Name: גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למד לגלות גליקוגן בתאי דם לבנים מונונוקליאריים מדם ורידי אנושי באמצעות צביעת חומצה שיף מחזורית. פרוטוקול זה מאפשר חקר מטבוליזם תאי חיסון ומבנה פוליסכרידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מתוכנית NSERC Discovery מספר RGPIN 418522-2013. אנו מודים ל-R. Kilgour על הדיונים המועילים, ול-Katelin Gresty ו-Dr. A. Berghdal על שסיפקו את חלקי שרירי העכבר.

מחקר עם דגימות דם אדם אושר על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 10000618. העבודה על שריר עכבר אושרה על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 2010BERG. 1. בידוד PBMC מדם מלא הערה: לבצע הליך זה בקבינט בטיחות ביולוגי באמצעות טכניקה סטרילית וציוד מעוקר יצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק בזהירות 10-15 מיליליטר של דם מלא מצינורות heparinized (נוגדת קרישה) איסוף דם לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. לנשפך דם קטין, לנגב עם DDH 2 O ו- 70% EtOH באמצעות רקמת ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הדם בצינור חרוטי ליחס של 1: 1 עם פוספט הצפת מלוח (PBS 1x) pH 7.4. ודא שעוצמת הקול המרבית הכוללת אינו עולה על 30 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות באמצעות אקדח פיפטה סרולוגיות הימנעות בועות. הערה: אל מערבבים על ידי היפוך הצינור כדי למנוע דםccumulation בכובע והחלחול שלאחר מכן במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 13 מיליליטר של Ficoll-Paque (ראה חומרים וציוד שולחן), לצינור חרוטי 50 מיליליטר קיבולת חדש. שמור את הצינור זקוף במעמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה, לקחת דם מדולל, לגעת בקצה פיפטה ההעברה לקיר הפנימי של הצינור סמוך לראש. עם לחץ איטי ויציב, להעביר את הדם לאורך הקיר הפנימי של הצינור ויוצר שכבת דם על גבי שכבת סוכרוז. לעשות את הצעד הזה כמה וכמה פעמים עד שכל הדם הועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינור בחוזקה וצנטריפוגות הצינור בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ב 700 XG בהרוטור נדנדה עם סט ההאצה בינוני עד 5, והאטה לאפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוציא את הצינור ומבלי להפריע את השכבות, לקחת אותו בחזרה לארון הבטיחות הביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המעיל באפי (שכבה לבנה דקה מעונן), שבו PBMCs נמצאות, ממוקם בין PBS / פלזמה בזהירותnd שכבות ficoll בעזרת פיפטה העברה. הימנע מאיסוף שכבת סוכרוז ולא להפריע את שכבת תאי דם האדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעיל באפי לתוך צינור חרוטי חדש 50 מיליליטר סטרילי. זה עלול לקחת כמה פעמים לחזור על צעד 1.8 לאסוף את כל PBMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף PBS pH 7.4 לצינור עם PBMC ולמלא עד הסימן 45 מיליליטר. Shake צינור ביסודיות. לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 1: צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 480 עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9. שימו לב היווצרות של גלולה של PBMCs בחלק התחתון של צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס פלסטיק עם 10 מיליליטר של אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר תא גלולה בעדינות על ידי &quot;צוברים&quot; נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 25 מיליליטר של pH PBS הטרי 7.4 לצינור. אם צינור אחד או יותר נמצא בתהליך עיבוד, בריכת הכדורים יחד בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2: צנטריפוגה צינור דקות 12 ב 480 XG with שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס הפלסטיק עם התזה של אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות &quot;מדף&quot; נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 25 מיליליטר של PBS הטרי הצינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא 50 μl של התאים ולהעביר לתוך צינור microcentrifuge לספירת כדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סכום השווה (50 μl) של trypan כחול (כתם כדאיות) ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא 10 μl ולהעביר אותו לhemocytometer כדי לבדוק את הכדאיות של תאים לכל מיליליטר. רשום את מספר תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הכמות הרצויה של תאים וצנטריפוגות צינור דקות 12 ב 480 XG עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את PBS (supernatant) לתוך הכוס עם אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות &quot;מדף&quot; נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). הוסף 80 μl של PBS לתוך הצינור. </li></ol> 2. ביצוע Slide PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 80 μl של התאים לשקופית מיקרוסקופ. למרוח הטיפה בעזרת שקופיות אחרת או להציב 2 טיפות של 40 μl כל בשני הקצוות של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר שקופיות בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש. תווית השקופיות עם עיפרון בצד החלבית. </li></ol> 3. תיקון דוגמאות על השקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מקבע על ידי הערבוב של 0.5 מיליליטר של פורמלדהיד 37% ל- 4.5 מיליליטר של 99% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות הן יבשות, להוציא 2 מיליליטר של הפתרון מקבע הטרי ושופכים אותו בשקופית, כך שכל פני השטח של השקופית מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הפתרון בשקופית 1 דקות. יש לשטוף את שקופית 1 דקות במים ברז ולהשאיר לייבוש באוויר. </li></ol> 4. ביצוע פתרון עמילאז לבקרה שלילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 0.25 גרם של אבקת עמילאז ולפזר ב 50 מיליליטר של diמים דוממים. יוצקים את הפתרון בכוס 100 מיליליטר נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופית בכוס כך שמחצית מהשקופית מקבלת טיפול ואת החצי השני נותר ללא טיפול ולאחר מכן דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום באיזה צד של השקופיות מקבל טיפול עמילאז. למתוח קו על הגב של השקופית המציין את הגבול בין הטיפול והשליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם DDH 2 O להסיר את פתרון עמילאז ולהשאיר את השקופיות לייבוש באוויר. </li></ol> .5 בצע תקופתי חומצה שיף (PAS) מכתים והדמיה הערה: ריאגנטים PAS רעילים על ידי שאיפה ומאכלים, ולכן הצעדים צריכים להיעשות במנדף הכימי, וחומרי הפסולת יש להשליכם כהלכה על פי הנחיות מוסדיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על משטח שטוח ולשפוך 1.50-2.00 מיליליטר של חומצת פתרון התקופתי על המדגם. אינקובטורים לte במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות בכמה אישומים של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1.50-2.00 מיליליטר של המגיב של שיף בשקופית ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית במים מזוקקים למשך 5 דקות ולהשאיר לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תקשורת הרכבה 10 μl בשקופית ומכסה בשני coverslips קטן, או להחיל 50 μl ולהשתמש coverslip אחד גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לק ברור בקצוות של coverslip, בואו לילה יבש. </li></ol> 6. השג תמונות עם משקפת האור מיקרוסקופ באמצעות מטרת 100X

<ol><li>Rich, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+keilin%27s+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of keilin's respiratory chain.</a> Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).</li>
<li>Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiles+of+three+fiber+types+of+skeletal+muscle+in+guinea+pigs+and+rabbits%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits).</a> Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).</li>
<li>Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+glycogen+content+in+various+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte glycogen content in various disease.</a> J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).</li>
<li>Scott, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+in+human+peripheral+blood+leukocytes.+I.+characteristics+of+the+synthesis+and+turnover+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).</li>
<li>Fedele, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((positive+index+of+lymphocytes+and+metabolic+control+in+insulin-treated+and+type+II+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabete+Metab%22%5BJournal%5D)">positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus.</a> Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).</li>
<li>Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+peripheral+blood+granulocytes+and+lymphocytes+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Pol.Med.Sci.Hist.Bull%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).</li>
<li>Yunis, A. A., Arimura, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+of+glycogen+metabolism+in+white+blood+cells.+I.+glycogen+phosphorylase+in+normal+and+leukemic+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%2C+Res%22%5BJournal%5D)">Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes.</a> Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).</li>
<li>Hagemans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAS-positive+lymphocyte+vacuoles+can+be+used+as+diagnostic+screening+test+for+pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inherit.+Metab.+Dis%22%5BJournal%5D)">PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease.</a> J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).</li>
<li>Totsuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+performance+and+soleus+muscle+fiber+composition+in+wild-derived+and+laboratory+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains.</a> 95 (2), 720-727 (2003).</li>
<li>Murat, J. C., Serfaty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+enzymatic+determination+of+polysaccharide+%28glycogen%29+content+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues.</a> Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).</li>
<li>Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+protein+regulates+glycogen+phosphorylase+activation+and+controls+interleukin+%28IL%29-2-dependent+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation.</a> J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).</li>
<li>Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+titration+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical titration of glycogen in vitro.</a> J.Vis.Exp. (81), (2013).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagliabracci+V.S.+Glycogen+and+its+metabolism%3A+Some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.J%22%5BJournal%5D)">Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes.</a> Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+of+glycogen+in+rat+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence of glycogen in rat thymus.</a> Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).</li>
<li>Darlington, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+Th17+%28not+Th1%29+responses+underlie+multiple+sclerosis+disease+abrogation+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.Neurol%22%5BJournal%5D)">Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).</li>
<li>Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atlasofms.org">http://www.atlasofms.org</a> (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים הקריטיים של מאמר זה וידאו היו במהלך טיפול כביסה ועמילאז של התאים. בזמן שטיפת השקופיות, צעד מפתח השתמש בבקבוק שטיפת סָחִיט פלסטיק ולתת את המים בעדינות להפעיל באמצעות המדגם בשקופית ולא מכוון ישירות על הדגימות. אפילו לחץ המים ישיר הקל היה לגרום לתאים לרדת שקופיות. עוד צעד מפתח היה להשתמש באותה השקופית ל± תנאי עמילאז. לאחר PBMCs דבקה בשקופיות, השקופיות הונחו בזהירות לתוך כוס, כך שרק מחצית מהמריחה נחשפה לפתרון עמילאז. צעד זה מספק שליטה חזקה, כי תאי הדם הם מאותו השקופיות, ובכך לצ...

שיף צביעת חומצה תקופתית (PAS) היא טכניקה immunohistochemical כי נעשתה שימוש נרחב במחקר שריר ואבחון. כמו כן הוא משמש ככלי אבחון בדגימות דם. הטכניקה עובדת על ידי יישום פתרון חומצה תקופתי למדגם, אשר מתחמצן יחידות בתוך קבוצות אלדהיד פוליסכריד יצירת המגיבות עם המגיב של שיף חסר הצבע וכך לייצר מוצר מגנטה עמוק. צעדיו של נוהל זה מוצגים באיור 1. הכתם הופך כל דבר עם מגנט רב-סוכרים, כולל גליקוגן, גליקופרוטאינים, glycolipids, mucins, או מולקולות אחרות עם moieties פוליסכריד. צביעת PAS משמשת לעתים קרובות כדי למדוד את רמות הגליקוגן בסיבי שריר. חלקי רקמות שרירים הם אידיאליים עבור הטכניקה כמו שהם מייחסים היטב לשקופית ולעמוד שלבי כביסה וצביעה מרובים. גליקוגן הוא ההווה ביותר בעווית מהירה סוג II סיבי שריר, שבו יש ביקוש גבוהלייצור ATP מהיר הדורש גליקוגן ל1,2 ביצועים מרבי. גליקוגן הוא פולימר מסועף של גלוקוז שיכול להיות שבור לגלוקוז החופשי דרך הפעולה של אנזימי phosphorylase הגליקוגן. בימים של מנוחה ותזונה-הסתפקות, גליקוגן מתחדש בתהליך של גליקוגנזה, ואילו בתקופות של ביקוש אי ספיקה או אנרגיה גבוהה תזונתי; גליקוגן מתפרק לגלוקוז על ידי "גליקוגנוליסיס". ממוקדם ככל 1950 מדעני קלינאי בחנו צביעת PAS על דגימות דם כדי לנתח תוכן גליקוגן במחלות שונות 3-7. לדוגמא, במחלת-אחסון גליקוגן bonafide Pompe תאי דם לבנים disease- לצבור כמויות גדולות של גליקוגן ששונה באופן משמעותי מנבדקי ביקורת בריאים 8. וידאו-מאמר זה מדגים גרסה מותאמת של מכתים PAS לשימוש בתאי הדם היקפי mononuclear (PBMC) דגימות מהדם ורידים של בני אדם בריאים. PBMCs מכיל בעיקר לימפוציטים של הלימפוציטים T ומשפחות הלימפוציטים B, כמו גם תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי הרג טבעיים ומונוציטים. הצעד הראשון לטיהור מסיר אריתרוציטים, נויטרופילים, וגרנולוציטים אחרים. טכניקה זו מספקת נתונים על שיעור מרוכז של לימפוציטים מסוג המאפשר לספירה חזקה יותר של תאי PAS-חיובי בהשוואה לשימוש במשטחי דם כולה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg"> איור 1:. צעד אחר צעד המתודולוגיה של מכתים PAS על PBMC () ראשית, בידוד של PBMC מושגת באמצעות שיפוע ficoll, הלוח השמאלי מציג את ההכנה לפני צנטריפוגה, הפנל הימני מראה את זה אחרי צנטריפוגה בי המעיל באפי המכיל את PBMC הוא ציין במרכז של הצינור. PBMCs מבודדת (ב ') הם קבועים לשקופית באמצעות solu מקבע פורמלין-אתנולtion. השקופיות היא שטפו בעדינות עם מים מזוקקים מבקבוק פלסטיק לשטוף. (C) השקופית ממוקמת אז במחצית דרך 100 מיליליטר כוס מלאה פתרון עמילאז, שיתמוסס גליקוגן. השקופיות היא שטפו בעדינות. הוא טיפל (D) השקופיות עם פתרון חומצה תקופתי, שבו חמצון של סוכרים מתרחש. שקופיות הם שטופים בעדינות; זה יסיר את החומצה התקופתית העודפת ולעצור את צעד החמצון. (E) כאשר מגיב שיף מתווסף לשקופיות, זה יגיב עם אלדהידים נוצרו במהלך שלב החמצון. אז מגיב חסר צבע זה יגרום מוצר מגנטה אדום עמוק. שקופיות הם שטופים בעדינות כדי להסיר את מגיב שיף העודף.

<table><tbody><tr><td>ערכה לצביעת Periodic Acid Schiff</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש. החומרים בערכה זו רעילים ומסוכנים. יש לנקוט משנה זהירות.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase מלבלב חזיר</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ בינוקולרי</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לבדיקת גליקוגן</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>פולימר סינתטי לא-יוני של סוכרוז.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>לבידוד PBMC, נעשה שימוש בראש דליים נתיבים (swing buckets).</td></tr></tbody></table>

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

צביעת חומצה תקופתית שיף (PAS) היא טכניקה אימונוהיסטוכימית המשמשת בביופסיות שרירים וככלי אבחון לדגימות דם. פוליסכרידים כגון גליקוגן, גליקופרוטאינים וגליקוליפידים מכתימים מג'נטה בהירה מה שמקל על ספירת תאים חיוביים ושליליים בתוך הרקמה. בתאי שריר צביעת PAS משמשת לקביעת תכולת הגליקוגן בסוגים שונים של תאי שריר, בעוד שבדגימות תאי דם צביעת PAS נחקרה ככלי אבחון למגוון מצבים. הדם מכיל חלק מתאי הדם הלבנים השייכים למערכת החיסון. הרעיון שתאי מערכת החיסון מחזיקים בגליקוגן ומשתמשים בו כמקור אנרגיה לא נחקר באופן נרחב. כאן, אנו מתארים גרסה מותאמת של פרוטוקול צביעת PAS שניתן ליישם על תאי חיסון חד-גרעיניים בדם היקפי מדם ורידי אנושי. נצפו תאים קטנים עם גרגירים חיוביים ל-PAS ותאים גדולים יותר עם צביעת PAS מפוזרת. טיפול בדגימות עם עמילאז מבטל את הדפוסים הללו ומאשר את הספציפיות של הכתם. טכניקה חלופית המבוססת על עיכול אנזימטי אישרה את נוכחותו וכמות הגליקוגן בדגימות. פרוטוקול זה שימושי עבור המטולוגים או אימונולוגים החוקרים את תכולת הפוליסכרידים בלימפוציטים שמקורם בדם.

כדי לאמת את חומרים כימיים וטכניקה בסיסית, צביעת PAS בוצעה בהתאם להוראות יצרן על חלקי שריר סולית עכבר. הצביעה נעשתה באותו יום כקורבן ובשלב האחרון של הצביעה, החלקים תוקנו על ידי קסילן. שריר הסוליה ידוע מכיל ~ תאי גליקוגן חיובי 35% 9. תאי השריר המוכתמים מוצגים שני גרגרי punctate תכונות- PAS-חיובי מובהקים בתוך התא, וקו רציף demarking קרום תא (איור 2 א). הנוכחות של גרגרי punctate עולה בקנה אחד עם מאגרי הגליקוגן, ומשמשת להגדרת תא שריר חיובי. טיפול בדגימות עם ...

צביעת חומצה שיף תקופתית היא טכניקה המדמה את תכולת הפוליסכריד של רקמות. מאמר זה מדגים פרוטוקול צביעת חומצה שיף תקופתי המותאם לשימוש בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מטוהרים מדם ורידי אנושי. דגימות כאלה מועשרות עבור לימפוציטים ותאי דם לבנים אחרים של מערכת החיסון.

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את תכולת הגליקוגן של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי. זה מושג על ידי בידוד ראשוני של P BMCs מדם מלא אנושי באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. השלב השני הוא הכנת שקופיות דגימה על ידי מריחה או פיפטינג של תאי הדם, ולאחר מכן טיפול בהם בתמיסה מקבעת, ולאחר מכן שטיפה לאחר מכן לבקרה שלילית.מחצית מהמגלשה טובלת בתמיסת עמילאז, הממיסה פולימרים גליקוגן, ואחריה שטיפה. כעת הדגימות מוכתמות בתמיסת חומצה תקופתית ואחריה שטיפה. השלב האחרון הוא להוסיף את המגיב של המשמרת ואחריו שטיפה.בסופו של דבר, מיקרוסקופ אור משמש כדי להראות את מאגרי הגליקוגן בתוך התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שיש יותר תאים חד-גרעיניים בכל שקופית בהשוואה לצביעה בדם מלא. לפיכך, יעיל יותר לנתח את תכולת הגליקוגן והלימפוציטים מכיוון שנויטרופילים ותאי דם אדומים נעדרים.כדי להתחיל בהליך זה בארון בטיחות ביולוגית, העבירו בזהירות 10 עד 15 מיליליטר של דם מלא מצינור איסוף הדם ההפריני לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את הדם ב- PBS X אחד ב- pH 7.4 ביחס של אחד לאחד, ולוודא שהנפח הכולל המרבי לא יעלה על 30 מיליליטר. ערבבו אותו בעדינות בעזרת אקדח פיפטה סרולוגי והימנעו מיצירת בועות.לאחר מכן העבירו 13 מיליליטר של פולימר סינטטי לא יוני של סוכרוז, FICO לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו את הדם המדולל בלחץ איטי ויציב על מנת ליצור שכבת דם על גבי שכבת ה-FICO. בצע שלב זה מספר פעמים עד שכל הדם הועבר.לאחר מכן, מכסים את הצינור בחוזקה וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב -400 Gs.לאחר מכן, הוציאו לאט את הצינור והעבירו אותו בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית. לאחר מכן, אסוף בזהירות את מעיל הבאפי בין שכבות הפלזמה של PBS ו-FICO בהן נמצאים ה-pbmc. הימנע מאיסוף שכבת ה-FICO ואל תפריע לשכבת כדוריות הדם האדומות.לאחר מכן העבירו את מעיל הבאפי לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מיליליטר. הוסף PBS לצינור עם ה-P BMCs ומלא אותו עד לסימן 45 מיליליטר. לאחר מכן יש לנער היטב את הצינור.ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות. במשקל של 277 גרם, ייווצר משטח של p BMCs בתחתית הצינור החרוטי. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט לכוס פלסטיק עם 10 מיליליטר אקונומיקה.שחרר את גלולת התא על ידי מתלה עדין של הצינור על משטח גלי. הוסף 20 מיליליטר PBS טרי לשפופרת. אם מעובד יותר מצינור אחד, משוך את הכדורים יחד בשלב זה.לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך 12 דקות בחום של 480 גרם. השליכו את הסופרנטנט לכוס הפלסטיק עם שפריץ אקונומיקה. לאחר מכן מתלה בעדינות את הצינור על משטח גלי.שוב לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר PBS טרי לשפופרת. העבירו 50 מיקרוליטר מהתאים לצינור מיקרו צנטריפוגה. לצורך כדאיות, ספור כדי לספור את התאים.מוסיפים 50 מיקרוליטר טריאן כחול ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות לערבוב. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר מהתערובת לציטומטר המו. לבדוק את כדאיות התאים ולרשום את מספר התאים למיליליטר.קח את כמות התאים הרצויה וצנטריפוגה את הצינור למשך 12 דקות ב-177 גרם. לאחר מכן, השליכו את ה-SUP natant לכוס עם אקונומיקה. לאחר מכן מתלה בעדינות את הצינור על משטח גלי, ולאחר מכן הוסף 80 מיקרוליטר PBS לתוך הצינור.כדי להפוך את מגלשת ה-PBMC, הנח 80 מיקרוליטר מהתאים על שקופית מיקרוסקופ מסומנת מראש, מרח את הטיפה בעזרת שקופית אחרת או הניח שתי טיפות של 40 מיקרוליטר בשני קצוות השקופית. השאירו את השקופית בארון הבטיחות הביולוגי לייבוש. לאחר מכן הכינו את תמיסת הקיבוע על ידי ערבוב של 0.5 מיליליטר של 37% פורמלדהיד עם 4.5 מיליליטר של 99% אתנול.לאחר שהתייבשו המגלשות, הוסיפו שני מיליליטר מתמיסת הקיבוע הטרייה על המגלשה כדי לכסות את כל המשטח. השאירו את התמיסה על השקופית למשך דקה אחת לפני שטיפה במי ברז למשך דקה נוספת. ואז השאירו אותו לייבוש באוויר.עכשיו התמוסס. יש לכוון 25 גרם אבקת עמילאז ב-50 מיליליטר מים מזוקקים. שופכים את התמיסה לכוס של 100 מיליליטר.לאחר מכן, טבלו מחצית מהשקופית בכוס ודגרו למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר, רשום הערה בצד שמקבל את הטיפול בעמילאז. צייר קו בגב השקופית המציין את הגבול בין הטיפול לבקרה.לאחר מכן, שטפו את השקופית במים מזוקקים כדי להסיר את תמיסת העמילאז. לאחר מכן השאירו את המגלשה לייבוש באוויר בשלב זה, הניחו שקופית על משטח ישר. מרחו שני מיליליטר של תמיסת חומצה תקופתית על הדגימה ודגרו אותה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן שטפו את השקופית מספר פעמים במים מזוקקים. מרחו שני מיליליטר של מגיב משמרות על השקופית ודגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשה במים מזוקקים למשך חמש דקות ואז השאירו אותה לייבוש באוויר.לאחר מכן, החל מדיית הרכבה של 100 מיקרוליטר על השקופית וכסה אותה בהחלקת כיסוי אחת גדולה, או החל 50 מיקרוליטר והשתמש בשתי פתקי כיסוי קטנים. לאחר מכן, מרחו לק שקוף על שולי החלקת הכיסוי. תן להם להתייבש למשך הלילה.לאחר מכן השג תמונות עם מיקרוסקופ האור הדו-עיני באמצעות ה-PAS האובייקטיבי פי 100. צביעה בוצעה על PBMCs מהדם הוורידי של נבדקים בריאים. ה-BMC המוכתמים של PAS הציגו מגוון דפוסי מכתים.תאים קטנים עם גרגירים נצפו בקלות. כמו כן נצפה שיעור של תאים גדולים יותר עם דפוס צביעה מפוזר. טיפול בדגימות עם עמילאז הסיר את אות הגרגיר והפחית את חיובי ה-PAS המפוזר.צביעת ה-PAS וההמטין בוצעו על כל מגלשת הדם. PBMC זה מוקף באריתרוציטים רבים. 98% pbmc חיובי ל-PAS היו התאים הקטנים יותר, ו-40% היו התאים הגדולים יותר.טיפול בעמילאז ביטל את אות ה-PAS בתאים הקטנים והפחית משמעותית את אות ה-PAS בתאים הגדולים ל-7%אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים של PAS עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים ושימוש במכסה מנוע כימי בעת ביצוע הליך זה.

detecting-glycogen-peripheral-blood-mononuclear-cells-with-periodic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את טכניקת צביעת החומצה-שיף התקופתית להערכת רמות הגליקוגן של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים במבחנה. הכתם מעניק צבע מג'נטה לגרגירי הגליקוגן התוך-תאיים, והופך אותם לגלויים תחת מיקרוסקופ.

צביעת תאים: טכניקת מבחנה לזיהוי רמות גליקוגן בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

בסרטון זה אנו מתארים בדיקה ספקטרופוטומטרית איכותית כדי לקבוע את מידת ההסתעפות בדגימת גליקוגן בעלת מבנה לא מאופיין. השוואת מקסימום הספיגה של המדגם הלא מאופיין לזה של פוליסכרידים עם מבנים מסועפים ידועים מצביעה על נוכחות של הסתעפות במדגם הלא מאופיין.

בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.

מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

הליך שלאחר קיבוע שונה מגביר את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן ברקמה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר כיצד לטפל ברקמה, לבצע את ההדמיה ולהשתמש בשיטות סטרולוגיות כדי להשיג נתונים משוחדים וכמותיים על התפלגות גליקוגן תת-תאי ספציפית לסוג סיבים בשריר השלד.

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

הוראת המדעים הביולוגיים יכולה להיות מגרה יותר עבור התלמידים באמצעות שימוש בניסויים. כתב יד זה מציג שני פרוטוקולים שונים אך משלימים שניתן להשתמש בהם בכיתה כדי לעודד תלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לתזונה עתירת קלוריות, רעב והזדקנות.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

בדיקת רקמת בעלי החיים משתמשת בזיהוי נצנוץ גרעיני כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית של גליקוגן סינתאז על ידי מדידת השילוב של גלוקוז מסומן רדיו בגליקוגן.

הערכה רדיוכימית של פעילות אנזים גליקוגן סינתאז ברקמות בעלי חיים

חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

למד לגלות גליקוגן בתאי דם לבנים מונונוקליאריים מדם ורידי אנושי באמצעות צביעת חומצה שיף מחזורית. פרוטוקול זה מאפשר חקר מטבוליזם תאי חיסון ומבנה פוליסכרידים.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

גלה סרטונים נוספים