטייל ההרדמה כדי לשחזר את המטוס המקורי ההרדמה. הערה: הקפד בשלב זה משום שרוב התמותה שנצפתה בגיל זה נגרם על ידי מנת יתר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את עיניו של בעל החיים עם משחת עיני מגן כדי לשמור על העיניים לחות במהלך הרדמה, דיכוי רפלקס המצמוץ של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר עם הצוואר המורחב על כרית חימום לאורך כל ההליך עד לעכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את אזור פוסט-אוזן השמאל עם קליפר ולחטא עם אתנול 70% וpovidone- יוד לפני מניפולציה כירורגית. </li></ol> 2. הליך כירורגי והזרקת וקטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגישת פוסט-תנוכים לחשוף את הבולה התוף. לחתוך את הרקמה התת עורית עם מספריים קטנים לחשוף את השרירים פוסט-אוזן. לאחר חוזר בי רקמת שומן הצד אחורי דואר של החתך, להפריד את השרירים בצד הימין וצד שמאל ניצב לחתך על מנת לחשוף את העצם הטמפורלית. ודא שחתך זה מספיק זמן כדי לעבוד בנוחות עם הדמיה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב הבולה התוף עם מחט 25 G ולהרחיב את החור במידת צורך עם מלקחיים על ידי קילוף העצם אחורי כדי לאפשר גישה לתורו הבסיסי של השבלול, ולאחר מכן להרחיב במידה מספקת כדי להמחיש את עורק stapedial וחלון העגול הקרום (RWM) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את RWM בעדינות במרכז עם טפטפת נימי ורוסיליקט. שים לב בזרימת נוזל דרך RWM בשלב זה; זה נורמלי. חכה עד שהזרימה התייצבה (נוזל effluxed מהשבלול הוא מיובש עם נייר סינון סטרילי). הערה: היזהר בעת ההחזקה וקידום מחט הזכוכית כך שניקוב RWM הוא קטן ככל האפשר. בהתאם למיקרוסקופ משמש, להחזיק טפטפות באמצעות micromanipulator או ביד בעזרת פיפטהבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טפטפות להזרקה באמצעות פיפטה חולץ אותו טפטפות מהדק תיקון הדרך מוכנה. ודא שקוטר הקצה הוא גדול (15 מיקרומטר על קוטר), כך שpipetting הווירוס פנימה והחוצה נעשה בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 1 עד 2 μl של AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP או AAV2-GFP לפיפטה הזרקה. לאחר הזרימה הוא התייצב (5 עד 10 דקות), microinject כרך זה קבוע להלמות scala דרך אותו החור שנעשה בעבר בRWM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הנישה RW מהירות לאחר שהפילה את פיפטה עם תקע קטן של שרירים ולאבטח אותו עם טיפה קטנה של דבק רקמות מונחת על השרירים כדי למנוע דליפה מהחלון העגול. הערה: חותם החור הזה היטב לאחר המחט מוסרת עם תקע קטן של שרירים כדי למנוע כל דליפת perilymph מהשבלול זה הצעד חיוני כדי לשמור על שמיעה. הכישלון לאטום לחלוטין RWM יגרום לאובדן שמיעה לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, לכסותחור בבולה השמיעתית עם רקמת שומן, להחזיר את השרירים שלאחר אוזן ורקמת שומן למצב הרגיל שלהם ותפר את הפצע בשכבות עם תפר נספג כרום 6-0 או קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפצע עם povidone- יוד. </li></ol> 3. לאחר ניתוח טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכברים בכלוב חם ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם התאוששו באופן מלא ולאחר מכן לחזור עם האמא שלהם. מומלץ להסיר את הזכר מהכלוב לפני שהכניס את הגורים בחזרה עם אמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל carprofen תת-עורי (2 מ&quot;ג / קילוגרם) על כאבים לאחר הניתוח ובכל שעה 24 ואילך במשך 3 ימים, כדי לנהל את הדלקת וכאב. לפקח על בעלי החיים מדי יום בחיפוש אחר סימנים של מצוקה, ירידה במשקל נורמלית, כאב, או זיהום. בדרך כלל מהיום ליום 3 rd לאחר הניתוח כל העכברים יש לפעול כרגיל. אם כל סימני מצוקה או מחלה מופיעים בעכבר לאחר יום 3 rd, לשקול הרדמת חסד tהוא העכבר בהתאם להנחיות מוסדיות. </li></ol> 4. הערכה של תפקוד שבלול בעקבות משלוח ויראלי שימוש שמיעתי בגזע מוח תגובת הקלטות (ABR) הערה: הבדיקה ABR (ABR) היא שמיעתי עורר פוטנציאלי המופק מפעילות חשמלית במוח מתמשכת ונרשמו באמצעות אלקטרודות המונחות מתחת לקרקפת. בעלי החיים מגורה עם קול. ההקלטה וכתוצאה מכך מורכבת מחמישה גלים המשקפים את הפעילות החשמלית של נקודות רצופות במסלול השמיעה בראשונה 10 האלפיות השניים לאחר תחילתה של גירוי שמיעתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על כרית חימום לאורך כל בדיקת השמיעה עד העכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה. הערה: שימוש בגירויי הקול הבאים בניסוי זה: לחצו (5 אלפיות שני משך; מצגת שיעור Hz 31). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אלקטרודות מחט subdermal בקודקוד, מתחת לאפרכסת אוזן השמאל (הפניה), ומתחת לאוזן הנגדית (קרקע) ולהתחיל ABRs הקלטה כפי שתואר לעיל בתא אטום לרעש 27,28. גל ABR שיא ב 5 מרווחי רמת לחץ קול dB למטה ממשרעת המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ספי ABR לאחר הניתוח מוקדם ככל 4 ימים לאחר לידה נגיפית הערה: סף מוגדר כרמת הגירוי הנמוכה ביותר שבי תגובת פסגות לגלים I-V היו ברור ובהווה שוב ושוב על בדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד Wave אני לנתח את הפעילות מעצב השבלול. רמת הגירוי הנמוכה ביותר שמניבה צורת גל ABR לזיהוי מוגדרת כסף. </li></ol> 5. ביטוי חלבון השבלול transgene שימוש Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי מינון יתר של intrapהזרקת eritoneal מתערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את הראש רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את cochleae החוצה ותהליך לimmunofluorescence הר-שלם, כמתואר 26. פרוטוקול מפורט של immunofluorescence-הר השלם שבלול באמצעות אנטי VGLUT3 ונוגדני 7 א אנטי-שרירן מתואר בעקיל et al., 2013 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג GFP, דגירה כל-mounts שבלול הלילה ב 4 ° C עם נוגדן אנטי GFP ארנבת ב 1: 250 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את cochleae פעמיים במשך 10 דקות עם PBS ולאחר מכן דגירה של 2 שעות בIgG נגד הארנב העז המוצמד לCy2 בדילול 1: 4,000 ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את cochleae עם PBS פעמיים במשך 10 דקות ודגירתם עם DAPI במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cochleae בשקופיות זכוכית ולהתבונן undאה מיקרוסקופ עם immunofluorescence confocal. </li></ol>

<ol><li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Nam, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+adeno-associated+virus+serotype+8%2C+a+gene+therapy+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector.</a> J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).</li>
<li>Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+targeting+for+cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cellular targeting for cochlear gene therapy.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).</li>
<li>Xia, L., Yin, S., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+gene+trasfection+in+neonatal+mice+using+adeno-associate+viral+vwctor%3A+a+comparison+of+two+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches.</a> PLoS One. 7 (8), e43218(2012).</li>
<li>Husseman, J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+the+inner+ear+using+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22AdvOtorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors.</a> AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).</li>
<li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+transduction+of+cochlear+supporting+cells+by+adeno-associated+virus+serotype+5%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5.</a> Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).</li>
<li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vectors+for+improved+gene+delivery+to+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Re%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear.</a> Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).</li>
<li>Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+therapy%3A+the+art+of+turning+infectious+agents+into+vehicles+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics.</a> Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+and+Stem+Cell+Transplantation%3A+Strategies+for+Hearing+Restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).</li>
<li>Cooper, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+delivery+of+the+caspase+inhibitor+XIAP+protects+against+cisplatin+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Otol.+Neurotol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity.</a> Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).</li>
<li>Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+cisplatin+and+noise+on+the+peripheral+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system.</a> Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).</li>
<li>Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Transfer+in+Human+Vestibular+Epithelia+and+the+Prospects+for+Inner+Ear+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy.</a> Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).</li>
<li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li>
<li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovector-mediated+hair+cell+regeneration+is+affected%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected.</a> Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).</li>
<li>Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+to+study+inner+ear+development+and+hereditary+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).</li>
<li>Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexins+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">The role of connexins in human disease.</a> Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).</li>
<li>Cohen-Salmon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+connexin26+in+the+inner+ear+epithelial+gap+junction+network+causes+hearing+impairment+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death.</a> Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).</li>
<li>Nickel, R., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+connexins+in+the+inner+ear%3A+their+roles+in+homeostasis+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+hereditary+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human hereditary deafness.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).</li>
<li>Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss%3A+mechanisms+revealed+by+genetics+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).</li>
<li>Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+genetics+of+deafness+illuminates+auditory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">How the genetics of deafness illuminates auditory physiology.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).</li>
<li>Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surgical+approach+appropriate+for+targeted+cochlear+gene+therapy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse.</a> Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).</li>
<li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+deafness+and+altered+cochlear+innervation+in+knock-out+mice+lacking+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin.</a> J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).</li>
<li>Fremeau, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transporters+1+and+2+target+to+functionally+distinct+synaptic+release+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites.</a> Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).</li>
<li>Akil, O., Lustig, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cochlear+Whole+Mount+Immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence.</a> Bio-protocol. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332">http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332</a> (2013).</li>
<li>Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlea+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Iizuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+delivery+of+transgene+via+adeno-associated+virus+into+supporting+cells+of+the+neonatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea.</a> Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).</li>
<li>Kilpatrick, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+into+the+scala+media+of+the+normal+and+deafened+adult+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear.</a> Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).</li>
<li>Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+Ear+Transgene+Expressionafter+Adenoviral+Vector+Inoculation+in+the+Endolymphatic+Sac+Hum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum.</a> Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).</li>
<li>Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+preservation+after+inner+ear+gene+therapy%3A+the+effect+of+vector+and+surgical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J.+Otorhinolaryngol.+Relat.+Spec%22%5BJournal%5D)">Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach.</a> ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).</li>
<li>Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cochleaostomy+and+intracochlear+infusion+on+auditory+brain+stem+response+threshold+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Otol%22%5BJournal%5D)">The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig.</a> Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).</li>
<li>Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Functional+and+Structural+Outcome+of+Inner+Ear+Gene+Transfer+via+the+Vestibular+and+Cochlear+Fluids+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice.</a> Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).</li>
<li>Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+for+gene+transfer+studies+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea.</a> Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).</li>
<li>Lalwani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li>
<li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li>
<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

בעבודה זו, אנו מתארים בפירוט טכניקה שיכול לשמש לריפוי גנטי שבלול, במטרה להחזיר או הצלת פונקצית שמיעה נורמלית שנפגעה על ידי פגם גנטי. כפי שהוא בדרך כלל atraumatic, גישה זו היא בטוחה להעברת גני שבלול או טיפולים מולקולריים פוטנציאליים אחרים 30. גישות אחרות לטיפול שבלול תוארו, כולל גישת הגחון 24, cochleostomy 31,32 וצק endolymphatic משלוח 33 עכבר וחזיר ים ב. מניסיוננו, גישת פוסט-אוזן היא מהיר יותר, פשוטה יותר, וקשור עם פגיעה מופחתת ותמותה של...

ריפוי גנטי כבר הציע ארוך כטיפול פוטנציאלי לאובדן שמיעה גנטי, אבל הצלחה בתחום זה נותרת חמקמקה 1. עד כה, מתודולוגיות תיווך באופן ויראלי גברו בשל היכולת התיאורטית למקד סוגי תאים מסוימים בתוך השבלול יחסית נגיש. אדנווירוס שניהם (AV) ונגיף adeno הקשורים (AAV) היה בשימוש למסירת גן שבלול. AAVs הוא יתרון בשבלול למספר הסיבות. הם וירוסים כפולים מחסרת וביעילות יכולים להעביר מולקולות מהונדסים לתאים מסוגים שונים, כולל נוירונים, יעד חשוב למספר הסיבות לירידה בשמיעה. כניסת AAV לתוך התא מתווכת על ידי קולטנים ספציפיים 2; כך, הבחירה של סרוטיפ מסוים חייבת להיות תואמת לסוגי התאים להיות transduced. AAVs יכול למעשה transfect תאי שיער 3 ולשלב לתוך הגנום המארח, וכתוצאה מכך הביטוי של tra יציב, לטווח ארוךחלבון nsgenic ושינוי פנוטיפי בתא 4. אמנם לא בהכרח יתרון עבור יישומים לטווח קצר, כגון התחדשות שיער תאים, ביטוי לטווח ארוך הוא מאוד חשוב עבור הצלה יציבה של פגמים גנטיים. בגלל AAVs אינם משויך לשום מחלה או הדבקת בני אדם ולהפגין לא ototoxicity 5,6,7, הם מועמד אידיאלי לשימוש בריפוי גנטי לצורות ירושה של אובדן שמיעת 8. העברה של חומר גנטי אקסוגניים לאוזן הפנימית היונקים באמצעות וקטורים ויראליים נחקרה בעשור האחרון ומסתמנת כטכניקה מבטיחה לטיפול צורות שניהם גנטיות ונרכשות של אובדן שמיעת 9. השבלול הוא פוטנציאל יעד אידיאלי לריפוי גנטי מכמה סיבות: 1) הנפח הקטן שלה מחייב כמות מוגבלת של נגיף צורך; 2) הבידוד היחסי שלה מצד מגבלות מערכות איברי אפקטים אחרים; ו 3) התאים מלא הנוזל להקל נגיפייםמשלוח ברחבי המבוך 10, 11,12,13,14, 15. מודלים עכבר של חירשות מולדת מאפשרים שימוש בשיטות רבות של מחקר לעקוב אחר התפתחות של האוזן הפנימית באופן שיטתי, לשכפול. בעוד גודלו הקטן של cochleae עכבר זה אכן מציג קושי כירורגית, העכבר משמש כמודל חשוב ביותר במחקר של אובדן שמיעה גנטי, עם כמה יתרונות ניסיוניים על מינים אחרים 16. מודלים עכבר מאפשרים הערכה של מגוון רחב של מאפיינים באמצעות ניתוח הצמדה גנטי, אוסף של תצפיות מורפולוגיים מפורטות, ומדמת תרחישים פתוגניים; ככזה, הם מועמדים טובים לטיפול גנטי בתיווך באופן ויראלי. מחקרים גנטיים נרחבים בעכברים בשילוב עם התקדמות טכנולוגית אפשרו ליצור עכברים מהונדסים גנטי בדרך לשחזור בכל מעבדות 17,18, 19, 20,21. Furthermorדואר, קיימים מודלים רבים לרכשו שני וירשו פנוטיפים אובדן שמיעה בעכברים, המאפשרים בדיקות מחמירות במודל זה של בעלי החיים 22, 23,24. לפיכך, תיקון שמיעה באמצעות ריפוי גנטי בתיווך באופן ויראלי במודל של עכברים הוא צעד ראשון מתאים בחיפוש אחר תרופה למחלה אנושית. הראינו בעבר כי עכברים הטרנסגניים חסרי גלוטמט שלפוחי טרנספורטר 3 (VGLUT3) נולדים חירשים בשל חוסר שחרור גלוטמט בסינפסה סרט IHC 25. בגלל מוטציה זו אינה מובילה לניוון עיקרי של תאי שיער החושיים, עכברים שעברו מוטציה אלה הם פוטנציאל מודל מצוין שבו לבחון את הטיפול גנטי שבלול לאובדן שמיעת מולד. נכון להיום, מספר טכניקות מסירה נגיפיות לריפוי גנטי שבלול תוארו, כולל דיפוזיה עגולה חלון קרום, הזרקת חלון קרום עגולה, ומשלוח באמצעות cochleostomy. יש עוצמהיתרונות ial וחסרונות של כל אחת מהגישות האלה 9. כאן אנו מדווחים שיטה כירורגית למסירת גן בתיווך באופן ויראלי לאוזן הפנימית VGLUT3 KO העכבר דרך הקרום העגול החלון (RWM). שיטת הזרקת RWM פוסט-אוזן היא פולשנית עם שימור שמיעה מצוין, והוא מהיר יחסית. כפי שפורסמנו בעבר, בניסיון לשחזר את השמיעה במודל עכבר זה, וקטור AAV1 נושא את גן VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) הוכנס לשבלול האוזן של עכברים החירשים אלה ביום הלידה 12 (P! @), וכתוצאה מכך שיקום שמיעת 26. שמיעה בעכברי VGLUT3 KO אומתה על ידי הבדיקה ABR (ABR), ואילו ביטוי חלבון transgene אומת באמצעות immunofluorescence (IF). מתודולוגיה זו ובכך מוכיחה כי טיפול גנטי באופן ויראלי בתיווך יכול לתקן פגם גנטי שאחרת היה גורם לחירשות.

<table><tbody><tr><td>קטמין</td><td>באטלר שיין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>אנאסד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצפרומזין</td><td>מסופק על ידי UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משכך כאבים קרפרופן</td><td>מסופק על ידי UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>בטדין בטדין Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון משחת עיניים (TobraDex)</td><td>אלקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט 25G</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט פיפטה נימית</td><td>מכשירי דיוק עולמיים, בע"מ.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>תפר PDS*בתוספת אנטיבקטריאלי</td><td>אתיקון</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>דבק רקמות (Vetcode)</td><td>באטלר שיין</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה בוערת/חומה&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puller דגם P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת TDT BioSig III&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; טאקר-דייוויס טכנולוגיות</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

ריפוי גנטי, המשמש להשגת החלמה תפקודית מחירשות חושית, מבטיח להעניק הבנה טובה יותר של מנגנונים המולקולריים וגנטיים הבסיסיים שתורמים לירידה בשמיעה. מבוא של וקטורים לאוזן הפנימית חייב להיעשות באופן שמפיץ את הסוכן נרחב ברחבי השבלול תוך מזעור פגיעה במבנים הקיימים. כתב יד זה מתאר גישה ניתוחית פוסט-אוזן שיכולים לשמש לטיפול בשבלול עכבר באמצעות מולקולרי, תרופתי, ומשלוח נגיפי לעכברים לאחר הלידה יום 10 ומעלה באמצעות הקרום העגול החלון (RWM). גישה ניתוחית זו מאפשרת אספקה ​​מהירה וישירה להלמות scala תוך מזעור אובדן דם והימנעות תמותת בעלי חיים. טכניקה זו כרוכה נזק זניח או לא למבנים חיוניים של האוזן הפנימית ואמצע, כמו גם שרירי צוואר, תוך שמירה על דיון מלא. כדי להדגים את היעילות של טכניקה ניתוחית זו, glutam לפוחיאכלתי טרנספורטר 3 נוקאאוט עכברים (VGLUT3 KO) ישמשו כדוגמא למודל עכבר של חירשות מולדת שמשחזר שמיעה לאחר הלידה של VGLUT3 לאוזן הפנימית באמצעות וירוס adeno הקשורים (AAV-1).

כדי לאמת את התכונות ותועלת של גישת פוסט-אוזן לטיפול מולקולרי שבלול הטכניים, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP וAAV2-GFP נמסרו לאוזן פנימית עכברי P10-12 באמצעות RWM. גישה זו מדגימה ביטוי transgene מוצלח בתוך תאי שיער פנימיים (IHC) (VGLUT3 איור 1 וGFP איור 2 וGFP איור 3 א), תאי שיער חיצוניים (OHC) (איור 2 GFP) ותאי תומכים (GFP איור 2 ואיור 3 א) 26 ללא איבר משמעותי של פגיעת קורטי. תצפית סוגי תאים שוני...

הגישה הכירורגית הפוסט-אפרכסת המתוארת מאפשרת אספקה מהירה וישירה לשבלול העכבר scala tympani תוך מזעור אובדן דם ותמותת בעלי חיים. ניתן להשתמש בשיטה זו לטיפול בשבלול באמצעות העברה מולקולרית, פרמקולוגית וויראלית לעכברים לאחר לידה דרך קרום החלון העגול.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר גישה כירורגית פוסט-אאוריקולרית המאפשרת העברה מהירה וישירה של וירוס לתוך טימי בקנה מידה S של עכבר דרך קרום החלון העגול. זה מושג על ידי חשיפת הבולה התיפנית. בשלב השני, הרקמה מחוררת ומדמיינים את עורק האדיה וקרום החלון העגול.לאחר מכן מנקבים את קרום החלון העגול והנגיף מוזרק לתוך הספון. בשלב האחרון, החור אטום. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ביטוי החלבון הטרנסגן ואת התאוששות השמיעה של בעל החיים על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ומדידת תגובת גזע המוח השמיעתי בהתאמה.היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כמו גישת קוך, אוסטומיה וגחון הם שהזרקת קרום החלון העגול הפוסט-אולרי היא זעיר פולשנית במהירות יחסית, מאפשרת הזרקות בנפח גבוה יותר ומאפשרת העברה נרחבת של מגוון תאים ברחבי השבלול. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שההליך תלוי במידה רבה בהבנה מעמיקה של האנטומיה של השבלול. לאחר אישור ההרדמה בבוהן, יש לצבוט לגלח את האזור הפוסט-אאוריקולרי השמאלי ולחטא את העור של יום לאחר הלידה, 10 עד 12 עכברים עם 70% אתנול ופובידון יוד.לאחר מכן כסו את העיניים במשחת עיניים מגן והניחו את החיה כשהצוואר מורחב על כרית חימום. בסיום ההכנה הכירורגית, חתכו את הרקמה התת עורית במספריים קטנים כדי לחשוף את השריר הפוסט-אאוריקולרי. לאחר החזרת רקמת השומן לצד האחורי של החתך, הפרד את השרירים לצד ימין ושמאל בניצב לחתך.כדי לחשוף את העצם הטמפורלית, השתמש במחט בקוטר 25 כדי לנקב את בולה התוף, ולקלף את העצם לאחור בעזרת מלקחיים לפי הצורך כדי להרחיב את החור ולאפשר גישה לסיבוב הבסיסי של השבלול. לאחר מכן הרחב את החור מספיק כדי לאפשר הדמיה של העורק הסטאד וקרום החלון העגול. נקב בעדינות את קרום החלון העגול במרכז בעזרת בורו סיליקט, פיפטה נימית.יבש את קרום החלון העגול עם נייר פילטר סטרילי. לאחר מכן המתן חמש עד 10 דקות עד ששטף הנוזל e יתייצב בשלב זה. היזהר בעת החזקת הפיפטה וקידומה, כדי להפוך את ניקוב קרום החלון העגול לקטן ככל האפשר.בהתאם לשימוש במיקרוסקופ, ניתן להחזיק את הפיפטה ביד או על ידי מניפולטור מיקרום. כפי שאתם יכולים לראות כאן, אנו מחזיקים את הפיפטה ביד מכיוון שהמיקרוסקופ קרוב מדי לעכבר מכדי לאפשר מיקרו-מניפולטור. כעת צייר מיקרוליטר אחד עד שניים של הנגיף לתוך פיפטת זכוכית משוכה עם קצה בקוטר 15 מיקרומטר והזריק את הנגיף לקנה המידה של טימוני דרך אותו חור שנעשה בעבר בקרום החלון העגול.ואז שלף את הפיפטה ואטום במהירות את נישת החלון העגולה עם פקק שריר קטן, ואבטח אותה עם טיפה קטנה של דבק רקמות. כסו את החור בבולה השמיעתית ברקמת שומן והחזירו את השרירים הפוסט-אאוריקולרים ורקמת השומן למקומם הרגיל. לאחר מכן, בעזרת תפר כרומי נספג 6.0 או פחות, סגור את הפצע וחטא את אזור החתך עם יוד פובידון.לאחר מכן הניחו את העכבר בכלוב חם, והחזירו את הפופ לאם לאחר החלמה מלאה עם ניטור יומיומי. כדי להעריך את תפקוד השבלול כבר ארבעה ימים לאחר הלידה הנגיפית, מקמו בעל חיים מורדם על כרית חימום, ולאחר מכן הניחו אלקטרודות מחט תת-עוריות בקודקוד מתחת לאפרכסת האוזן השמאלית ומתחת לאוזן הנגדית. לבסוף, התחל להקליט את תגובות גזע המוח השמיעתי או BR בתא אטום לרעש כפי שתואר קודם לכן, למדוד את הגל הראשון כדי לנתח את פעילות עצב השבלול כפי שניתן לראות בתושבת חור השבלול.גישה זו מדגימה ביטוי טרנסגנים מוצלח בתוך תאי השערה הפנימיים, תאי השיער החיצוניים ותאים תומכים ללא איבר משמעותי של פגיעה ב-COR T שניתן לראות סוגי תאים שונים המבטאים GFP בחור השבלול. מאונט מדגים כי הבחירה בסרוטיפ הנגיף הקשור לאדנו חייבת להיות תואמת לסוגי התאים שיש להמיר. מספר התאים המועברים משתנה בהתאם לריכוז ולנפח שהנגיף הזריק.במקרה זה, העלייה מ-0.6 למיקרוליטר אחד הביאה לעלייה במספר התאים שהועברו לרמה הדומה לגלוטה מסוג V פראי ביטוי שלושה טרנסגנים שוחזר בעכברי KO שהוזרקו כפי שניתן לראות בתמונות אלה כאן, ההשפעה של העברת קרום חלון עגול פוסט-אאוריקולרי של נגיף V GL 3 לתוך האוזן הפנימית של עכברי V gl שלושה נוקאאוט על הצלת שמיעה מודגמת כפי שניתן לראות ב הגרף. עקבות ה-A BR שוחזרו ב-VLU שלושה עכברי נוקאאוט שחולצו והגיעו לסף דומה לאלה שנראו בעכברים מסוג בר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת את הזמן לכל צעד כדי למנוע נזק למבני האוזן הפנימית והתיכונה כמו גם לשרירי הצוואר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע גישה פוסט-ניתוחית להעברת טיפולים ניסיוניים ויראליים פרמקולוגיים מולקולריים לתוך תבנית השלד של MAs דרך קרום הרוח העגול.

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

מקור: Kozin, E. D., et.al. הדמיה ישירה של גרעין השבלול הגבי של העכברים לגירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר (DCN) כדי לאפשר גירוי שמיעתי המושרה על ידי אור. וקטור ויראלי המקודד אופסין, תעלת יונים רגישה לאור, מוזרק לתוך ה-DCN לאחר קרניוטומיה ושאיפת מוח לגישה ישירה. האופסינים המבוטאים מאפשרים להפעיל נוירונים על ידי אור, ומספקים מודל לחקר תגובות מסלול השמיעה באמצעות אופטוגנטיקה.

העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר לגירוי שמיעתי המושרה על ידי אור

סרטון זה מציג קנלסטומיה, הליך המאפשר העברת תרופות מקומית לאוזן הפנימית של עכבר דרך התעלה החצי עגולה עם נזק מינימלי לשמיעה ולתפקוד שיווי המשקל. שיטה זו מאפשרת חיסון של וקטורים נגיפיים, תרופות ומולקולות קטנות לתוך האוזן הפנימית של העכבר.

קנלוסטומיה להעברת סמים מקומית לאוזן הפנימית של עכבר בוגר

מקור: Akil, O., et al., שיטה כירורגית להעברת גנים בתיווך ויראלי לאוזן הפנימית של העכבר דרך קרום החלון העגול. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך של העברת גן טיפולי לאוזן הפנימית של גור עכבר עם ליקוי שמיעה גנטי. באמצעות וקטור ויראלי הקשור לאדנו-(AAV), הגן מוזרק דרך קרום החלון העגול, ומאפשר לחלקיקים נגיפיים להיכנס לתאי השיער, לשחזר את ייצור טרנספורטר הגלוטמט ולבסס מחדש איתות קול למוח.

טיפול גנטי מבוסס וקטור ויראלי לשיקום שמיעה במודל עכבר

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

. מדווחים שיטה כירורגית כדי לנהל את התרופות האוזן הפנימית של הפרימטים אנושיות, המרמוסט נפוצות (ההצטרפות נקראו Callithrix), דרך קרום חלון עגול.

הליך כירורגי עבור ניהול של הסמים לאוזן הפנימית, לא אנושית הפרימטים נפוצות קוף (ההצטרפות נקראו Callithrix)

במחקר זה, אנו מתארים את הגישה תעלת semicircular האחורי בתור שיטה אמינה למסירה גן באוזן הפנימית בעכברים neonatal. אנו מראים כי המסירה הגן דרך תעלת semicircular האחורי הוא היכולת perfuse האוזן הפנימית כולה.

גישה תעלת Semicircular אחורי האוזן הפנימית המסירה הגן עכבר Neonatal

כאן נתאר canalostomy הליך המאפשר משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו neonatal דרך תעלת semicircular במינימום נזקים לפונקציה שמיעה ואת שיווי המשקל. בשיטה זו ניתן לחסן וקטורים ויראלי, פרמצבטיקה, מולקולות קטנות לתוך האוזן הפנימית העכבר.

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

למדו שיטה ניתוחית לאוזן הפנימית לשם משלוח ויראלי ישיר דרך ממברנת החלון העגול בעכבר. טכניקה זו ממזערת איבוד דם ותמותה, ומאפשרת טיפול גנטי בקוכליאה עם ביטוי טרנסגן מוצלח.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

גלה סרטונים נוספים