Name: תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: חקור תקנת מזין רציפה מותאמת לגידול בתאי יונקים ב־spheroids. השיטה משפרת שיעורי גידול ומפצה חומרי מזון באופן אחיד בביוריאקטורים מעורערים ליישומי תרפיות תאיות בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למייקל גרווד וסם שטיין על הערותיהם המועילות, ולקריסטן מ. מיינרד על הסיוע בהכנת כתב היד.

למחברים אין מה לחשוף.

יצירת מוצרי תאים יונקים לייצור חומרים ביולוגיים עבור טיפולים בתאים דורשת ההתרבות וניטור בתאי יונקים בקנה מידה גדולה 55 - 58. יתר על כן, יישומים אלה מחייבים שורה של תנאי התרבות מוגדרות ומאומתים. כל שעליך לעשות הוא להגדיל את הנפח של תאים באמצעות טכנולוגיות מחקר לא לענות על כל הדרישות הללו. שינויים בינוניים ידניים גורמים לתנודות חומרים מזינות הצטברות של חומרים פסולת להפחית תא באיכות, כדאיות ואת תשואה. שימוש bioreactors הוא מבוסס היטב על התרבות הממוסחר...

כדי לייצר מספר רב של תאים אנושיים קיימא והפונקציונליים להשתלה, הסדרת תנאי התרבות הכרחית. דלדול של חומרי הזנה, יחד עם הצטברות הפסולת המטבולית הם התורמים העיקריים לשינויים מהזדקנות מטבולית לפגוע באיכות התא המוצר 1 - 3. הליך זה מדגים שיטה בתאי יונקים תרבות spheroids באמצעות bioreactor עוררה בשילוב עם מערכת האכלה שיעור זלוף המתואם להסדיר גלוקוז בטווח הפיזיולוגי 4 לכל אורכו של התרבות. לצורך המחקרים הללו, לטווח הפיזיולוגי הוגדר בין 100 ל -200 מ&quot;ג / ד&quot;ל. אותן שיטות שניתן להשתמש בהם כדי להסדיר מזינים אחרים ופסולת מטבולית כגון חומצת חלב. תרבויות סטטי בנפחים קטנים (1 - 30 מיליליטר) משמשות בדרך כלל את הגדרת המעבדה לשמור ולבדל שורות תאים עבור experimeלמטרות פתיחות opening סגירות closures. passaging Cell מתבצע עם שינויים בינוניים מלאים לפי צורך במרווחים קבועים. רוב &quot;קונבנציונלי&quot; מדיום התרבות יש ריכוז גלוקוז גבוה (450 מ&quot;ג / ד&quot;ל DMEM שימוש במחקרים אלה) כדי לאפשר את השינויים בינוניים תכופים פחות, מבלי להסתכן ביצירת מגבלות מזינות. עם זאת, שיטה-האכלה תצווה זה עדיין דורשת מניפולציה תכופה, מציגה השתנות סביבת התא, ומגבירה את הסיכון לזיהום 5 - 9. Bioreactors השעיה עוררה (SSB) לספק ערבוב טוב יותר וירידת טיפול 3,10 - 20, אבל כמו תרבויות סטטי מצריך שינוי בינוני ידני שתורמים תנודות שעלולות להזיק ברמות המוצר מזינות ופסולת. האכלה זלוף של תרבויות SSB מפחיתה בעיות אלו על ידי עירוי מתמשך והסרה של מדיום, אבל שינויים גדולים ברמות מזינות עקב צמיחת תאים להישאר בעיה. השימוש של ra האכלה מתואםte מחישובים של שימוש מזין על בסיס דרישות תא מוערך יכול לספק את סביבת תאי יציבות נדרשת לייעל כדאיויות תא ומתפקד 21 - 24. ישנו גוף גדול של ספרות המתאר שיטות תרבויות SSB להרחבה של בתאי יונקים במיוחד עבור התרבות והרחבת תאים פלוריפוטנטיים 25 - 32, עם אחרים התמקדו איון (בטא) תאים 17,33,34, או ייצור של מוצרים ביולוגיים 24, 35 - 38. רבים של סוגי התאים הנחקרים אלה עשויים להיות מבוגרים בתרבויות אליפטית, ונהלים ספציפיים עבור סוג התא בשימוש צריכים להיות מותאמים לפני יישום מערכת האכלה רציפה. בהפגנה זו, שיטת האכלת זלוף שמשה להרחיב קו תאי בטא גדל כמו spheroids בתוך bioreactor בחש 39 - 43. השיטה המתוארת במסמך זה מספקיישום פשוט של האכלת התאמות שיעור המבוססות על מדידות גלוקוז off-line כדי להשיג תנאי תרבות ממוקדות. התאמת קצב ההזנה בשיטה זו כדי לשמור על רמת גלוקוז פיזיולוגית מוצגת לתשואות תא עליות. בתאי יונקים מותנים מזין, גלוקוז מפתח, לייצור אנרגיה, ולכן שימוש שורות התאים מהווה מודל עבור בתאי יונקים בתרבית רבים 44. בנוסף, קו זה מדגים את המורכבות גדולות יותר של תאי בטא, אשר רגישים לרמות גבוהות הכרוניות של גלוקוז 45. לצורך המחקר, תאי β-TC6 הורשו יוצרים spheroids בתרבות כדי להיות קרובים ככל האפשר הגודל הממוצע של איי לנגרהנס in vivo. מערכת bioreactor זלוף 17 - 19,21,46 עם שיעור להאכיל המותאם לגלוקוז צריכה, הביאה שמירת מצבים פיסיולוגיים תשואות תא גבוהות ללא שינויים כדאיים.

<table><tbody><tr><td>&#946; תאי TC-6</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>קו תאי אינסולינומה של עכבר (סוג תא דבק)</td></tr><tr><td>DPBS No Ca, No Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dubbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>ראה להלן למספרי מוצרים&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה (500 מ"מ)</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז נמוך (100 מ"מ)</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (שימו לב שמדיום זה כבר מכיל פירובאט)</a></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>סרום חזיר מומת בחום</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 צלוחיות מטופלות בתרבית רקמות</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>430825</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(מדעי החיים) & categoryname=</td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים NuAire</td><td>פרינסטון, מינסוטה</td><td></td><td>ארה"ב Autoflow. ניתן להשתמש בכל חממת תרבית תאים מווסתת CO2 עם מעטפת מים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>סורוול RT 7 (ניתן להשתמש בכל צנטריפוגה שולחנית דומה)</td></tr><tr><td>מקרר</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מקרר מעבדה (נעשה שימוש בגרסת שולחן קטנה למחקרים אלה)</td></tr><tr><td>1 ליטר בקבוק זכוכית</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>1395-1 ליטר</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(מדעי החיים) & categoryname=</td></tr><tr><td>2 ליטר בקבוק זכוכית</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>1395-2L</td><td>כל ספק יכול לשמש</td></tr><tr><td>250 מ"ל ביו-ריאקטורים מעורבבים&nbsp;</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(מדעי החיים) & categoryname=</td></tr><tr><td>צלחת ערבוב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-496-104A</td><td>ניתן להשתמש בכל צלחת ערבוב בטוחה לחממה, כל ספק</td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות 100 מ"מ קוטר</td><td>Nunc, רוצ'סטר, ניו יורק (פישר סיינטיפיק)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק (הוזמן דרך Fisher Sci)</td></tr><tr><td>FALCON 50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פלקון, סן חוזה, קליפורניה</td><td>1256598</td><td>כל ספק יכול לשמש</td></tr><tr><td>פלסטיק Delran המשמש לחלקים מותאמים אישית</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>שונים</td><td>ניתן להשתמש בכל חומר לבחירה, אך דרן נבחר מכיוון שהוא בטוח לחיטוי, לא תגובתי וקל לעיבוד.</td></tr><tr><td>http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac צינור נירוסטה למכסים מותאמים אישית</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>שונים</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>מכסי ביו-ריאקטור של Delran ששונו בהתאמה אישית להאכלה רציפה</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>לא מודע לספקים המייצרים מוצר דומה</td></tr><tr><td>מכסי בקבוקי זכוכית מותאמים אישית להאכלה רציפה</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>חלק מהספקים (למשל , Fischer Sci, Corning) מייצרים מוצרים דומים בקישורים למטה.</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית דיגיטלית Masterflex</td><td>קול פארמר, ורנון הילס, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>ניתן להשתמש בכל משאבה פריסטלטית מדויקת. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>מחברי צינורות PVDF (שונים)</td> <td>קול פארמר, ורנון הילס, אילינוי</td><td>ראה קישור ניתן</td><td>להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>צינורות BPT חמושים L/S 16</td><td>קול פארמר, ורנון הילס, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>צינורות BPT חמושים L/S 14</td><td>קול פארמר, ורנון הילס, אילינוי</td><td>WU-06508-14</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>צינורות BPT חמושים L/S 13</td><td>קול פארמר, ורנון הילס, אילינוי</td><td>WU-06508-13</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Millipore Millex GP ממברנה PES 0.22 & #181; l מסנן מזרק סטרילי (משמש לאוורור וסינון בינוני)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SLGP033RS</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק 25</td></tr><tr><td>מ"ל פיפטה פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>13-678-11</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, וניתן להשתמש בגדלים שונים</td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בהמוציטומטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-671-6</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>Leica</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה One</td></tr><tr><td>Touch Ultra Blood Glucose Meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה (למשל, Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק או במוצר דומה (e., Bayer)</td></tr></tbody></table>

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב spheroids

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

בהדגמה זו, ספרואידים שנוצרו מקו תאי האינסולינומה β-TC6 תורבבו כמודל לייצור מוצר תאי אי יונקים כדי להדגים כיצד ויסות רמות החומרים המזינים יכול לשפר את תפוקת התאים. במחקרים קודמים, ביו-ריאקטורים אפשרו נפחי תרבית מוגברים על פני תרביות סטטיות, אך לא נצפתה עלייה בתפוקת התאים. מגבלות בחומרים מזינים מרכזיים כמו גלוקוז, שנצרכו בין האכלות אצווה, עלולות להוביל למגבלות בהתרחבות התאים. נצפו תנודות גדולות ברמות הגלוקוז, למרות העלייה בריכוזי הגלוקוז בתקשורת. השימוש במערכות הזנה רציפה ביטל תנודות ברמות הגלוקוז, ושיפר את קצב צמיחת התאים בהשוואה לשיטות תרבית סטטיות ו-SSB. עליות נוספות בשיעורי הגדילה נצפו על ידי התאמת קצב ההזנה על סמך צריכת חומרים מזינים מחושבת, שאפשרה שמירה על גלוקוז פיזיולוגי במשך שלושה שבועות בתרבית. ניתן להתאים שיטה זו גם לסוגי תאים אחרים.

רמות תנודות גלוקוז בינוניות הגבל הרחבת תא בתרבויות SSB הרגיל רמות גלוקוז להשתנות בתרבויות סטטי ותרבויות SSB לאורך תקופת התרבות 3. תנודות אלה להגביר עם הגדלת מספר סלולארי במהלך תקופת תרבות 21-היום היו כמעט זהים הוא בתרבויות סטטי SSB. תצפיות אלו מוצגות בפרסום הקודם שלנו 3. רמות גלוקוז יכולות להיות סופר-פיזיולוגית למשך תקופת התרבות עבור שני השיטות. בגלל חשיפה כרונית זה עלולה לע...

ויסות נוטריינטים באמצעות הזנה מותאמת לצמיחה מתמשכת משפר את שיעורי הגדילה של ספרואידים של תאי יונקים בהשוואה להזנת אצווה לסירוגין עבור תרביות בביו-ריאקטורים מעורבבים. מחקר זה מדגים את השיטות הנדרשות להקמת תרביות פשוטות המוזנות בקצב מותאם.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

המטרה הכוללת של תהליך זה היא לתרבית מספר רב של תאים בתנאים תזונתיים מבוקרים. שימוש בציוד קונבנציונאלי שנמצא במעבדה לתרבית תאים. האלגוריתמים הקשורים מאפשרים בקרה ומניפולציה של חומרים מזינים בטווחי הניסוי.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח עבור יישומי תרבית תאים בקנה מידה גדול. כגון טיפולים תאיים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כלומר מתקנים, תרבית תאים בקנה מידה גדול עם פיזור אחיד של חומרים מזינים וגזים.זה מאפשר צפיפות תאים גבוהה יותר מאשר תרביות תאים סטטיות או מוזנות בתפזורת, מגדיל את התשואה ומפחית את אובדן התאים. ניתן לעשות זאת באמצעות ציוד הנפוץ ברוב מעבדות תרביות התאים. הדגמה חזותית של שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים חדשים מכיוון שטכניקות אלה בהן נעשה שימוש יכולות להיות קשות לשליטה, בשל המספר הגדול של צעדים שיש לבצע בסדר מסוים בתנאים סטריליים.אסוף את חמשת המרכיבים העיקריים הדרושים למערכת ההאכלה. מאגר בינוני, משאבה פריסטלטית, ביו-ריאקטור מעורבב, מאגר פסולת וסט דגימת צינורות בעיצוב אישי. הקימו את המאגר הבינוני באמצעות בקבוק זכוכית של ליטר אחד.מאגר הפסולת באמצעות בקבוק זכוכית של שני ליטר. הביוריאקטור המעורבב באמצעות כור זכוכית בנפח 250 מ"ל. השתמש במשאבה פריסטלטית דיגיטלית, או משאבה דומה עם ראש משאבה בעל שמונה ערוצים כדי לשלוט בהחלפת המדיום.הרכיבו את המאגר ואת מכסי הביוריאקטור ששונו מפלסטיק קשיח וניתן לחיטוי. עם יציאות מעבר צינור נירוסטה כדי לספק אוורור דרך מסננים סטריליים, ולאפשר העברה בינונית בין מאגרים וביו-ריאקטורים. חבר צינור יציאה המיוצר מצינורות אוורור זכוכית נקבובית למכסה הביוריאקטור המתלה המעורבב שונה.הרכיבו ערכות צינורות זלוף הניתנות לחיטוי ממחברי צינורות פלואוריד פוליווינילידן, וצינורות משאבה פריסטלטיים עמידים. אורך הקטע תלוי במרחק בין הרכיבים השונים. הרכיבו את קו ההזנה באמצעות שני קוטר צינורות.השתמש ב-L/S 14 עבור הצינור הראשי שישתרע על פני המרחק מהביו-ריאקטור למאגר הבינוני. הכנס אורך מיון של צינורות L/S 13 באמצע אורך הצינור עבור קטע המשאבה, באמצעות מתאמי PVDF המתאימים. השתמש במתאמי צינורות דוקרניים סטנדרטיים של PVDF כדי לחבר שתי חתיכות של צינורות L/S 14 משני צידי צינור קטע המשאבה הקצר יותר.הרכיבו את קטע צינורות החתך לפינוי פסולת באמצעות צינורות L/S 16 בקוטר גדול יותר, והכנסו קטע קצר של צינורות L/S 14 באמצע לקטע השאיבה. זה נעשה באותו אופן כמו מכלול קו ההזנה באמצעות מתאמי צינור PVDF. הרכיבו את הרכיב הסופי של ערכת הצינורות על ידי בניית הסט משלושה אורכי צינורות קצרים L/S 14.מחובר יחד עם מחבר HVDF מסוג T, ושני מהדקי צינור קטנים בשניים מאורכי הצינורות. חבר את מכלול הדגימה למחבר דגימת הנירוסטה המחובר על מכסה הביוריאקטור. לאחר העיקור יחובר מסנן גז סטרילי לאוורור גז לאחד האורכים המהודקים.השני משמש לחיבור למזרק דגימה סטרילי. חיטוי מכלול הדגימה כשהוא מחובר לביו-ריאקטור, לפני תחילת הניסוי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש במכלול זה כדי לאסוף דגימות סטריליות מהביו-ריאקטור לפי הצורך, מבלי להפריע לתהליך ההזנה הרציף.חבר פתחי אוורור סטריליים למקומות המתאימים על מכסי בקבוק הספינר, הכלי הבינוני, כלי הפסולת ויציאות הדגימה. תרבית וקצור את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אפשרו לתאים לדגור בטמפרטורת החדר בטריפסין במשך שתיים-שלוש דקות בארון בטיחות ביולוגית, ולאחר מכן אספו אותם לתוך צינור חרוטי.לאחר מכן נאספת דגימת תא קטנה ומוכתמת בכחול טריפאן. ספרו את צפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ והמוציטומטר סטנדרטי עם צביעה כחולה טריפאן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את המספר הרצוי של סך התאים לביו-ריאקטורים מתלים סטריליים עבור כל מצב.הוסף את המדיום לביו-ריאקטור ההשעיה המעורבב באמצעות פיפטה כדי להגיע לנפח התרבית הכולל הרצוי. העבר את הביוריאקטור המתלה המעורבב עם תאים לצלחת ערבוב בתוך חממת תרבית תאים. תאי תרבית בביו-ריאקטורים ללא הזנה במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, 100% לחות יחסית וקצב ערבוב של 70 סל"ד כדי לאפשר לספרואידים להיווצר.לאחר היווצרות ספרואיד הסר את הביוריאקטור המתלה המעורבב מהחממה. הרכיבו את הרכיבים למערכת ההזנה הרציפה בארון בטיחות ביולוגי. ראשית מלאו מאגר בינוני טרי במדיום התרבות הרצוי ואז התחברו לצד אחד של קו ההזנה.כמו כן, ודא שהמאגר הבינוני הטרי מאוורר כראוי עם מסנן סטרילי. יש להחליף מסנן סטרילי ביציאת כניסת הביוריאקטור כדי לסנן את המדיום לפני שהוא נכנס לביו-ריאקטור. חבר את קו הפסולת למאגר הפסולת הבינונית וודא שמאגר הפסולת מאוורר כראוי עם מסנן סטרילי.הנח את הביוריאקטור המתלה המעורבב על צלחת הערבוב שבתוך החממה תוך שימוש באותם פרמטרים של תרבית כמו להיווצרות ספרואידים. הכניסו את המאגר הבינוני הטרי למקרר מיני סמוך. ודא שקווי ההזנה מסוגלים לצאת מהמקרר מבלי למנוע את סגירת הדלתות.זה גם קריטי שקווי ההזנה לא ייסגרו על ידי דלתות המקרר או החממה. ניתן להניח את מאגר הפסולת הבינוני על הספסל מחוץ לחממה במיקום נוח. העבירו את קצוות הצינורות הנותרים לתוך החממה וחברו את קו ההזנה למסנן ביציאת הכניסה של הביוריאקטור.לאחר מכן חבר את קו הפסולת ליציאת צינור היציאה. לאחר מכן, הנח את קטע המשאבה של קווי ההזנה והפסולת לתוך ראש המשאבה, תוך הקפדה על הכיוון הנכון כך שקווי ההזנה ישאבו מדיום ממאגר המדיום הטרי לתוך הביוריאקטור המתלה המעורבב, וקווי הפסולת ישאבו מדיום מהביו-ריאקטור, ולמאגר מדיום הפסולת. חשב את קצב ההזנה באמצעות משוואת קצב ההזנה המותאם כמתואר בפרוטוקול הטקסט.השתמש בדגימה העדכנית ביותר עם מידע על ספירת תאים, יחד עם חיזוי קצב הגדילה ומדידות הגלוקוז הבינוניות כדי להעריך את קצב ההזנה הדרוש לשמירה על ריכוז הגלוקוז הרצוי בתרבית. הגדר את מהירות המשאבה על סמך קצב ההזנה המחושב. חזור על חישוב קצב ההזנה והתאם את מהירות המשאבה עבור כל נקודת דגימה.מדידות גלוקוז בינוניות מוצגות מתרביות ספרואידים אינסולינומה בטא-TC6 באמצעות ביו-ריאקטורים סטטיים מעורבבים, ושיטות תרבית ביו-ריאקטור מעורבב במזל מעורבב. האכלה עם מדיום גלוקוז גבוה סטנדרטי. ההזנה הרציפה מסוגלת לבטל את תנודות הגלוקוז, אך רמות הגלוקוז הממוצעות במדיום משתנות באופן דרמטי במהלך תקופת התרבית, והן הרבה מעל הטווח הפיזיולוגי.ההזנה המותאמת מסוגלת לבטל את התנודות, כמו גם לשמור על ריכוזי הגלוקוז ליד רמות פיזיולוגיות למשך תקופת התרבות. כאן גידול תאים המדווח כשינוי קיפול במספר התאים במהלך תקופת התרבית של 21 יום מושווה לביו-ריאקטורים מעורבבים עם שינויים בינוניים קבועים, קצב הזנה קבוע תרביות ביו-ריאקטור מעורבב וקצב הזנה מותאם. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תנאים משתנים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו דרישות תזונה לקווי תאים חדשים, או תוצאות ניסוי ספציפיות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הדרישות המטבוליות בתאים מבני אדם עם סרטן או הפרעות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב מערכת תרבית תאי שפע כדי לשלוט טוב יותר בתנאי התרבות ולמקסם את תפוקת התאים. אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הגנה מפני פתוגנים הנישאים בדם בעת ביצוע הליך זה.

nutrient-regulation-continuous-feeding-for-large-scale-expansion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ספרואידים הם סוג של מודל תרבית תאים תלת-ממדי המשמש לייצוג מדויק יותר של סביבת התא בהשוואה למודלים חד-שכבתיים של תרבית תאים דו-ממדית. בפרוטוקול לדוגמה, נראה מדענים מייצרים ספרואידים מקו תאים של סרטן המעי הגס ומיישמים הדמיה של תאים חיים כדי לעקוב אחר גדילת הספרואידים.

יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

חקור תקנת מזין רציפה מותאמת לגידול בתאי יונקים ב־spheroids. השיטה משפרת שיעורי גידול ומפצה חומרי מזון באופן אחיד בביוריאקטורים מעורערים ליישומי תרפיות תאיות בקנה מידה גדול.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

גלה סרטונים נוספים