Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת באופן אובייקטיבי פרמטרים סינפטיים, כולל גודל סינפסה, פיצול והצפיפות היחסית של חלבונים בקרום הפוסט-סינפטי. זה מושג על ידי ניתוח השריר המעניין מחיות הניסוי. לאחר מכן, השריר המנותח נחתך בהקפאה, והחלקים הם כתם חיסוני למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

לאחר מכן בפוס, תמונות של צמתים עצביים-שריריים מקבוצות הטיפול השונות נדגמות באופן אובייקטיבי, והעוצמה היחסית של צביעה עבור התמחויות סינפטיות מכומתת. בסופו של דבר, מדדים כמותיים הניתנים לשחזור של השפעות הטיפול או השינוי הגנטי על הארגון המבני של הצומת העצבי-שרירי מתקבלים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. ובכן, שיטה זו מספקת פרוטוקולים אובייקטיביים סטנדרטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך שינויים במבנה הצומת העצבי-שרירי במודלים של עכברים של הפרעות כגון מיאסטניה גרביס ומחלת נוירונים מוטוריים.

בדרך כלל, אנשים שמנסים שיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שדגימת NPLS במיקרוסקופ הקונפוקלי בצורה לא מוטה ואובייקטיבית דורשת תכנון לאחר ניתוח הדגימה של NPLS צריך להתבצע בצורה עקבית וניתנת לשחזור כאשר שונות מבעלי חיים בין פרמטרים של nplate יכולה להקשות על כך. לאחר בידוד הקפאה וצביעה פלואורסצנטית חיסונית, צמתים עצביים-שריריים של עכברים או njs, על פי פרוטוקול הטקסט, מעוורים את השקופיות על ידי תיוג כל אחת מהן במספר אקראי שנשאר ידוע רק לחוקר שני עד לאחר השלמת כימות פרמטרי NMJ. הנח שקופית על המיקרוסקופ tagה והשתמש בסט מסנני trit C כדי להציג אותה תחת תאורת שדה רחבה.

עבור בהדרגה בין השדות משמאל לימין ואחורה עד להופעת לוחית קצה בשטח עם חור הסיכה הקונפוקלי המוגדר ליחידה אוורירית 1.0, ובאמצעות עוצמת לייזר נמוכה, מטב את רמות הרווח וההיסט עבור BGT אדום C טריט בלוחית הקצה שיש לצלם. לאחר מכן, באמצעות לייזר 488 ננומטר, בצע אופטימיזציה של הקרינה בהתאמה C, המייצגת סינפטופיזין, ולאחר מכן אסוף ערימת Z של לוחית הקצה עם מרווח של 0.7 מיקרון בין כל פרוסה אופטית. שמור את התמונות עם שם קובץ הכולל את תאריך הפעלת ההדמיה, שם הקוד של השקופית ומספר לוחית הקצה.

חזור על הליך הדגימה וההדמיה שזה עתה הודגם עד שנאספו 20 לוחות קצה מהשקופית או הדגימה. ואז חזור על התהליך עבור השקופיות המקודדות הנותרות תחת אותן הגדרות קונפוקליות. צלם כמה תמונות משקופית הבקרה.

השתמש בתוכנה החינמית image J כדי לפתוח Zack ובערוץ פלואורסצנטי אחד, הכן תמונת הקרנה מקסימלית. שמור את ההקרנות כקובצי TIF עם שם הקובץ, כולל תאריך הפעלת התמונה, הקוד לדוגמה, מספר לוחית הקצה וערוץ הפלואורסצנט. כעת השתמש בתמונה J כדי לפתוח את הקרנת Z.

בחרו בקולטן האצטילכולין או בערוץ התמונה A CHR ובחרו בסוג תמונה של שמונה סיביות כדי להמיר תמונה צבעונית RGB של 24 סיביות לתמונה אחת בגווני אפור של שמונה סיביות על המסך בעזרת הכלי מצולע. בתעלת הכתמים האדומה של BGT, צייר קו מתאר גס סביב לוחית הקצה המעניינת, למעט כל כתמים שמקורם בלוחית הקצה המעניינת. בחרו 'סף התאמת תמונה' כדי להחיל סף עוצמה מינימלי על התמונה.

התאם את רמת הסף כדי לבודד את החלקים המוכתמים ב-A CHR תוך אי הכללת אות הרקע שמסביב כתת-סף. לאחר מכן פתח חלון שני עם תמונת הגוון המלא המקורית להשוואה. כדי לאשר את הגדרות הסף כאשר מתאר המצולע עדיין קיים, בחר נתח, נתח חלקיקים בתפריט הנפתח.

ציין את טווח הגדלים במספר הפיקסלים מ- 50 עד אינסוף, כך שמבטל בחירה של פריטים זעירים הנובעים מרעש חשמלי. במכפיל התמונות, לחץ על ניתוח חלקיקים כדי ליצור חלון עם רשימה של אזורי סף עליונים דיסקרטיים וערכי עוצמת הקרינה שלהם ממוספרים כפי שהם מופיעים בתמונה הבינארית. העתק נתונים אלה לגיליון אלקטרוני עם תווית כדי למדוד את שטח לוחית הקצה הכולל.

בתוך המצולע, בחר נתח מדידה, העתק והדבק את הנתונים עבור אזורים ועוצמות של A CHR בגיליון אלקטרוני עם עמודות מסומנות. עבור לערוץ הסינפטופיזין. הכן תמונת הקרנה מקסימלית.

בחר תחום עניין והגדר את סף העוצמה המינימלי כפי שהודגם זה עתה. כדי למדוד את שטח החפיפה, החל את השלבים הבאים. פתחו את הקובץ המקורי הכולל את תמונות שני הערוצים ובחרו אוספי תמונות.

ערמו לתמונות כדי לפצל אותה לשתי תמונות נפרדות. באמצעות תוסף הקולוקליזציה של תמונה J, בחר קולוקליזציה של תוסף והזן את ערכי הסף שנרשמו בעבר עבור ערוצי A CHR וערוצי עצב בתיבת שאילתת הערוץ המתאימה. התוצאה היא תמונה חופפת בפיקסלים לבנים.

המירו את תמונת החופף החדשה שנוצרה לתבנית בגווני אפור והחילו סף על הערך המרבי, שיבחר רק את הפיקסלים הלבנים המתאימים לאזור החפיפה של שני הערוצים הקודמים. רשום בגיליון האלקטרוני את ערך האזור המתקבל של לוקליזציה, המייצג את אזור החפיפה בפיקסלים, הכן גיליון אלקטרוני של נתונים. אמצעי מדגם מחשבים ומתווים סטיות תקן ושגיאות תקן כהיסטוגרמות או תרשימי פיזור.

שרטט וצלחת אזורי CHR כעלילות פיזור או היסטוגרמות תדר כדי לקבוע אם הנתונים מופצים בדרך כלל לפני בדיקה סטטיסטית. לאחר הכנת צביעה אימונו-פלואורסצנטית והדמיה של מקטעים רוחביים של סיבי שריר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, פתח קובץ תמונה מקורי ותוך כדי צפייה בערוץ A CHR, בחר ערימות תמונות לתמונות כדי לפצל את הערוצים בחר סוג תמונה שמונה סיביות כדי להמיר פורמט בגווני אפור של שמונה סיביות למסך. עשה זאת עבור שני ערוצי הקרינה.

בחר אוספי תמונות לערימה ופתח אוסף חדש משתי תמונות שמונה סיביות שהופרדו קודם לכן, המאפשר מעבר בין שני ערוצי הקרינה בחלון היחיד בעזרת הכלי מצולע. צייר קו בחוזקה סביב הגבול של צביעת A CHR, בחר מדד ניתוח כדי למדוד את העוצמה הממוצעת עבור A CHR בתוך האזור הסגור. העתק ערך זה לגיליון אלקטרוני עם תווית תוך שמירה על מיתאר המצולע.

עבור לערוץ הקרינה השני ובחר נתח מידה. זה יניב את הצביעה הממוצעת עבור החלבון המעניין בתוך האזור הסינפטי המוגדר על ידי צביעת CHR. בחרו אזור הרחק מכתמים גלויים של לוחית הקצה.

לאחר מכן בחר נתח מידה כדי למדוד את עוצמת הקרינה הממוצעת ברקע. חזור על המדידה עבור ערוצי הקרינה האחרים והעתק את ערכי הרקע לגיליון העבודה של ערכי הקרינה. הפחיתו את ערכי הרקע הממוצעים מערכי לוחית הקצה כדי לקבל את העוצמות המתוקנות עבור A CHR והחלבון המעניין בכל לוחית קצה.

לבסוף, חלקו את ערכי עוצמת ה-nplate המתוקנים עבור החלבון המעניין בעוצמת הקרינה המתוקנת של BGT כדי להניב את יחסי עוצמת הקרינה כפי שמוצג כאן. עוצמת הקרינה הן עבור CHR והן עבור סינפטופיזין עולה בחדות בגבול בין החלק הסינפטי והסינפטי של לוחית הקצה של המנוע. עבור תמונות כאלה, סף מינימלי יבודד בקלות את האזור העשיר ב-A CHR או עשיר בסינפטופיזין של לוחית הקצה.

כפי שמודגם באיור זה בעכברים מזדקנים ובמצבי מחלה מסוימים, צביעת לוחית הקצה עבור סינפטופיזין עשויה להיות פחות אינטנסיבית. קצוות אשכול CHR עשויים להיראות מטושטשים, וייתכנו רמות גבוהות יותר של עלילות פיזור אוטופלואורסצנטיות סינפטיות נוספות חושפות טווח ניכר באזור העשיר ב-A CHR בין לוחות הקצה של השריר הקדמי של השוקה של כל עכבר בודד. עם זאת, שטח ה-A CHR הממוצע המבוסס על 15 עד 20 בתמונות לוחית הקצה של הפנים היה דומה בקרב שבעה עכברים לדוגמה בחתכים רוחביים, ה-achr של לוחית הקצה מופיע בדרך כלל כצורת סהר, אך צורה זו לרוב אינה סדירה כפי שמוצג כאן.

פלואורסצנציה ברקע בעוצמה נמוכה כפי שמוצג כאן בערוץ Synaptophysin, מגלה בדרך כלל אם טלאי של צביעת CHR מייצג לוחית קצה אחת או שתי לוחות קצה נפרדים הממוקמים על סיבי שריר סמוכים. בנוסף, חלבונים סינפטיים רבים כגון ראפסון, מושק ובטא דיסטרו גליקן ממוקמים יחד עם CHR ב-nplate. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שהנסיינים יישארו עיוורים לקבוצות טיפול וגנוטיפ במהלך הדגימה והניתוח של תמונות nplate.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף, לדגום ולנתח תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של צמתים עצביים-שריריים. בסופו של דבר, החוקרים אמורים להיות מסוגלים להשוות באופן עקבי ואובייקטיבי פרמטרים מבניים שונים של ה-nplate בין קבוצות טיפול וגנוטיפים שונים.