Name: Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: למדו כיצד לכמת מדדי סינפסה אובייקטיביים בצומת הנוירומוסקולרית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית. השיטה מאפשרת הערכת שינויים מבניים בדגמי עכברים של מחלות נוירומוסקולריות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי [570930]. ההדמיה בוצעה במתקן המיקרוסקופיה המתקדמת של מכון בוש. חברים לשעבר במעבדה, שעבודתם מצוטטת, מודים על תרומתם לפיתוח שיטות אלה.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקולים שתוארו כאן, אפשרו לנו למדוד באופן מהימן ולכמת שינויים במאפיינים של NMJ על פני מגוון מצבים, כולל מדינות הזדקנות ומחלות נורמליות. השיטות שתוארו עבור en פנים תמונות NMJ תאפשר לחוקרים להשוות את השטח של התמחויות טרום postsynaptic ואזור חפיפה / יישור הסינפטי. כדי להשוות את עוצמתם היחסית של חלבונים טרום postsynaptic הפרוטוקול השני, המשתמש בחלקים אופטיים רוחביים, הוא מועדף. הפרוטוקול השלישי בוחן באופן ספציפי לשינויים בקרבת האריזה של AChRs בקרום postsynaptic. <p class="jove...

הצומת העצבית-שהרירית (NMJ) היא סינפסה הממסר הקריטית שמתווכת תקשורת בין מערכת העצבים ושרירי שלד. היא נדרשת לכל התנועה רצונית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כבר זמן רב כדי לחקור את ההשפעות של transgenes על העכבר NMJ 1-3 או להשוות את ההשפעות של גיל, תזונה, פעילות גופנית ומחלות על NMJs מכרסמים 4-11. מחקרים מסוג זה לימדו אותנו הרבה על הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של NMJ, אבל הפרמטרים המגוונים דיווחו (למשל, אזור AChR, אזור endplate, אורך היקפי, מדדי פיצול) לעתים קרובות לעשות את זה קשה להשוות את הממצאים של מחקרים אלה. יש ציפייה גוברת לחוקרים פרה-קליניים כדי להיות מסוגלים להפגין שחזור, במיוחד במחקרים עם מודלים של מכרסמים של מחלה 12. הפרוטוקולים שתוארו כאן היו מעודנים באמצעות סדרה של מחקרים שחקרה ch התפתחותית, פיסיולוגי וpathophysiologicalAnges לNMJ. מחקרים מסוג זה דורשים מדידה של השטח של התמחויות הסינפטי בendplate מנוע עכבר והצפיפות היחסית של אריזה של חלבונים סינפטיים בתוך התמחויות postsynaptic 13-15. השירות של שיטות אלה בא לידי ביטוי במחקרים שנעשה לאחרונה במודל של עכברים של אנטי-מושק מיאסטניה גרביס. זריקות יומיות של IgG ממיאסטניה אנטי-מושק חיובית גרביס חולים לעכברים בוגרים שנגרמו להם להיות חלשים בתוך 2 שבועות 16. תמונות מרבי הקרנת Confocal סעיפים שריר שכפול שכותרתו עבור synaptophysin (בעצבי מסופים) וAChRs postsynaptic הציגו ירידה הדרגתית באזור של מכתים AChR כשינוי היסודי. חשוב לציין את קצב הירידה היה די כדי להסביר ירידות דומות במשרעת של פוטנציאלים סינפטיים, כישלון של העברת הסינפטית וחולשת השרירים 17,18. איכותי ממצאים דומים דווחו על ידי קבוצות מחקר אחרות10,19. באותן שיטות מדידת NMJ ומאז נהגו להעריך את ההשפעה של שלוש תרופות לטיפול במיאסטניה גרביס אנטי-המושק ב20,21 מודל העכבר הזה. הזדקנות כרוך בישיבה יכולה להוביל לאובדן של קשרים עצביים-שרירית. הפרוטוקולים שתוארו כאן חשפו ירידת גיל הקשורים בתחום synaptophysin מסוף העצב בendplates המוטורי כמו עכברים להתקדם בגיל מבוגר. באותן השיטות גילו כי פעילות גופנית במידה רבה מרצון יכולה למנוע את הירידה בשטח מסוף עצב presynaptic 22, עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים על ידי קבוצות אחרות 4. אובדן של קשרים עצביים-שרירית מתרחש גם במודל עכבר SOD1G93A של טרשת לרוחב amyotrophic 9,23. המחקרים שהוזכרו לעיל מראים כי מגוון רחב של מצבים בריאותיים עלול להוביל לירידה בשטח של שני התמחויות לפני או אחרי-סינפטי בNMJ. הדבר עלול לגרום כיף הסינפטי לקויction או עשוי לבשר אובדן הקשר העצבי-שהרירית מלא. שלושה פרוטוקולים מתוארים המאפשרים לכמת את האזור והצפיפות של התמחויות הסינפטי. המטרה של הפרוטוקול הראשון היא לספק מידה מעשית ושחזור של התחומים לפני והתמחויות פוסט-סינפטי ויישורם בNMJs היונקים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות דו-ממדיות המרביות confocal ההקרנה וניתוח תמונה עם NIH ImageJ משמש כדי לזהות שינויים באזור של מכתים synaptophysin (שלפוחית ​​סינפטית), AChRs postsynaptic ואזור חפיפה הסינפטי. פרמטרים Confocal הדמיה (רווח לקזז רמה) מותאמים לכל NMJ על מנת למקסם את המידע החזותי המשמש להבחין תחום התמחות הסינפטי. כישלון Neuromuscular יכול לנבוע גם משינויים בצפיפות של AChR postsynaptic ו / או חלבונים סינפטיים אחרים. הפרוטוקול השני ניתן ליישם כדי לזהות שינויים בצפיפות היחסית של חלבוני postsynaptic כזהכמושק, rapsyn, dystroglycan, קינאז Src phosphorylated וAChR phosphorylated 18,21. במיאסטניה גרביס, צפיפות מופחתת של AChR בתוך הקרום postsynaptic היא הגורם המיידי לכישלון הסינפטי וחולשת שרירים. הפרוטוקול השלישי מתאר שיטת העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג) כדי להעריך את השינויים בקרבת AChRs הסמוך בתוך ממברנות postsynaptic 14,15. שיטה זו מזהה העברת אנרגיה בין AChRs השכן שכותרתו עם הניאון-α-bungarotoxin (BGT). סריג מתרחש רק כאשר בדיקות תורם acceptor ניאון בנפרד פחות מ -10 ננומטר. זה יכול לגלות שינויים (תת-מיקרוסקופים) באטימות של אריזת AChR שעשוי להיות קשור ישירות להמשרעת של פוטנציאל הסינפטי. שלושת פרוטוקולים אלה, מעודנים בעשור האחרון, מספקים אמצעי משלימים של יושרת NMJ באופן עקבי לשחזור. שימוש בפרוטוקולים סטנדרטייםפרמטרים nd צריכים לאפשר השוואה של ההשפעות של גנים והתערבויות סביבתיות על NMJ של היונקים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי סורק</td><td>Leica</td><td>DM 2000 עם&nbsp; מערכת TCS SP2</td><td>רוב המיקרוסקופים הקונפוקליים הסורקים צריכים להיות מתאימים.</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>משמש לתיוג AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>פלואורסצנטיות אדומה רחוקה: בקושי נראית דרך העינית&nbsp;</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-סינפטופיזין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18-0130</td><td>קבוצות שונות של נוגדנים ראשוניים נבדלות זו מזו בדילול עבודה יעיל</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>נוגדן חד שבטי מצומד ל-FITC</td></tr><tr><td>FITC-חמור אנטי-ארנב IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>נוגדנים משניים פוליקלונליים יכולים להשתנות באיכותם בהתאם למקור ולאצווה</td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>מטריצת הטמעת קריוסטט להקפאה&nbsp; שרירים</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>מדיום הרכבה המאט את הפוטו-הלבנה של פלואורופורים</td></tr></tbody></table>

neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון synaptic שימוש confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

הצומת העצבית-שהרירית (NMJ) היא סינפסה הגדולה, כולינרגית הממסר שדרכו הנוירונים מוטוריים יונקים לשלוט התכווצות שרירים מרצון. שינויים מבניים בNMJ יכולים לגרום לכישלון עצבית, וכתוצאה מכך חולשה, ניוון ואף למוות של סיבי השריר. מחקרים רבים בחנו כיצד שינויים או מחלה גנטיים יכולים לשנות את המבנה של NMJ העכבר. למרבה הצער, זה יכול להיות קשה כדי להשוות ישירות ממצאים ממחקרים אלה כי לעתים קרובות הם מועסקים פרמטרים שונים ושיטות אנליטיות. שלושה פרוטוקולים מתוארים כאן. הראשון משתמש בתמונות confocal הקרנת עוצמה מקסימלית כדי למדוד את השטח של קולטן האצטילכולין (AChR) -rich תחומים קרום postsynaptic בendplate והאזור של מכתים שלפוחית ​​הסינפטית במסוף עצב presynaptic שמעליה. הפרוטוקול השני משווה את העוצמות היחסית של immunostaining לחלבונים סינפטיים בקרום postsynaptic. יחסי הציבור השלישיotocol משתמש העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג) כדי לזהות שינויים באריזה של AChRs postsynaptic בendplate. הפרוטוקולים פותחו ושוכללו על סדרה של מחקרים. גורמים המשפיעים על האיכות ועקביות של תוצאות נדונים ונתונים נורמטיביים מסופקים NMJs בעכברים צעירים למבוגרים בריאים.

מדידה של שטח Synaptic בNMJ כל הערכה של האזור מסתמכת על הציור של גבול כדי להגדיר את היקף התמחויות הסינפטי. בשרירים צעירים מבוגרים בריאים תמונות NMJ צריכים להציג גבולות מוגדרים היטב עבור שני AChR וצביעת synaptophysin (איור 2 א 'וב'). עוצמת הקרינה לשני AChR וsynaptophysin עולה בחדות בגבול בין חלק פרי הסינפטי והסינפטי של endplate מנוע (איור 5 א 'ו-ב' '). לתמונות כאלה...

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) משתנה במגוון מצבים שיכולים לפעמים להגיע לשיאם בכשל סינפטי. דוח זה מתאר שיטות מבוססות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכימות שינויים מבניים כאלה.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת באופן אובייקטיבי פרמטרים סינפטיים, כולל גודל סינפסה, פיצול והצפיפות היחסית של חלבונים בקרום הפוסט-סינפטי. זה מושג על ידי ניתוח השריר המעניין מחיות הניסוי. לאחר מכן, השריר המנותח נחתך בהקפאה, והחלקים הם כתם חיסוני למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.לאחר מכן בפוס, תמונות של צמתים עצביים-שריריים מקבוצות הטיפול השונות נדגמות באופן אובייקטיבי, והעוצמה היחסית של צביעה עבור התמחויות סינפטיות מכומתת. בסופו של דבר, מדדים כמותיים הניתנים לשחזור של השפעות הטיפול או השינוי הגנטי על הארגון המבני של הצומת העצבי-שרירי מתקבלים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. ובכן, שיטה זו מספקת פרוטוקולים אובייקטיביים סטנדרטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך שינויים במבנה הצומת העצבי-שרירי במודלים של עכברים של הפרעות כגון מיאסטניה גרביס ומחלת נוירונים מוטוריים.בדרך כלל, אנשים שמנסים שיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שדגימת NPLS במיקרוסקופ הקונפוקלי בצורה לא מוטה ואובייקטיבית דורשת תכנון לאחר ניתוח הדגימה של NPLS צריך להתבצע בצורה עקבית וניתנת לשחזור כאשר שונות מבעלי חיים בין פרמטרים של nplate יכולה להקשות על כך. לאחר בידוד הקפאה וצביעה פלואורסצנטית חיסונית, צמתים עצביים-שריריים של עכברים או njs, על פי פרוטוקול הטקסט, מעוורים את השקופיות על ידי תיוג כל אחת מהן במספר אקראי שנשאר ידוע רק לחוקר שני עד לאחר השלמת כימות פרמטרי NMJ. הנח שקופית על המיקרוסקופ tagה והשתמש בסט מסנני trit C כדי להציג אותה תחת תאורת שדה רחבה.עבור בהדרגה בין השדות משמאל לימין ואחורה עד להופעת לוחית קצה בשטח עם חור הסיכה הקונפוקלי המוגדר ליחידה אוורירית 1.0, ובאמצעות עוצמת לייזר נמוכה, מטב את רמות הרווח וההיסט עבור BGT אדום C טריט בלוחית הקצה שיש לצלם. לאחר מכן, באמצעות לייזר 488 ננומטר, בצע אופטימיזציה של הקרינה בהתאמה C, המייצגת סינפטופיזין, ולאחר מכן אסוף ערימת Z של לוחית הקצה עם מרווח של 0.7 מיקרון בין כל פרוסה אופטית. שמור את התמונות עם שם קובץ הכולל את תאריך הפעלת ההדמיה, שם הקוד של השקופית ומספר לוחית הקצה.חזור על הליך הדגימה וההדמיה שזה עתה הודגם עד שנאספו 20 לוחות קצה מהשקופית או הדגימה. ואז חזור על התהליך עבור השקופיות המקודדות הנותרות תחת אותן הגדרות קונפוקליות. צלם כמה תמונות משקופית הבקרה.השתמש בתוכנה החינמית image J כדי לפתוח Zack ובערוץ פלואורסצנטי אחד, הכן תמונת הקרנה מקסימלית. שמור את ההקרנות כקובצי TIF עם שם הקובץ, כולל תאריך הפעלת התמונה, הקוד לדוגמה, מספר לוחית הקצה וערוץ הפלואורסצנט. כעת השתמש בתמונה J כדי לפתוח את הקרנת Z.בחרו בקולטן האצטילכולין או בערוץ התמונה A CHR ובחרו בסוג תמונה של שמונה סיביות כדי להמיר תמונה צבעונית RGB של 24 סיביות לתמונה אחת בגווני אפור של שמונה סיביות על המסך בעזרת הכלי מצולע. בתעלת הכתמים האדומה של BGT, צייר קו מתאר גס סביב לוחית הקצה המעניינת, למעט כל כתמים שמקורם בלוחית הקצה המעניינת. בחרו 'סף התאמת תמונה' כדי להחיל סף עוצמה מינימלי על התמונה.התאם את רמת הסף כדי לבודד את החלקים המוכתמים ב-A CHR תוך אי הכללת אות הרקע שמסביב כתת-סף. לאחר מכן פתח חלון שני עם תמונת הגוון המלא המקורית להשוואה. כדי לאשר את הגדרות הסף כאשר מתאר המצולע עדיין קיים, בחר נתח, נתח חלקיקים בתפריט הנפתח.ציין את טווח הגדלים במספר הפיקסלים מ- 50 עד אינסוף, כך שמבטל בחירה של פריטים זעירים הנובעים מרעש חשמלי. במכפיל התמונות, לחץ על ניתוח חלקיקים כדי ליצור חלון עם רשימה של אזורי סף עליונים דיסקרטיים וערכי עוצמת הקרינה שלהם ממוספרים כפי שהם מופיעים בתמונה הבינארית. העתק נתונים אלה לגיליון אלקטרוני עם תווית כדי למדוד את שטח לוחית הקצה הכולל.בתוך המצולע, בחר נתח מדידה, העתק והדבק את הנתונים עבור אזורים ועוצמות של A CHR בגיליון אלקטרוני עם עמודות מסומנות. עבור לערוץ הסינפטופיזין. הכן תמונת הקרנה מקסימלית.בחר תחום עניין והגדר את סף העוצמה המינימלי כפי שהודגם זה עתה. כדי למדוד את שטח החפיפה, החל את השלבים הבאים. פתחו את הקובץ המקורי הכולל את תמונות שני הערוצים ובחרו אוספי תמונות.ערמו לתמונות כדי לפצל אותה לשתי תמונות נפרדות. באמצעות תוסף הקולוקליזציה של תמונה J, בחר קולוקליזציה של תוסף והזן את ערכי הסף שנרשמו בעבר עבור ערוצי A CHR וערוצי עצב בתיבת שאילתת הערוץ המתאימה. התוצאה היא תמונה חופפת בפיקסלים לבנים.המירו את תמונת החופף החדשה שנוצרה לתבנית בגווני אפור והחילו סף על הערך המרבי, שיבחר רק את הפיקסלים הלבנים המתאימים לאזור החפיפה של שני הערוצים הקודמים. רשום בגיליון האלקטרוני את ערך האזור המתקבל של לוקליזציה, המייצג את אזור החפיפה בפיקסלים, הכן גיליון אלקטרוני של נתונים. אמצעי מדגם מחשבים ומתווים סטיות תקן ושגיאות תקן כהיסטוגרמות או תרשימי פיזור.שרטט וצלחת אזורי CHR כעלילות פיזור או היסטוגרמות תדר כדי לקבוע אם הנתונים מופצים בדרך כלל לפני בדיקה סטטיסטית. לאחר הכנת צביעה אימונו-פלואורסצנטית והדמיה של מקטעים רוחביים של סיבי שריר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, פתח קובץ תמונה מקורי ותוך כדי צפייה בערוץ A CHR, בחר ערימות תמונות לתמונות כדי לפצל את הערוצים בחר סוג תמונה שמונה סיביות כדי להמיר פורמט בגווני אפור של שמונה סיביות למסך. עשה זאת עבור שני ערוצי הקרינה.בחר אוספי תמונות לערימה ופתח אוסף חדש משתי תמונות שמונה סיביות שהופרדו קודם לכן, המאפשר מעבר בין שני ערוצי הקרינה בחלון היחיד בעזרת הכלי מצולע. צייר קו בחוזקה סביב הגבול של צביעת A CHR, בחר מדד ניתוח כדי למדוד את העוצמה הממוצעת עבור A CHR בתוך האזור הסגור. העתק ערך זה לגיליון אלקטרוני עם תווית תוך שמירה על מיתאר המצולע.עבור לערוץ הקרינה השני ובחר נתח מידה. זה יניב את הצביעה הממוצעת עבור החלבון המעניין בתוך האזור הסינפטי המוגדר על ידי צביעת CHR. בחרו אזור הרחק מכתמים גלויים של לוחית הקצה.לאחר מכן בחר נתח מידה כדי למדוד את עוצמת הקרינה הממוצעת ברקע. חזור על המדידה עבור ערוצי הקרינה האחרים והעתק את ערכי הרקע לגיליון העבודה של ערכי הקרינה. הפחיתו את ערכי הרקע הממוצעים מערכי לוחית הקצה כדי לקבל את העוצמות המתוקנות עבור A CHR והחלבון המעניין בכל לוחית קצה.לבסוף, חלקו את ערכי עוצמת ה-nplate המתוקנים עבור החלבון המעניין בעוצמת הקרינה המתוקנת של BGT כדי להניב את יחסי עוצמת הקרינה כפי שמוצג כאן. עוצמת הקרינה הן עבור CHR והן עבור סינפטופיזין עולה בחדות בגבול בין החלק הסינפטי והסינפטי של לוחית הקצה של המנוע. עבור תמונות כאלה, סף מינימלי יבודד בקלות את האזור העשיר ב-A CHR או עשיר בסינפטופיזין של לוחית הקצה.כפי שמודגם באיור זה בעכברים מזדקנים ובמצבי מחלה מסוימים, צביעת לוחית הקצה עבור סינפטופיזין עשויה להיות פחות אינטנסיבית. קצוות אשכול CHR עשויים להיראות מטושטשים, וייתכנו רמות גבוהות יותר של עלילות פיזור אוטופלואורסצנטיות סינפטיות נוספות חושפות טווח ניכר באזור העשיר ב-A CHR בין לוחות הקצה של השריר הקדמי של השוקה של כל עכבר בודד. עם זאת, שטח ה-A CHR הממוצע המבוסס על 15 עד 20 בתמונות לוחית הקצה של הפנים היה דומה בקרב שבעה עכברים לדוגמה בחתכים רוחביים, ה-achr של לוחית הקצה מופיע בדרך כלל כצורת סהר, אך צורה זו לרוב אינה סדירה כפי שמוצג כאן.פלואורסצנציה ברקע בעוצמה נמוכה כפי שמוצג כאן בערוץ Synaptophysin, מגלה בדרך כלל אם טלאי של צביעת CHR מייצג לוחית קצה אחת או שתי לוחות קצה נפרדים הממוקמים על סיבי שריר סמוכים. בנוסף, חלבונים סינפטיים רבים כגון ראפסון, מושק ובטא דיסטרו גליקן ממוקמים יחד עם CHR ב-nplate. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שהנסיינים יישארו עיוורים לקבוצות טיפול וגנוטיפ במהלך הדגימה והניתוח של תמונות nplate.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף, לדגום ולנתח תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של צמתים עצביים-שריריים. בסופו של דבר, החוקרים אמורים להיות מסוגלים להשוות באופן עקבי ואובייקטיבי פרמטרים מבניים שונים של ה-nplate בין קבוצות טיפול וגנוטיפים שונים.

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

צומת נוירומוסקולרי דרוזופילה (NMJ) משמש כמודל לחקר המורפולוגיה והתפקוד של סינפסות. סרטון זה מתאר תכונות חשובות שהחוקרים מכמתים כדי לאפיין את NMJ. הפרוטוקול לדוגמה מדגים תוכנה המסוגלת לבצע את הכימות באופן אוטומטי.

דרוזופילה כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

מקור: Marinello, M., et al. אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את ההכנה, הצביעה החיסונית וההדמיה של צמתים עצביים-שריריים ברקמת שריר החולדה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה כדי לדמיין ולנתח מבנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים.

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מורפומטרי של צמתים עצביים-שריריים על ידי מיקרוסקופיה משולבת של קונפוקל ו-STED המשמשת לכימות שינויים פתולוגיים במודלים של עכברים של SMA ו-CMS הקשורים ל-ColQ.

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

למדו כיצד לכמת מדדי סינפסה אובייקטיביים בצומת הנוירומוסקולרית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית. השיטה מאפשרת הערכת שינויים מבניים בדגמי עכברים של מחלות נוירומוסקולריות שונות.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים