פרוטוקול עבור לימוד ההכחדה של פחד אוויר באופן טבעי רכיבה על אופני חולדות נקבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעות של הורמוני בלוטת המין על התנהגות הכחדת הפחד אצל נקבות במצבים הורמונליים נמוכים וגבוהים של מחזור Esra ואת תפקידו של אסטרדיול כאשר הוא ניתן באופן אקסוגני. זה מושג על ידי ניטור מחזור ה-esra של חולדות נקבות בוגרות וזיהוי באיזה שלב הן נמצאות לפני הניסוי. לאחר מכן, בעלי החיים שנמצאים בשלב הייחום מוכנסים לתאים שהוקצו להם לצורך מגורים והתניה של פחד.

למחרת, כאשר החיות נמצאות בייחום, הנקבות מוזרקות עם אסטרדיול או רכב ועוברות אימון להכחדת פחד. לבסוף, ביום השלישי, החיות מוחזרות לאותו חדר כדי לבחון את ההיזכרות בסשן ההכחדה יום קודם. בסופו של דבר, דגימת הנרתיק לזיהוי EST strase מאפשרת לחוקרים לתמרן את התנודות הטבעיות בהורמוני בלוטת המין כדי לחקור את השפעתם על זיכרון הכחדת הפחד.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההבדלים בין המינים, כגון האם תהליכי הכחדת פחד שונים אצל זכרים ונקבות? ואם כן, מהם המנגנונים ההורמונליים והנוירוביולוגיים העונים על ההבדלים הללו? היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא יכול לעזור לקדם את חקר המין הנשי בהכחדת פחד על ידי שיתוף שיטות לעשות זאת.

חוקרים חדשים בשיטות אלה מתקשים לעתים קרובות לנטר באופן אמין את מחזור ה-eser מכיוון שההליך יכול לגזול זמן ותלוי מאוד בטכניקה נכונה. ההשלכות של מחקרים אלה עשויות לתרום לאפשרויות טיפול ספציפיות למין להפרעות הקשורות לפחד וחרדה. זה עשוי להיות חשוב בהתחשב בכך שלנשים יש סיכוי כפול מגברים לפתח פסיכופתולוגיות אלה.

ליסה מן, פוסט-דוקטורנטית במעבדה כמו גם טיפול סמוי. עוזר מחקר במעבדה יציג את הנוהל לאיסוף דגימות לניטור מחזור הייחום. לאחר הכנת תמיסת מלח של 0.9%, טבלו אפליקטור עם קצה כותנה בנוזל והשתמשו במגבת נייר כדי למחוק את קצה התמיסה העודפת המחזיקה את זנב החולדה כלפי מעלה והקפידו לא לגרום למצוקה.

הכנס בעדינות את קצה הכותנה לתעלת הנרתיק לא עמוק מדי, וגלגל אותו סביב הדפנות כדי ללכוד תאי נרתיק רופפים לפני כן. הסר את הקצה תוך כדי לא להעביר יותר מדי נוזלים, גלגל בעדינות את קצה המוליך על שקופית מיקרוסקופ מסומנת מראש, וודא שהדגימה עוברת לשקופית. אסוף דגימות לפחות לשני מחזורים שלמים והעבר מספר ימים רצופים בשקופית אחת כדי להיות מסוגל לעקוב ולזהות טוב יותר תוספות EST יומיות.

הפאזה משתנה לאחר שהשקופיות יבשות, טבלו אותן 10 פעמים לקיבוע, ואז 10 פעמים לתמיסת מכתים. ולבסוף, חמש פעמים לתמיסת כתמים נגדיים. יש לשטוף בעדינות במים.

אפשרו למגלשות להתייבש לחלוטין באוויר לפני הצפייה במיקרוסקופ לפני תחילת ניסוי ההתנייה, חשפו את הנקבות מראש לתאי המיזוג עם אורות הבית דולקים למשך 20 עד 30 דקות ביום למשך שלושה ימים כדי לאפשר להן להתאקלם בסביבה. הקצו את הקופסה אליה הם נחשפים מראש כחדר שלהם למחקר. נקו היטב את הקופסאות בין הפגישות ובעלי החיים כדי להסיר ריחות מכיוון שהם יכולים להשפיע על ההתנהגות ועל מחזור הלחץ של EST.

לאחר שאימתים שבעלי החיים נמצאים בשלב הייחום של מחזור ה-EST הנוסף, התחל את שלב התניה של ההתרגלות. בצע מדידות בסיסיות של הקפאה לפני גירוי מצב הצליל הראשון על ידי מדידת השניות שהחיה מבלה בנייד במהלך הגירוי. בהיעדר מרווח זמן, חשב את ציון הקיפאון באחוז על ידי חלוקת השניה שהושקעה ללא תנועה במשך הניסוי.

כדי לבצע אימוני הכחדה במהלך שלב האסטרוס ME, התנו את החולדות ביום האחרון של ESTRO כפי שנקבע על ידי מטוש. הכניסו את החיות לתא ההתניה ובצעו ניסוי CS בלבד של התרגלות. השראת צליל CS למשך 30 שניות.

לאחר המתנה של שלוש דקות בממוצע לפני הניסוי הבא, חזור על ניסוי CS בלבד ארבע פעמים נוספות בסך הכל חמישה ניסויים לפני ההתנייה. חבר את רצפת רשת הלם כף הרגל למחולל גירוי חשמלי. השתמש ברמת גירוי של 0.5 עד 0.6 מיליאמפר כגירוי הבלתי מותנה או US ובצליל של ארבעה קילו-הרץ 80 דציבלים כ-CS מיד לאחר סשן ההתרגלות.

התחל בניסויים זוגיים ב-CS US של התניה בפחד על ידי הצגת צליל CS 32, ואחריו הלם US של 0.5 שניות המופרד על ידי מרווח של כשלוש דקות בין ניסויים. חזור על הניסוי הזוגי שש פעמים נוספות בסוף מפגש ההתנייה. החזירו את בעלי החיים לכלובי הבית שלהם ולמתקן החיות עד למחרת ביום השני.

לאחר דגימה וזיהוי שלב האסטרוס ME עבור כל בעלי החיים שעברו את היום הראשון של הפרוטוקול, הכינו מספיק אסטרדיול בשמן שומשום או 0.9% מלח לכל בעל חיים כדי לקבל מנה של 15 מיקרוגרם לק"ג למתן ההורמון תת עורי. הרם את העור הרפוי בין עצם השכמה בצוואר בצביטה עדינה והכנס את המזרק למשולש שנוצר על ידי קפלי העור. 30 דקות לאחר קבלת הזריקות של בעלי החיים, הניחו אותם בתאי ההתניה והתחילו באימוני הכחדה על ידי ביצוע 20 ניתוח קיסרי בלבד.

כל אחד מהניסויים מורכב מ-32 קילו-הרץ, 80 דציבלים עם כשלוש דקות בין הניסויים 24 שעות לאחר מכן. ביום השלישי, ספוג את החיות שסיימו את המפגשים ביום הראשון והשני לאחר הנחת החיות בתאי ההתניה שהוקצו להם. התחל את מפגש ההיזכרות בהכחדה על ידי ביצוע שלושה ניסויי Cs בלבד עם כשלוש דקות בין הניסויים עם סיום מפגש ההחזרה, החזר את בעלי החיים לכלובי הבית שלהם ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט בפרוטוקול הכחדת פחד זה.

בעלי חיים שנכחדו היטב ושמרו על זיכרון אימוני ההכחדה הפגינו פחד נמוך ביום האחרון של מבחני התנהגות במהלך היזכרות בהכחדה. כפי שהודגם כאן, חולדות זכרים ונקבות אינם שונים באופן משמעותי בהבעת פחד מותנית. במהלך כל שלב, הבדל בין המינים ניכר כאשר החיות מנותחות בנפרד כקבוצות שלב ES אסטרוגן גבוה ונמוך.

גרף זה מראה את ההשפעה של שלב האסטרו על זיכרון הכחדת הפחד, נקבות חולדות שעוברות אימוני הכחדה במהלך שלב האסטרוגן הנמוך של מחזור ה-EST הנוסף. לא זוכרים את זיכרון ההכחדה ביום השלישי כמו גם את אלה שהוכשרו ב-PROEs. עם זאת, כאשר נקבות מטרי מוזרקות תת עורית עם מנה של 15 מיקרוגרם לק"ג של אסטרדיול לפני למידת ההכחדה, נראה כי גיבוש זיכרון ההכחדה של הפחד משתפר כפי שמודגם על ידי הקפאה נמוכה במהלך היזכרות בהכחדה.

לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שהורמוני בלוטת המין יכולים לווסת את ההיזכרות בהכחדת פחד, וגם לתווך הבדלים בין המינים בהתנהגויות מותנות של הכחדת פחד. ניתן לבצע הליכים נוספים כגון ניתוח קנולציה ואימונוהיסטוכימיה בשילוב עם השיטה המתוארת כאן כדי לענות על שאלות כמו, היכן אסטרדיול פועל במוח כדי לווסת פחד, הכחדה, גיבוש זיכרון, וכיצד אסטרדיול משנה את הפעילות העצבית באזורים אלה? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה ברורה כיצד לחקור חולדות נקבות מיחזור טבעי והשפעת אסטרדיול בהרחבה ברורה.