תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids
25 בספטמבר 2016
ויסות נוטריינטים באמצעות הזנה מותאמת לצמיחה מתמשכת משפר את שיעורי הגדילה של ספרואידים של תאי יונקים בהשוואה להזנת אצווה לסירוגין עבור תרביות בביו-ריאקטורים מעורבבים. מחקר זה מדגים את השיטות הנדרשות להקמת תרביות פשוטות המוזנות בקצב מותאם.
המטרה הכוללת של תהליך זה היא לתרבית מספר רב של תאים בתנאים תזונתיים מבוקרים. שימוש בציוד קונבנציונאלי שנמצא במעבדה לתרבית תאים. האלגוריתמים הקשורים מאפשרים בקרה ומניפולציה של חומרים מזינים בטווחי הניסוי.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח עבור יישומי תרבית תאים בקנה מידה גדול. כגון טיפולים תאיים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כלומר מתקנים, תרבית תאים בקנה מידה גדול עם פיזור אחיד של חומרים מזינים וגזים.
זה מאפשר צפיפות תאים גבוהה יותר מאשר תרביות תאים סטטיות או מוזנות בתפזורת, מגדיל את התשואה ומפחית את אובדן התאים. ניתן לעשות זאת באמצעות ציוד הנפוץ ברוב מעבדות תרביות התאים. הדגמה חזותית של שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים חדשים מכיוון שטכניקות אלה בהן נעשה שימוש יכולות להיות קשות לשליטה, בשל המספר הגדול של צעדים שיש לבצע בסדר מסוים בתנאים סטריליים.
אסוף את חמשת המרכיבים העיקריים הדרושים למערכת ההאכלה. מאגר בינוני, משאבה פריסטלטית, ביו-ריאקטור מעורבב, מאגר פסולת וסט דגימת צינורות בעיצוב אישי. הקימו את המאגר הבינוני באמצעות בקבוק זכוכית של ליטר אחד.
מאגר הפסולת באמצעות בקבוק זכוכית של שני ליטר. הביוריאקטור המעורבב באמצעות כור זכוכית בנפח 250 מ"ל. השתמש במשאבה פריסטלטית דיגיטלית, או משאבה דומה עם ראש משאבה בעל שמונה ערוצים כדי לשלוט בהחלפת המדיום.
הרכיבו את המאגר ואת מכסי הביוריאקטור ששונו מפלסטיק קשיח וניתן לחיטוי. עם יציאות מעבר צינור נירוסטה כדי לספק אוורור דרך מסננים סטריליים, ולאפשר העברה בינונית בין מאגרים וביו-ריאקטורים. חבר צינור יציאה המיוצר מצינורות אוורור זכוכית נקבובית למכסה הביוריאקטור המתלה המעורבב שונה.
הרכיבו ערכות צינורות זלוף הניתנות לחיטוי ממחברי צינורות פלואוריד פוליווינילידן, וצינורות משאבה פריסטלטיים עמידים. אורך הקטע תלוי במרחק בין הרכיבים השונים. הרכיבו את קו ההזנה באמצעות שני קוטר צינורות.
השתמש ב-L/S 14 עבור הצינור הראשי שישתרע על פני המרחק מהביו-ריאקטור למאגר הבינוני. הכנס אורך מיון של צינורות L/S 13 באמצע אורך הצינור עבור קטע המשאבה, באמצעות מתאמי PVDF המתאימים. השתמש במתאמי צינורות דוקרניים סטנדרטיים של PVDF כדי לחבר שתי חתיכות של צינורות L/S 14 משני צידי צינור קטע המשאבה הקצר יותר.
הרכיבו את קטע צינורות החתך לפינוי פסולת באמצעות צינורות L/S 16 בקוטר גדול יותר, והכנסו קטע קצר של צינורות L/S 14 באמצע לקטע השאיבה. זה נעשה באותו אופן כמו מכלול קו ההזנה באמצעות מתאמי צינור PVDF. הרכיבו את הרכיב הסופי של ערכת הצינורות על ידי בניית הסט משלושה אורכי צינורות קצרים L/S 14.
מחובר יחד עם מחבר HVDF מסוג T, ושני מהדקי צינור קטנים בשניים מאורכי הצינורות. חבר את מכלול הדגימה למחבר דגימת הנירוסטה המחובר על מכסה הביוריאקטור. לאחר העיקור יחובר מסנן גז סטרילי לאוורור גז לאחד האורכים המהודקים.
השני משמש לחיבור למזרק דגימה סטרילי. חיטוי מכלול הדגימה כשהוא מחובר לביו-ריאקטור, לפני תחילת הניסוי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש במכלול זה כדי לאסוף דגימות סטריליות מהביו-ריאקטור לפי הצורך, מבלי להפריע לתהליך ההזנה הרציף.
חבר פתחי אוורור סטריליים למקומות המתאימים על מכסי בקבוק הספינר, הכלי הבינוני, כלי הפסולת ויציאות הדגימה. תרבית וקצור את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אפשרו לתאים לדגור בטמפרטורת החדר בטריפסין במשך שתיים-שלוש דקות בארון בטיחות ביולוגית, ולאחר מכן אספו אותם לתוך צינור חרוטי.
לאחר מכן נאספת דגימת תא קטנה ומוכתמת בכחול טריפאן. ספרו את צפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ והמוציטומטר סטנדרטי עם צביעה כחולה טריפאן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את המספר הרצוי של סך התאים לביו-ריאקטורים מתלים סטריליים עבור כל מצב.
הוסף את המדיום לביו-ריאקטור ההשעיה המעורבב באמצעות פיפטה כדי להגיע לנפח התרבית הכולל הרצוי. העבר את הביוריאקטור המתלה המעורבב עם תאים לצלחת ערבוב בתוך חממת תרבית תאים. תאי תרבית בביו-ריאקטורים ללא הזנה במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, 100% לחות יחסית וקצב ערבוב של 70 סל"ד כדי לאפשר לספרואידים להיווצר.
לאחר היווצרות ספרואיד הסר את הביוריאקטור המתלה המעורבב מהחממה. הרכיבו את הרכיבים למערכת ההזנה הרציפה בארון בטיחות ביולוגי. ראשית מלאו מאגר בינוני טרי במדיום התרבות הרצוי ואז התחברו לצד אחד של קו ההזנה.
כמו כן, ודא שהמאגר הבינוני הטרי מאוורר כראוי עם מסנן סטרילי. יש להחליף מסנן סטרילי ביציאת כניסת הביוריאקטור כדי לסנן את המדיום לפני שהוא נכנס לביו-ריאקטור. חבר את קו הפסולת למאגר הפסולת הבינונית וודא שמאגר הפסולת מאוורר כראוי עם מסנן סטרילי.
הנח את הביוריאקטור המתלה המעורבב על צלחת הערבוב שבתוך החממה תוך שימוש באותם פרמטרים של תרבית כמו להיווצרות ספרואידים. הכניסו את המאגר הבינוני הטרי למקרר מיני סמוך. ודא שקווי ההזנה מסוגלים לצאת מהמקרר מבלי למנוע את סגירת הדלתות.
זה גם קריטי שקווי ההזנה לא ייסגרו על ידי דלתות המקרר או החממה. ניתן להניח את מאגר הפסולת הבינוני על הספסל מחוץ לחממה במיקום נוח. העבירו את קצוות הצינורות הנותרים לתוך החממה וחברו את קו ההזנה למסנן ביציאת הכניסה של הביוריאקטור.
לאחר מכן חבר את קו הפסולת ליציאת צינור היציאה. לאחר מכן, הנח את קטע המשאבה של קווי ההזנה והפסולת לתוך ראש המשאבה, תוך הקפדה על הכיוון הנכון כך שקווי ההזנה ישאבו מדיום ממאגר המדיום הטרי לתוך הביוריאקטור המתלה המעורבב, וקווי הפסולת ישאבו מדיום מהביו-ריאקטור, ולמאגר מדיום הפסולת. חשב את קצב ההזנה באמצעות משוואת קצב ההזנה המותאם כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
השתמש בדגימה העדכנית ביותר עם מידע על ספירת תאים, יחד עם חיזוי קצב הגדילה ומדידות הגלוקוז הבינוניות כדי להעריך את קצב ההזנה הדרוש לשמירה על ריכוז הגלוקוז הרצוי בתרבית. הגדר את מהירות המשאבה על סמך קצב ההזנה המחושב. חזור על חישוב קצב ההזנה והתאם את מהירות המשאבה עבור כל נקודת דגימה.
מדידות גלוקוז בינוניות מוצגות מתרביות ספרואידים אינסולינומה בטא-TC6 באמצעות ביו-ריאקטורים סטטיים מעורבבים, ושיטות תרבית ביו-ריאקטור מעורבב במזל מעורבב. האכלה עם מדיום גלוקוז גבוה סטנדרטי. ההזנה הרציפה מסוגלת לבטל את תנודות הגלוקוז, אך רמות הגלוקוז הממוצעות במדיום משתנות באופן דרמטי במהלך תקופת התרבית, והן הרבה מעל הטווח הפיזיולוגי.
ההזנה המותאמת מסוגלת לבטל את התנודות, כמו גם לשמור על ריכוזי הגלוקוז ליד רמות פיזיולוגיות למשך תקופת התרבות. כאן גידול תאים המדווח כשינוי קיפול במספר התאים במהלך תקופת התרבית של 21 יום מושווה לביו-ריאקטורים מעורבבים עם שינויים בינוניים קבועים, קצב הזנה קבוע תרביות ביו-ריאקטור מעורבב וקצב הזנה מותאם. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תנאים משתנים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו דרישות תזונה לקווי תאים חדשים, או תוצאות ניסוי ספציפיות.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הדרישות המטבוליות בתאים מבני אדם עם סרטן או הפרעות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב מערכת תרבית תאי שפע כדי לשלוט טוב יותר בתנאי התרבות ולמקסם את תפוקת התאים. אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הגנה מפני פתוגנים הנישאים בדם בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן ויסות רכיבים תזונתיים בספרואידים של תאי יונקים באמצעות הזנה מותאמת לצמיחה רציפה. הוא מדגים שיעורי צמיחה משופרים בהשוואה להזנה לסירוגין במנות בביוראקטורים של תרחיף בערבול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- תרבית תאים
- ביוטכנולוגיה
- תרפיות תאיות
רקע
- תנאי תזונה מבוקרים חיוניים לתרבית של מספרים גדולים של תאים.
- ניתן להשתמש בציוד מעבדה קונבנציונלי לתהליכים אלו.
- אלגוריתמים מקלים על בקרת התזונה ומניפולציה בתוך טווחים ניסיוניים.
- שיטה זו נותנת מענה לשאלות מפתח ביישומים של תרביות תאים בקנה מידה גדול.
מטרת המחקר
- לשיפור קצבי הצמיחה של ספרואידים של תאי יונקים.
- לביסוס שיטות לתרביות עם הזנה בקצב מותאם.
- לשיפור ההפצה האחידה של חומרי הזנה וגזים בתרביות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת הזנה מותאמת לצמיחה רציפה.
- ביוראקטורים של תרחיף מעורבב לתרבית תאים.
- אלגוריתמים למניפולציה של חומרי תזונה.
- השוואה לשיטות הזנה במנות לסירוגין.
תוצאות עיקריות
- הזנה רציפה שיפרה את קצבי הצמיחה של ספרואידים של תאים.
- הושגה התפלגות אחידה של רכיבי תזונה.
- השיטות הדגימו היתכנות ליישומים בקנה מידה גדול.
- הודגשו יתרונות פוטנציאליים עבור תרפיות תאיים אנושיות.
מסקנות
- הזנה מותאמת לצמיחה רציפה עדיפה על הזנה במנות.
- טכניקה זו יכולה לסייע בתרבית תאים בקנה מידה גדול.
- מחקרים נוספים עשויים לשפר יישומים בטיפולים תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תנודתיות ברמות הנוטריאנטים בתרביות של תאי יונקים בקנה מידה גדול עלולה להגביל את ההתרחבות ולהפחית את עקביות היבול, דבר המציב אתגרים בייצור טיפולי. מערכות הזנה רציפות השומרות על רמות גלוקוז פיזיולוגיות משפרות את קצבי הגדילה ותומכות בייצור ספרואידים הניתן לשחזור ובקנה מידה רחב. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתוצאות יבול התאים עבור פיתוח טיפולי בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני צמיחה תלויי-חומרי הזנה במודלים של ספרואידים של יונקים.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בהתרחבות תאים על ידי ביטול תנודות ברמות הגלוקוז במהלך התרבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק סביבת תרבית סטנדרטית לבדיקה עקבית של תרכובות במערכי בדיקה מבוססי ספרואידים.
- ערך תפעולי: תומך בחזרתיות של הבדיקה באמצעות פיזור אחיד של חומרי הזנה וגזים בין החזרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רמות תזונה פיזיולוגיות לאורך תקופות תרבית ממושכות, ובכך תומך בתנאים דמויי-פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר הגדלה (scale-up) של ייצור ספרואידים באמצעות ציוד ביו-רئاקטור קונבנציונלי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת בתהליך הגילוי על ידי מאפשרת ייצור אמין של ספרואידים ליישומים המשכיים בתיקוף מטרות ובסריקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אספקת תנאי תרבית יציבים לניתוח מסלולים תלוי-חומרים מזינים.
- סריקה: משפרת את המוכנות של הבדיקה באמצעות קינטיקת צמיחה ויצירה עקבית של ספרואידים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של צפיפות תאים ושיעורי צמיחה באמצעות ספירה מבוססת המוציטומטר.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על רמות גלוקוז פיזיולוגיות הרלוונטיות לתנאי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: משתמשת בציוד סטנדרטי לתרבית תאים, מה שמאפשר התאמה למספר פרויקטים וסוגי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בחיזוי תבואת התאים על ידי שמירה על רמות רכיבי תזונה יציבות.
- ערך תפעולי: מגביר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת השחזור של ייצור ספרואידים באמצעות ציוד מעבדה נגיש.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון של מנות (batches) בתהליכי תרבית תאים, ובכך תומך בהקצאה יעילה של משאבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מבוססת נתונים להמשך או הפסקה של התהליך (go/no-go) על בסיס מדדי התרחבות אמינים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקה סטרילית ובהרכבת ביו-ראקטור תחת תנאי בטיחות ביולוגית.
- דורש משאבות פריסטלטיות, מאגרי זכוכית וצינורות תואמי-ביולוגיה להחלפת מצע רציפה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של דגימה ומדידת גלוקוז לצורך התאמת קצב ההזנה.
- כולל כיול של קצבי הזנה בהסתמך על ספירת תאים ונתוני צריכת חומרי הזנה.
- מוגבל בשל הצורך בניטור תכוף למניעת חסימות בקוים או זיהומים.
