Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

מקרופאגים הם תאי המפתח המעורבים בפתוגניות של המארח. מקרופאגים מציגים מגוון פנוטיפי ותפקודי שניתן לנתח ולזהות על ידי ניתוח פרוטאומי. מאמר זה מתאר כיצד לבצע אלקטרופורזה דו-ממדית של תרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים המובחנים לפנוטיפ M1 או M2.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הפנוטיפ של M1 פרו-דלקתי אנושי ו-M אנטי דלקתי שתי תת-קבוצות מקרופאגים על ידי דיפרנציאל דו-ממדי באלקטרופורזה של ג'ל. זה מושג על ידי תיוג ראשון של חלבונים המופקים משתי תרביות מקרופאגים ראשוניות M1 ו-M עם צבעי סינוס. בשלב השני, החלבונים מעורבבים יחד ומתבצע מיקוד אלקטרו ISO על ידי התייבשות על הדגימות.

הממד השני הבא, אלקטרופורזה מבוצעת עם שיפוע pH מגויס או רצועות IPG בחושך, ולאחר מכן הג'לים נסרקים עם הדיפרנציאל בסורק אלקטרופורזה בג'ל. בסופו של דבר, ניתוח התמונות הממוספרות מבוצע כדי לזהות את ההבדלים בכתמי הפוליפ בין M1 ו-M שתי תת-קבוצות מקרופאגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו מבין השיטות הקיימות כמו אלקטרופורזה קלאסית של טודי ג'ל, הוא שטכניקה זו רגישה יותר, ודורשת רק חמישה מיקרוגרם של חלבונים, וזה חשוב מאוד לדגימות המתקבלות מחולים אנושיים.

מדגימים את ההליך מריו בוב, דוקטורנט, אוליביה בזה וטכנאי Magac מהמעבדה שלי כדי להכין תרביות ראשוניות של מקרופאגים שמקורם במונוציטים מתחילים בדילול 25 מיליליטר של מעיל באפי ב-25 מיליליטר PBS. לאחר מכן טען בזהירות את הדם המדולל על שיפוע הפרדה וצנטריפוגה של התאים למשך 20 דקות ב-1600 גרם וטמפרטורת החדר כאשר התאים סיימו להסתובב. אסוף את המונוציטים בשכבת הממשק, ולאחר מכן שלוש שטיפות רצופות של התאים שנקטפו ב-10 מיליליטר PBS המכילים 0.1% EDTA לאחר הכביסה השלישית.

סובב את התאים פעם נוספת ב-PBS בלבד, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 ללא זרעי סרום. התאים בצלחות של 35 מילימטר בצפיפות של 1 כפול 10 לששת התאים למנה, ולאחר מכן לאחר שקיעה של 90 דקות באינקובטור, משליכים את הסופרנטנט ושוטפים את המונוציטים הדבקים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. התרבית הבאה, התאים ב-10 מיליליטר של מדיום טרי המכילים 10% נפח לנפח של סרום אנושי למשך שישה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, כדי להניב שני מקרופאגים אנטי דלקתיים, השלימו חלק מהתרביות ב-15 ננוגרם למיליליטר של IL ארבע ביום השישי של התרבית כדי לייצר מקרופאגים פרו-דלקתיים ביום ה-12. טפל בתרביות האחרות של מקרופאגים מובחנים עם 100 ננוגרם למיליליטר LPS למשך ארבע שעות כדי לבודד את תת-קבוצות המקרופאגים לאלקטרופורזה דו-ממדית. לאחר מכן, שטפו את התרבית המעניינת שלוש פעמים עם טריס של 25 מילימולארי, ולאחר מכן שחררו את התאים מתחתית הצלחות עם מאגר מיצוי צ'אפס.

לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר ושרכו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, העבירו את התאים ב-100 מיקרוליטר לאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח ריכוז החלבון למיקוד אלקטרו ISO של תת-קבוצות המקרופאגים. ראשית, התאם את הדגימות לתשע אליקוטות מיקרוליטר, ולאחר מכן צמצם את תמיסות התאים עם מאגר ליזה בתוספת שני מילימולר של TCEP ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר שעה, דגרו את התמציות עם S SI שלוש ו-S SI חמש ב-37 מעלות צלזיוס, ועצרו את התגובה לאחר 30 דקות בתוספת נפח שווה של מאגר דגימה. לאחר מכן צור שתי תערובות נפרדות בנפחים שווים של חלבוני S SI שלושה מסומנים M1 עם SCI חמישה מסומנים M שני חלבונים. לאחר מכן, החזר רצועת IPG עם 450 מיקרוליטר מהדגימות המעורבות המסומנות במאגר מיצוי צ'אפס על מערכת תאי מיקוד איזואלקטרית למשך 24 שעות מבלי להפעיל זרם כלשהו.

למחרת, התחל את המיקוד ב-300 וולט למשך שלוש שעות, ולאחר מכן הגדר שיפוע ל-1000 וולט למשך שש שעות, ואחריו שני שיפועים של 8,000 וולט למשך שלוש שעות כל אחד כדי לבצע אלקטרופורזה של ממד שני לדגור את רצועות ה-IPG במאגר שיווי משקל. לאחר 10 דקות, העבירו את הרצועות לג'לים של 12.5% עמודים ואוטמים אותם עם ארוס נמס נמוך. לאחר מכן השתמש במערכת edin dsic במתח קבוע של 70 וולט כדי לבצע את האלקטרופורזה ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן ריצה של 300 וולט עד שהחזית הכחולה של ברומו פנול מגיעה לתחתית הג'ל כדי לרכוש תמונות של הג'לים.

הנח אותם בין שתי לוחות הזכוכית הפלואורסצנטיים הנמוכים של סורק הדמיית אלקטרופורזה דיפרנציאלית וג'ל, וסרוק את הג'לים באורכי גל פליטת עירור של 5 32, 5 80 ננומטר עבור שלוש ו-6 33 6 70 ננומטר עבור חמישה כדי להפיק תמונות בגודל פיקסל של 100 מיקרומטר. נתח את זה עם התוכנה המתאימה ולאחר מכן חשב ונרמל את נפחי הספוט בכל תמונה, והקצה נפח ספוט מנורמל כפרופורציה מהערך הכולל של כל נקודה שזוהתה בג'ל. נתח את ההבדלים בנפחי ספוט החלבון עבור כל סוג של מקרופאגים על ידי השוואת ערך נפח הנקודה המנורמל בין שתי קבוצות המקרופאגים, בהתחשב בהבדל בין נפחי הנקודה כמשמעותי אם השינוי הוא פי 1.5.

בניסוי הזה. דפוסי החלבון הדו-ממדי של שני תת-הסוגים של מקרופאגים M1 פרו-דלקתיים ו-M שני אנטי דלקתיים נקבעו על ידי דיפרנציאל דו-ממדי. באלקטרופורזה של ג'ל, אותו דפוס של חלבונים נצפה עבור M1 או M two ללא תלות בצבעי הציאן בהם נעשה שימוש.

מעניין שניתוח ביואינפורמטי של הג'ל חשף 20 אזורים המכילים כתמים, עליות וירידות בין נפחי הכתמים כומתו כפי שהודגמו על ידי כתמי הצבע הצהובים, הכחולים והירוקים נחשבו כבעלי ביטוי דיפרנציאלי משמעותי אם שינוי הקיפול של נפח הנקודה המנורמל היה גדול מ-1.5 עם ערך P נמוך מ-0.05. בעקבות CHE זה, ניתן לבצע שיטות כמו כמותי, ספקטרומטריית מסה או ניתוח פרוטאומי נוסף כדי לענות על שאלות נוספות כגון איזה סוג של חלבונים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בין שתי תת-קבוצות המקרופאגים בתגובה לגירויים שונים.