FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

המטרה הכוללת של המתודולוגיה הבאה היא לדמיין ולכמת את התנועה של זחלי Drosophila Melan Gaster, מה שמאפשר הקרנה בתפוקה גבוהה בתנאי תנועה חופשית. זה מושג על ידי יצירת משטח מעקב במערך FIM ושימוש בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת לתאורה עקיפה. לאחר מכן מונחים זחלים של גנוטיפים שונים על פני השטח ונרשמת התנהגות זחילה בתגובה לשיפוע חום.

לאחר מכן, סרטוני הווידאו מנותחים על-ידי מסלול FIM. תוכנה ונתונים המתקבלים משמשים ליצירת עלילות המתארות הבדלים בדפוסי הזחל והתנועה. התוצאות מראות כי כימות מדויק, תפוקה גבוהה, גמיש וקל לשימוש של הזחל.

ניתן לבצע תנועה על סמך טכניקת ההדמיה של FIM ותוכנית המסלול של FIM המשויכת. היתרון העיקרי של טכניקת הדמיה זו של שיטות קיימות כמו שימוש באור מקרי או מועבר, הוא שרק בעלי חיים הנוגעים במשטח נראים לעין, וכתוצאה מכך ניגוד רקע מעולה בחזית ללא חפצים מטרידים, אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה על הביולוגיה של לבה אופה. ניתן ליישם אותו גם לחקר התנהגות הליכה של זבובים ותנועה של אורגניזמים מונו-אורגניזמים אחרים כגון אלגנטיות ים, מליאה, או אפילו צמיחת שורשים של צמחים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לשכנע אחרים שטכנולוגיה מורכבת קלה לשימוש. השלב הראשון הוא יצירת משטח זחילה לח לשיטת הדמיה מבוססת FITR או fim. כדי לעשות את הרתיחה הזו, מקדחה בדרגת מזון 0.8% במים טהורים נטולי יונים.

יוצקים את המקדחה החמה על צלחת זכוכית אקרילית. אין לעורר את המקדחה לאחר הרתיחה ולשפוך ללא הרף. כדי למנוע בועות בטמפרטורה זו, יש ליצור לוח בעובי שני מילימטרים.

השתמש בתמיסת המקדחה שנותרה למילוי צלחות פטרי סטנדרטיות של שישה סנטימטרים. אלה ישמשו למיון זחלים נקיים והרגילים לפני הניסוי. לאחר מכן, חתוך כשני סנטימטרים מהיקף לוח המקדחה כדי לקבל משטח מרובע רגיל להקלטה.

העבר את לוח המקדחה למערך FIM ישירות לאחר הקירור. על ידי דחיפה עדינה של המקדחה מעל קצה לוחית הזכוכית האקרילית, המקדחה צריכה להחליק במקומה. כעת אתה מוכן להכנת הדמיה שתכלול מחסום מקדחה מרתיע במשטח הזחילה.

יש להרתיח מקדחה בדרגת מזון של 2.5% עם שלושה NACL טוחנת במים טהורים במיוחד נטולי יונים. לאחר מכן, חותכים חריץ ברוחב שני סנטימטרים המקיף את שדה הראייה למשטח הזחילה שנשפך בעבר. כשהוא מוכן, מלאו את החריץ במקדחת מלח גבוהה ב-0.1 עד 0.3 סנטימטרים ממשטח המעקב.

לאחר מכן, הכינו את מכשיר שיפוע החום. המכשיר הוא פלטת אלומיניום המכוסה במשטח בידוד ומחולפת במים ממשאבות בשני קצותיה. כדי לאפשר בקרת טמפרטורה, הפעל את התקן שיפוע החום שעה לפני השימוש והנח אותו מעל ההגדרה כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורה הרצויה.

ניתן לנצל זמן זה להכנות נוספות. כשהוא מוכן, העבירו את מקדחת המשטח הזוחל עם מחסום מלח להגדרה. הנח את לוחית הרדיאטור מעל המקדחה והתאם את המרווח בין הצלחת למשטח הזחילה לשני מילימטרים.

קבע שיפוע ליניארי בין 34 מעלות צלזיוס ל -18 מעלות צלזיוס על ידי התאמת הטמפרטורה של מעגלי המים למעלה אחת צלזיוס ו -45 מעלות צלזיוס, המתאים לציוד זה. אפשר למשטח הזחילה להתייצב בשיפוע למשך 20 דקות. לפני שתמשיך, בדוק את שיפוע הטמפרטורה עם TER כדי להכין את הזבובים, שלף אותם מאינקובטור של 25 מעלות צלזיוס וזרוק מעט מים לתוך בקבוקוני התרבות כדי לנהוג בסוף השלישי בתנועת זחלי הכוכבים.

לאחר מכן, אספו את הזחלים הגדולים ביותר מדפנות הבקבוקון בעזרת מכחול קטן, שתיים עד חמש דקות לפני ההקלטה, העבירו מספיק זחלים לסרטון אחד לצלחת פטרי שהוכנה קודם לכן. לאחר קביעת שיפוע הטמפרטורה, הגדר את תוכנת ההקלטה. ציינו את מספר המסגרות לכל וידאו.

הגדר את נתיב השמירה והגדר להקלטה מיידית תוך 20 שניות. לאחר הנחת הזחלים על משטח הזחילה כדי להתחיל, צלם את אחד הזחלים והתאם את עוצמת התאורה כדי להשיג ניגודיות טובה. כשהוא מוכן, הרם מעט את צלחת הרדיאטור והניח את הזחלים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס, שני סנטימטרים ממחסום המלח.

הורד שוב את לוחית הרדיאטור והתחל להקליט בחושך כדי לא להפריע לבעלי החיים. לאחר ההקלטה, הסר את הזחלים נקה והרטיב את פני השטח. כדי למנוע התפשטות NACL, אל תיגע במקדחת המלח בזמן העבודה, בעוד שיש לשמור על המשטח לח בכל עת, הימנע מלחות מוגזמת, שניתן לראות כהילות או טיפות סביב זחלים.

בהקלטות ובמעקב מופרע, אפשר למשטח המקדחה להתייצב למשך דקה עד שתיים לפני שתמשיך. במהלך תקופה זו, שמור את התמונות שנאספו ואסוף בעלי חיים חדשים. כדי להתכונן לסרטון הבא, שלוט בשיפוע הטמפרטורה באמצעות TER כל חמישה סרטונים והתאם את התקן הטמפרטורה במידת הצורך.

כדי להתחיל לעקוב אחר תנועה, התאם את פרמטרי המעקב באמצעות אפשרות התצוגה המקדימה. התאם מילימטר לפיקסל בהתאם למצלמה ולשדה הראייה. לאחר מכן, התאם את הפריימים לשנייה על סמך הגדרות המצלמה, השתמש במשוב שניתן בחלון התצוגה המקדימה כדי להתאים את ספי הבהירות כך שכל בעלי החיים יזוהו כהלכה.

לאחר מכן, התאימו את סף גודל שטח הזחל, בעלי חיים בודדים מודגשים על ידי עיגולים צהובים, זחלים מתנגשים מודגשים באדום, והשטח של כל חיה ניתן בכחול. התחל לעקוב באמצעות הכפתור בפינה השמאלית התחתונה לאחר הפעלת המעקב, תמונה הכוללת עקבות זחלים וקובץ CSV המכיל את תכונות התנועה והיציבה המחושבות מאוחסנת בספריית התמונות. לבסוף, השתמש במודול מציג התוצאות של FIM כדי לסקור ולהתאים באופן ידני את תוצאות המעקב.

הגדר את כיוון הזחילה ביחס לשיפוע החום כדי להעריך את הנתונים על סמך גירוי זה. בייצוג הזחל המוצג כאן, נקודת הראש והזנב מסומנות בין הנקודות הללו. ניתן להגדיר מספר אי-זוגי שרירותי של נקודות שדרה ברדיוס.

בנוסף, מחושבים מרכז המסה וזווית כיפוף הגוף העיקרי. מוצגות כאן תוצאות הדמיה ומעקב FI ממצלמות שונות. התמונות משמאל לוכדות שלושה זחלים זוחלים על שלב מעקב של 10 סנטימטר על 10 סנטימטרים.

מסלול המסה והשטח של זחל בודד מוצגים מימין. החץ האדום מציין את נקודת הזמן של התמונה החתוכה כתוצאה מההחלה. גירוי חום מוצג כאן כמסלולים בצבעים שונים המחושבים באמצעות מסלול F.

תמונות יישום ברזולוציה גבוהה אלה של שלישית, שנייה וראשונה בזחלי כוכבים התקבלו באמצעות עדשת מאקרו. אורגניזמים אחרים כמו ים יכולים גם הם להיות מדומים בקלות. לאחר השליטה, ניתן לנתח כמאה מעבדות בשעה לכל מערך מעקב.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקליט תמיד באותם תנאים בעקבות הליך זה. שיטות אחרות כמו גירוי אופטוגנטי או זיהוי in vivo של פעילות עצבית יכולות להיכלל במערך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כמה קל יכול להיות לנתח ביעילות תנועה אולרית.