הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך ביעילות פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בעכברים עובריים מתפתחים. זה מושג על ידי גידול נכון וגנוטיפ של עכברים מדווחים כך שניתן לבצע בדיקות צביעה במורד הזרם כשלב שני. עוברי העכבר מקובעים ומוכתמים כדי לאפשר הדמיה של הקרנות אקסון חושיות בבעל החיים כולו.

לאחר מכן, העוברים מיובשים ומנקים על מנת לדמיין לחלוטין את הקרנות האקסון העמוקות שאחרת לא היו נראות לעין. התוצאות מדגימות כי שיטות אלו הן אמצעי יעיל להערכה מהירה של פנוטיפים של צמיחת אקסונים עובריים. באמצעות המסלול של מדווח Tau Lae, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גדילת האקסונים החושיים על ידי מתן אפשרות לחוקרים להצליב את הגן המעניין שלהם על רקע tlac Z ולסנן כל שינוי בפנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים.

ההשלכות של הטכניקה שלנו מתרחבות לטיפול במובן זה שמדענים יכולים להשתמש בטכניקה שלנו כדי לבדוק אם מוטציות מולדות ידועות עשויות לגרום לפנוטיפים של גדילת אקסונים חושיים. כדי להתחיל בהמתת חסד של נקבות הריון מתוזמן על ידי פריקת צוואר הרחם כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט, המשך לנתח עוברים עובריים E 16 עד E 18 מנקבות הריון מתוזמן ואז הנח את העוברים בנפרד לבארות של צלחת שש בארות מלאה במי מלח עם פוספט קר או PBS. לאחר שטיפת העוברים ב-PBS קר, הסר חלק קטן מקרום מי השפיר של העובר והניח אותו בתמיסת פרוטאינאז K מוכנה מערכת טיהור ה-DNA או הגנוטיפ שלאחר מכן.

לחלופין, אם קרום מי השפיר אבד, הסר חלק קטן מקצה זנב העובר והנח אותו בתמיסת פרוטאינאז K. לאחר מכן, תקעו לתוך העור מסביב לעובר באמצעות סיכות חרקים היוצרות כ-100 חורים בכל צד. הסר את ה-PBS והוסף לאט לאט אלדהיד טרי 2% פרפורם או PFA pH 7.4 לבאר לאחר ניעור עדין במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.

שוטפים את העוברים פעמיים ב-PBS ומאחסנים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עד לצביעה לצורך גנוטיפ. טבלו את קרומי השפיר או זנבות העובר בתערובת הפרוטאינאז K בהתאם להוראות היצרן. דוגרים בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר חילוץ ה-DNA באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרית, השתמש ב-0.5 מיקרוליטר מתוך סך של 200 מיקרוליטר של תמיסת DNA גנומית מטוהרת כדי להכין תגובת PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן המשך להריץ את תוכנית ה-PCR כמפורט שם. לאחר PCR, הפעל את דגימות ה-PCR על ג'ל 2%aros ב-100 וולט במאגר EDTA אצטט אחד למשך 20 דקות. כלול נתיב המחזיק סולם DNA כדי להעריך את אורכי השברים ולהכתים את הג'ל באמצעות פרוטוקולים שגרתיים.

לנתח עוברים לנוכחות סוג בר, לעקוב אחר a, לעקוב אחר טאו לה ואללים אפסים אחוריים. להכתים את העוברים. השתמש בערכה מסחרית לצביעה רפויה עם השינויים המתוארים כאן.

כדי להתחיל, טבלו את העוברים במאגר A למשך שעה לפחות, תוך ניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן טבלו ישירות את העוברים במאגר B למשך 15 דקות לפחות, תוך ניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לדלל תמיסת מלאי של 40 מיליגרם למיליליטר xal לתמיסה מבוססת רקמות חמות מראש בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר.

והוסיפו חמישה מיליליטר מהתערובת המתקבלת לבקבוקון נצנוץ מזכוכית. העבירו את העוברים לבקבוקון הזכוכית המכיל את התערובת המבוססת על רקמת xal. אוטמים את המכסה עם פרפיל ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

בודק אם יש כתם כחול. לאחר מכן יש לתקן את העוברים עם pH טרי של 4% PFA 7.4. יש לנער בעדינות במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס לפני שטיפת העוברים פעמיים ב-PBS קר כדי לייבש את הרקמה, להניח את העוברים בתערובת של 50% מתנול, 50% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך ניעור בכוס.

המשיכו להתייבש בטמפרטורת החדר תוך ניעור בקבצי זכוכית ב-75% מתנול למשך 30 דקות, ולאחר מכן 90% מתנול למשך 30 דקות. לבסוף, התייבש פעמיים ב-100% מתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן טבלו את העוברים בתערובת אחד לאחד של 100% מתנול ו-100% אלכוהול בנזואיל ובנזואיל בנזואט או BABB למשך 15 דקות.

הקפד להשתמש בזכוכית מכיוון שה-BABB ימיס פלסטיק כשלב אחרון. טבלו עוברים ב-100% BABB כדי לנקות לחלוטין את הרקמה וכדי לדמיין צביעת X cal בעובר המנוקה או הדמיה, ייצבו את העובר השקוע ב-100% BABB בזוויות המתאימות לצילום באמצעות מלקחיים מתכתיים במידת הצורך. האירו באמצעות שילוב של תאורה גבוהה ותאורה נמוכה.

מקורות אור. רכוש תמונות עם מיקרוסקופ מנתח המצויד במצלמה דיגיטלית. בצע חשיפות מרובות של שדה בהירות בחמישה מישורי מוקד עוקבים.

0.5 מילימטרים זה מזה לאורך ציר Z. זמני החשיפה ו-F-stop עשויים להשתנות בהתאם למפרטי התאורה והמצלמה ויש לבצע אופטימיזציה עבור כל הגדרה. השתמש בתוכנה סטנדרטית לעיבוד תמונה כדי לעבד תמונות שכבת-על וליצור מונטאז'ים של תמונות.

הגנוטיפים של עוקבים אחר הומוזיגוטים של טל לאי בחזרה אפס ועוקבים אחר טל לאי הטרוזיגוטים בחזרה. ניתן לקבוע עוברי Snu באופן חד משמעי על ידי גנוטיפ PCR סטנדרטי. צביעת ALS מציגה סוכות אקסונליות היקפיות תת-עוריות מפורטות בעוברים הקרנות אקסון מגרעינים טריגמינליים ופלג גוף עליון וראש מוצגות בעובר הלא מנוקה.

כאן, צביעת GS לשעבר מציגה סוכות אקסונליות היקפיות מפורטות בהקרנות מגרעיני שורש הגב באמצע פלג גוף עליון לפני ואחרי פינוי עם BABB בעוברים שחסרים לחלוטין איתות מסלול A אך נושאים את הקינאז המופעל באופן קונסטיטוטיבי. מוטציית BRAF בשליטה על הקן הספציפי של הנוירונים. במקדם, המורפולוגיה של הקרנות היקפיות של nociceptor התפתחה כמעט כרגיל.

זה מדגים פונקציה מכרעת לאיתות BRAF בצמיחת אקסון היקפי ומראה שניתן להפריד את ההישרדות ואת הפונקציות המקדמות את צמיחת האקסון של איתות מסלול A עם הרקע הגנטי האפס האחורי מחליף את אובדן איתות ההישרדות התלוי במסלול A. חשוב לא לתקן יתר על המידה את העוברים, מה שעלול לפגוע בפעילות האנזימטית של קרחוני בטא. זכרו גם ש-BABB הוא חומר מסוכן מאוד וכאשר עובדים איתו, עליכם תמיד להשתמש באוורור נאות וללבוש ציוד מגן אישי מתאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד ביעילות, להכתים ולדמיין אקסונים מוכתמים רפויים בחיה השלמה.